PESl蛋白与雄激素受体的相互作用及定位

目的：研究PES1蛋白与雄激素受体（An）之间的相互作用。方法：利用免疫共沉淀实验检测PES1蛋白与AR之间的相互作用,并进行相互作用定位;利用Western印迹研究PESl对乳腺癌细胞内AR表达水平的影响。结果：免疫共沉淀实验显示PES1蛋白与AR存在相互作用;PES1蛋白的1—110、111-220、221-320和311-588氨基酸残基（aa）区域均能与AR结合,415～588aa不能结合AR;AR的651-918aa区域与PESl结合。PESl不能调节乳腺癌细胞AR的表达水平。结论：PES1多个区域均能与AR相互作用,并且主要结合在AR的转录激活结构域2,为进一步探讨PES1对AR功能的调节奠定了基础。     

PES1与雌激素受体存在相互作用

雌激素(E2)和雌激素受体(ER)在E2诱发的肿瘤中起着极其重要的作用.ER共调节因子通过与ER相互作用调节其生物学功能.PES1主要表达于E2的重要靶器官如乳腺、卵巢等组织中,并在乳腺癌细胞中高表达.用PCR技术构建HA标签的PES1全长以及1～322aa、312 ～588aa和414～588aa三个不同功能区片段的重组质粒.将不同的重组质粒与FLAG-ERα和或FLAGC-ERβ共转染293T细胞后进行免疫共沉淀,以验证PES1与ER是否有相互作用以及相互作用的区域.用含雌激素受体作用元件的荧光素酶报告基因( ERE-LUC)检测PES1对ERα和ERβ转录激活活性的影响.结果表明,PES1与ERα和ERβ均相互作用,且PES1的1～ 322aa区域与ERα和ERβ相结合.PES1能特异地、E2非依赖性抑制ERβ的转录激活活性.实验结果显示,PES1是一个新的ER共调节因子,需要进一步研究其在ERβ信号通路及其在E2诱发的肿瘤的作用.     

人酪蛋白激酶1激酶区真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建带Flag标签的酪蛋白激酶1α(CK1α)激酶区截短突变体CK1α(1-285aa)的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶区与已知相互作用蛋白Myc-Cdc25A之间的相互作用。方法:用PCR技术从人全长CK1α真核表达载体中扩增CK1α(1-285aa),将其克隆到Flag载体中,将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达情况,免疫共沉淀分别检测Flag-CK1α全长、Flag-CK1α(1-285aa)与Myc-Cdc25A的相互作用。结果:双酶切和基因测序鉴定显示Flag-CK1α(1-285aa)真核表达载体克隆构建成功;Western印迹结果表明Flag-CK1α(1-285aa)转染人胚肾细胞293T细胞后获得表达;免疫共沉淀结果显示Flag-CK1α全长、Flag-CK1α(1-285aa)与Myc-Cdc25A在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论:构建了Flag-CK1α(1-285aa)的真核表达载体,为进一步探讨Flag-CK1α激酶区对细胞信号通路的调节作用奠定了实验基础。     

SOX4能与p53蛋白发生相互作用

目的：研究SOX4和p53蛋白之间的相互作用。方法：应用GSTpull-down、免疫共沉淀实验验证相互作用。结果：GSTpulldown实验证实SOX4能结合GST-p53融合蛋白,但不能结合GST蛋白;免疫共沉淀实验也证明,SOX4与p53能在细胞内发生相互作用。结论：SOX4能与p53发生相互作用,为p53信号通路的研究提供了新的线索。     

微管相关蛋白tau与朊蛋白的相互作用

微管相关蛋白tau参与了许多神经退行性疾病的发生, 其中包括一些人类可传播性海绵状脑病. 为了探讨tau与朊蛋白(PrP)之间可能存在的关系, 首先通过GST pull-down和免疫共沉淀等技术发现重组tau蛋白可通过微管结合区与来源于正常叙利亚仓鼠脑组织中的正常细胞膜朊蛋白(PrP^C)和羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织的异常朊蛋白(PrPSc)相结合. 利用免疫共沉淀实验发现在正常和羊瘙痒因子感染的仓鼠脑组织中存在tau蛋白与PrPC和PrPSc的相互作用, 并且利用激光共聚焦方法检测到PrP和tau蛋白在CHO细胞内具有共定位的关系. 为了确定PrP与tau蛋白相互作用的部位, 构建了不同区域的PrP片段, 从而证明PrP与tau蛋白相互作用的区域位于PrP的N端序列(23~91 aa). PrP与tau蛋白分子间相互作用的直接实验证据提示tau蛋白可能参与PrP的正常生理功能以及朊病毒病的病理过程.     

应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白

前S1蛋白（PreS1）在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用．为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GST）融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离. 结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75)．通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用．实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究．     

乳腺癌细胞中HuR调控PDFC的分子机制研究

目的:探讨乳腺癌细胞中HuR调控PDGFC的分子机制。方法:通过软件预测分析,乳腺癌细胞中PDGFC 3'UTR的HuR结合位点;在RNA免疫共沉淀实验中,加入PDGFC刺激后检测HuR与PDGFC mRNA的相互作用;通过构建PDGFC 3'UTR五个截短体,荧光素酶报告基因实验检测HuR调控PDGFC的结合位点。结果:软件预测分析发现,PDGFC 3'UTR可能存在五个HuR结合位点;RNA免疫共沉淀实验中,当加入PDGFC刺激后,HuR与PDGFC mRNA出现免疫共沉淀,证明HuR和PDGFC之间的直接相互作用;PDGFC mRNA3'UTR报告基因系统检测显示,第2个和第4个位点可与HuR结合调控PDGFC。结论:本研究揭示了乳腺癌细胞中HuR通过与PDGFC mRNA 3'UTR结合调控PDGFC的分子机制,为乳腺癌的临床诊断和治疗提供了新的思路。     

荧光双分子互补分析Ezrin与L-periaxin的互作模式

腓骨肌萎缩症4F亚型是Periaxin基因的突变所导致一种脱髓鞘型遗传病. Periaxin蛋白是外周神经系统中特异且大量表达的蛋白,在髓鞘成熟与维护中发挥重要作用.而Ezrin是一种膜骨架连接蛋白,在细胞形态的维持、运动、黏附等方面发挥重要作用.在前期已证实L-periaxin与Ezrin间存在蛋白互作的基础上,本文通过分子荧光互补实验,结合免疫荧光定位实验、免疫共沉淀等技术,进一步分析并揭示了L-periaxin蛋白与Ezrin蛋白之间的互作方式,具体为L-periaxin(1 200 aa)与Ezrin(1 296 aa)以及L-periaxin (1 060～1 461 aa)与Ezrin(475～585 aa)以“头对头”与“尾对尾”的方式发生相互作用.Ezrin可能是一种引导L-periaxin在施万细胞膜上堆积的新的分子配体,二者可能通过蛋白分子间更加紧密的方式完成在细胞膜处的堆积,参与到髓鞘的维护中.     

A型流感病毒PB1-F2蛋白与MOAP-1的相互作用

【目的】探讨A型流感病毒PB1-F2蛋白和人类凋亡调节因子1(MOAP-1)之间的相互作用。【方法】构建pACT2-MOAP-1重组质粒,与pGBKT7-PB1-F2质粒共转化酵母AH109,检测转化菌在四缺培养基的生长情况及β半乳糖苷酶报告基因的活性;利用GST pull-down和免疫共沉淀(Co-IP)技术进一步验证PB1-F2与宿主细胞蛋白MOAP-1的相互作用;通过过表达PB1-F2和MOAP-1,检测PB1-F2对MOAP-1蛋白表达水平的影响。【结果】酵母双杂交结果表明,PB1-F2和MOAP-1可以在酵母细胞内特异性结合。GST pull-down和Co-IP实验也进一步证实了这两种蛋白的相互作用,而且PB1-F2可上调外源MOAP-1的蛋白水平。【结论】流感病毒PB1-F2与MOAP-1存在相互作用,PB1-F2可能通过与MOAP-1的相互作用参与调控细胞生长及凋亡过程。     

SIAH1介导TRB3的泛素化和降解

目的利用酵母回转实验和免疫共沉淀实验验证SIAHI和TRB3之间的相互作用并探讨其功能相关性。方法将全长形式的TRB3基因和SIAH1基因分别克隆入酵母表达载体pDBLeu和pPC86中,共转化至MaV203酵母感受态细胞,验证其相互作用,然后分别构建至真核表达载体pCMV—Myc和pFLAG—CMV-2中,采用免疫共沉淀实验进行进一步验证。通过体内泛素化实验检测SIAH1对TRB3蛋白稳定性及泛素化修饰的影响。结果通过在酵母细胞中的回转实验和HEK293rr细胞中的免疫共沉淀实验证实了TRB3与SIAH1之间的相互作用。通过体内泛素化实验证实了S1AH1介导了TRB3的泛素化修饰和降解。结论证实了TRB3与SIAH1之间的相互作用并发现SIAH1介导了TRB3的泛素化修饰和降解,为TRB3蛋白的功能研究提供了新的线索。     

SARS-CoV N蛋白与人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E的交叉反应表位及特异表位的确定

为确定SARS-CoV N蛋白的特异抗原表位,对3种人冠状病毒SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白之间的交叉免疫反应进行了系统研究。构建了分别表达SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白的重组痘苗病毒,并制备了相应的小鼠免疫血清。用间接免疫荧光方法,检测了3种N蛋白的表达及其与3种冠状病毒免疫动物血清和SARS病人恢复期血清之间的反应。与此同时,用Western blot方法分析了原核表达的39个不同区段的SARS-CoV N蛋白与3种冠状病毒动物免疫血清和SARS病人恢复期血清之间的交叉反应性。免疫荧光检测结果表明,SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E3种病毒的N蛋白在重组痘苗病毒感染的HeLa细胞中均可以特异表达;3种N蛋白之间存在明显交叉免疫反应。Western blot结果显示,SARS-CoV N蛋白的表位主要位于30~60aa、170~184aa、301~320aa和360~422aa;与HCoV-OC43的交叉反应表位主要位于30~60aa、90~120aa、204~214aa和320~360aa;与HCoV-229E的交叉反应表位主要位于30~60aa、150~160aa和301~360aa。含SARS-CoV N蛋白特异表位的重组肽N155b(60~214aa)和N185(30~214aa)只与SARS病人恢复期血清和灭活SARS-CoV免疫小鼠的血清反应,而不与灭活HCoV-OC43和HCoV-229E免疫的山羊血清产生交叉反应。上述结果为使用SARS-CoV N蛋白抗原进行特异诊断试剂的研究,提供了重要的实验依据。     

CCCTC-结合因子与输入蛋白13存在蛋白间相互作用

目的:研究CCCTC-结合因子(CTCF)是否与输入蛋白13(IPO13)存在相互作用。方法:采用GST pull-down及免疫共沉淀实验研究二者的相互作用。结果与结论:实验表明CTCF与IPO13之间存在相互作用     

HepG2细胞中与戊型肝炎病毒衣壳蛋白相互作用蛋白的初步研究

利用重组戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白片段p239(368~606 aa)形成的类病毒颗粒作为亲和层析诱饵蛋白,HepG2为细胞模型,筛选与p239类病毒颗粒特异性相互作用蛋白。经过二维电泳分离,MALDI-TOF-MS分析鉴定得到GRP78/Bip,HSP90,alpha-tubulin及P43四个与p239有相互作用的候选蛋白。GRP78/Bip为热休克蛋白家族成员,体外免疫共沉淀实验结果证实,其与p239有特异性的结合。此研究结果为深入研究HEV的感染过程如吸附、入胞,以及HEV的致病机理提供了有益线索。     

TRAF1的表达及其与TRAF2结合的改变与不同乳腺癌细胞系转移潜能的关系

目的肿瘤坏死因子受体相关因子1（Tumor necrosis factor receptor-associated factor1,TRAF1）在乳腺癌中的表达及作用尚不清楚。本研究探讨TRAF1的表达水平及其与TRAF2结合量的改变与乳腺癌不同转移潜能的相关性。方法利用免疫细胞化学和western blot的方法检测在具有不同转移潜能的人乳腺癌细胞系中TRAF1表达水平;通过免疫共沉淀的方法检测在上述细胞系中TRAF1与TRAF2结合的改变。结果TRAF1在高转移潜能乳腺癌细胞系中的表达高于正常及中/低转移的乳腺癌细胞系（P〈0.05）;TRAF1与TRAF2的结合量在高转移潜能乳腺癌细胞系中低于正常及低转移的乳腺癌细胞系（P〈0.05）。结论随着乳腺癌转移潜能的增高,TRAF1总蛋白表达水平递增,而与TRAF2结合的TRAF1蛋白量递减;提示TRAF1可能通过减少与TRAF2结合而减弱对TRAF2的抑制作用,从而促进乳腺癌的浸润与转移。     

帕金森病相关蛋白PINK1和α-突触核蛋白相互作用研究

目的 利用蛋白质组学方法和激光扫描共聚焦显微镜来鉴定帕金森病相关蛋白PINK1和α-突触核蛋白（α-synuclein）之间的相互作用关系及两种蛋白在MN9D细胞中的分布。方法 将α-synuclein基因插入pGEX-4T-1载体,经DNA测序证明形成GST融合蛋白,经大肠杆菌BL-2l表达纯化后,与MN9D细胞裂解液共孵育,检测PINK1与α-synuclein蛋白间的相互作用。并应用MN9D细胞的内源性PINK1与α-synuclein进行免疫共沉淀实验,进一步验证两蛋白之间的相互作用。MN9D细胞经免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的细胞内分布及共定位状态。结果 利用GST-α-synuclein融合蛋白捕获及免疫共沉淀技术,检测到特异的PINK1条带。激光扫描共聚焦显微镜检测到两者存在部分共定位。结论 PINK1和α-synuclein在体外和细胞内均可发生相互作用并在MN9D细胞中存在共定位关系。     

载脂蛋白ApoE的原核表达以及与PrP蛋白间相互作用的初步研究

利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中扩增出载脂蛋白ApoE基因,并在pET32a载体中表达融合蛋白His-ApoE,以纯化的融合蛋白免疫实验用兔获得特异性抗体,利用ELISA及免疫共沉淀方法对ApoE及PrP之间的相互作用进行研究.结果表明,SDS-PAGE显示表达的His-ApoE蛋白的相对分子量约为54 000,所制备的抗血清ELISA效价可达到1∶406 900,并能够有效地识别重组及动物组织中的内源性ApoE蛋白.ELISA和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的ApoE可与全长的PrP蛋白（PrP23-231）在体外发生相互作用,其作用位点可能位于PrP蛋白的N端.这些结果为TSE经血传播的机制研究提供了新思路.     

风疹病毒结构蛋白多免疫显性区域诊断抗原的制备及其诊断效能评价

对串联风疹病毒 (Rubella virus,RV) 3个结构蛋白6个免疫显性区域进行制备 (命名为B103),并将其应用于血清学诊断中。选取RV C aa 1–30 & aa 96–123、E2 aa 31–105和E1 aa 11–39 & aa 154–277 & aa 389–412等6个免疫显性区域,将其串联并基因合成;将此基因片段插入TRX和His标签之间构建表达质粒;蛋白B103在大肠杆菌BL21(DE3) 中诱导表达,并利用Streamline Chelating亲和层析和DEAE阴离子交换层析纯化目的蛋白,Sephadex G-25分子筛分析其折叠情况及均一性;利用免疫印迹技术对蛋白B103的抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体捕获法ELISA检测技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。蛋白B103以可溶性形式表达,其表达量约占菌体总蛋白的18.57%,经纯化后蛋白B103浓度为3.026 mg/mL,纯度为95.35%;免疫印迹实验表明蛋白B103能与RV急性期血清发生反应;对40份RV急性期血清及40份RV阴性血清进行检测发现可以很好地鉴别阴阳性血清标本;其灵敏度为92.50%,特异性为95.00%,阳性预测值为94.87%,阴性预测值为92.68%,符合率为93.75%,McNemer检验的结果提示与“金标准”诊断结果无差异,kappa=0.900,提示两种方法诊断结果一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性优异的RV血清学诊断抗原,可以应用于RV早期诊断中。     

帕金森病相关蛋白Parkin 与PINK1的相互作用研究

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常见的神经系统变性疾病．分子遗传学研究发现,突变的Parkin蛋白及PINK1蛋白均参与了帕金森病的致病过程,但二者之间是否存在相互作用以及是否能够相互调节仍不十分清楚．为明确生理状态下Parkin蛋白与PINK1蛋白之间的相互作用,首先运用蛋白体外结合实验(GST pull-down)技术及免疫共沉淀技术证实了Parkin与PINK1在体外及体内均可相互结合．进一步构建PINK1的不同截短型,运用GST pull-down技术验证了PINK1与Parkin相互结合的区段为PINK1的蛋白激酶结构域．免疫细胞化学实验也证实Parkin与PINK1蛋白在细胞中存在共定位．进一步运用免疫共沉淀技术证实Parkin可减少PINK1通过泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)的降解,从而稳定PINK1．PINK1可增加Parkin通过UPS的降解,从而减少Parkin的水平,降低其稳定性．这些结果提示,帕金森病相关蛋白Parkin与PINK1能够直接结合,二者通过泛素蛋白酶体降解系统相互调节,可能协同作用参与了帕金森病的致病过程．     

拟南芥AtMSI1蛋白与组蛋白去乙酰化酶AtHDA6的相互作用分析

表观遗传修饰是真核生物基因转录调控的重要方式,在拟南芥生长发育过程中起着重要的作用。其中,PRC2(Poly-comb Repressive Complex 2)蛋白复合体和组蛋白脱乙酰化酶HDAC均为重要的表观遗传调控蛋白。本研究利用酵母双杂交系统证明了拟南芥PRC2蛋白复合体成员中的AtMSI1(Multi-Copy Suppressor of IRA1)蛋白和组蛋白脱乙酰化酶AtHDA6(Histone Deacetylase 6)蛋白间的相互作用,且确定其作用位点为AtMSI1蛋白的N端(1~114 aa)和C端(404~424 aa)的非特异性位点与AtHDA6蛋白的HD保守结构域(27~332 aa)和N端非保守的结构域(1~26 aa)。本研究构建AtMSI1-YC和AtHDA6-YN融合蛋白表达载体,共同转化拟南芥原生质体,用双分子荧光互补(BiFC)技术验证了AtMSI1-YC和AtHDA6-YN蛋白间的相互作用,并明确该相互作用的位点为细胞核。另外,pull-down试验再次证明了该相互作用的存在,原核表达并纯化的AtMSI1-GST融合蛋白可以与AtHDA6-His重组蛋白发生体外结合。综上所述,拟南芥AtMSI1与AtHDA6蛋白间存在相互作用,且每个蛋白中均有2个特异性结合位点参与该相互作用。     

磷酸丝氨酸氨基转移酶1介导肺腺癌细胞粘附及其机制探究

摘要 目的：探究丝氨酸生物合成途径（SSP）关键酶磷酸丝氨酸氨基转移酶1（PSAT1）与肺腺癌细胞粘附的关系，并初步探讨其作用机制。方法：使用siRNA抑制PSAT1蛋白表达，观察肺腺癌细胞形态以及粘附变化，同时过表达PSAT1，反向观察PSAT1对肺腺癌细胞粘附的影响。初步探究其作用机制，采用免疫共沉淀-蛋白质谱法寻找与PSAT1直接相互作用的蛋白，筛选差异蛋白，并在过表达细胞体系中验证。结合临床公共数据库分析互作蛋白与患者预后关系。结果：发现敲低PSAT1引起肺腺癌细胞形态改变；敲低PSAT1抑制肺腺癌PC9、HCC827细胞粘附；过表达PSAT1增强PC9及HCC827细胞粘附；免疫共沉淀-蛋白质谱检测到2560个可能与PSAT1结合的蛋白，进一步通过免疫共沉淀-免疫印迹法验证PSAT1过表达使细胞中与间皮素（MSLN）结合显著上升；通过临床样本数据观察PSAT1与MSLN共同高表达的肺腺癌患者，其预后更差。结论：本文首次报道PSAT1可能通过与MSLN等蛋白-蛋白相互作用影响肺腺癌细胞粘附的新机制，提示PSAT1有望成为潜在抗肿瘤靶点，靶向其相互作用蛋白能为小分子抑制剂设计及患者个体化治疗提供新思路。