重组酶Exo、Beta和Gam在大肠杆菌中的表达与纯化

目的:构建exo、beta和gam基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、制备重组酶Exo、Beta和Gam。方法:将exo、beta和gam基因分别构建在原核表达载体pEGKG和pET28a上,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获得可溶性表达蛋白,用柱层析方法纯化蛋白。结果:构建了原核表达质粒pET28a-exo、pET28a-beta、pET28a-gam和pEGKG-exo、pEGKG-beta、pEGKG-gam;SDS-PAGE结果表明重组酶融合蛋白His-Exo、GST-Exo、His-Beta、GST-Beta、His-Gam、GST-Gam得到可溶性表达;用His标签抗体和GST标签抗体通过Western印迹方法检测到纯化后的融合蛋白。结论:在大肠杆菌中诱导表达了λ噬菌体重组酶,并纯化获得了一定量的纯度较好的蛋白,为下一步制备检测用多克隆抗体奠定了基础。     

小鼠附睾分泌的防御素Defb48的原核表达及纯化

目的:获取小鼠附睾分泌的防御素Defb48的基因并原核表达、纯化,为研究其功能奠定基础。方法:提取小鼠附睾组织的总RNA,用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的Defb48编码序列,将2段Defb48编码序列串联克隆至原核表达载体pET28(a)中,经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白;用镍柱进行重组蛋白的纯化,然后进行SDS-PAGE和Western印迹分析鉴定。结果:获得实验所需小鼠附睾分泌的防御素Defb48的基因序列,测序结果与已发表的基因序列一致;在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达了His-Defb48融合蛋白,经Western印迹分析,在相对分子质量18 000处有特异的蛋白条带,镍柱纯化后获得纯度较好的融合蛋白。结论:克隆了小鼠附睾分泌的防御素Defb48基因,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达纯化出融合蛋白,为制备其多克隆抗体,进而进一步研究Defb48的功能奠定了基础。     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达

目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达人vasorin(VASN)蛋白。方法:利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61×103的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论:获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为其功能研究奠定基础。方法：用PCR方法从弗氏2a志贺氏菌2457T株染色体中扩增YciD蛋白编码序列,经过纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,构建重组载体pET32a-yciD,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western Blot检测融合蛋白的表达。结果：构建了YciD蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的YciD蛋白;Western Blot表明,此蛋白可与His标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

人源TNFα的原核表达及活性测定

目的:利用SUMO标签构建人TNFα原核表达载体,通过表达及纯化获得重组蛋白,为深入研究和利用人TNFα奠定基础。方法:利用PCR技术,从质粒pET32a-hTNFα中扩增出人TNFα成熟肽编码序列,并在其上游添加SUMO标签,与原核表达载体pET28a连接,构建表达质粒pET28a-SUMO-hTNFα。在BL21(DE3)工程菌中表达融合蛋白,经Ni-NTA纯化体系纯化,切除SUMO标签,纯化获得hTNFα成熟蛋白。CCK-8法检测TNFα对L929细胞的细胞毒性,以测定TNFα的生物学活性。结果:成功构建pET28a-SUMO-hTNFα原核表达质粒,酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在BL21(DE3)工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得hTNFα成熟肽。CCK-8法检测得所制备的TNFα蛋白ED50约为12.8μg/ml。结论:成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-hTNFα,经表达、纯化、酶切及再纯化,获得有生物活性的hTNFα蛋白,为深入研究和利用hTNFα奠定基础。     

重组大肠杆菌BL21(pET28a-eIF5A)的抗逆性分析

目的:分析重组大肠杆菌BL21(pET28a-eIF5A)的抗逆性。方法:将来源于柽柳的eIF5A基因构建到原核表达载体pET28a中,在原核表达的基础上,利用分光光度计检测重组大肠杆菌BL21(pET28a-eIF5A)的抗逆性。结果:BL21(pET28a-eIF5A)的抗盐碱性明显高于对照菌株BL21(pET28a),其中重组大肠杆菌BL21(pET28a-eIF5A)的抗NaCl的临界浓度为0.8mol/L,抗NaHCO3的临界浓度为0.52mol/L,不具有抗AgNO3和抗旱性。结论:重组大肠杆菌BL21(pET28a-eIF5A)具有良好的抗NaCl和NaHCO3特性,该抗性的证明为eIF5A基因在植物抗逆基因工程中的应用提供了资料。     

棉花GhVHA A基因的原核表达及其重组大肠杆菌的抗逆性分析

为进一步验证棉花GhVHA-A基因的功能,该研究将棉花GhVHA-A基因构建到原核表达载体pET28a上,利用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,同时对重组大肠杆菌BL21(pET28a-GhVHA-A)进行抗逆性分析。结果表明:(1)半定量RT-PCR分析发现,棉花幼苗液泡膜H+-ATPase基因(GhVHA-A)表达水平受脱水和高盐胁迫诱导。(2)将1 872bp长的编码区序列连接至原核表达载体pET28a上,成功构建了原核表达载体pET28a-GhVHA-A;SDS-PAGE电泳检测结果表明,在70kD左右处有1条特异表达的蛋白质条带,与预期的目的产物大小一致。(3)重组菌BL21(pET28a-GhVHA-A)的抗逆性分析发现,重组菌对PEG6000(20%)和NaCl(0.5mol/L)的抗性明显高于对照菌株BL21(pET28a),表明GhVHA-A基因在大肠杆菌中表达后能够增强菌株的抗性。本研究结果为GhVHA-A基因在植物抗逆基因工程中的应用提供了理论依据。     

蓖麻和线虫的两种不同结构脂肪酸去饱和酶的原核表达

目的:通过在原核表达系统中表达蓖麻的可溶性脂肪酸去饱和酶基因和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶基因,为脂肪酸去饱和酶序列结构与功能的研究奠定基础。方法:将蓖麻RCD△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶基因亚克隆到大肠杆菌BL21表达载体pET32a+中,获得重组表达载体pET32a+-R9,pET32a+- F1,并通过SDS-PAGE和Western Blotting鉴定蛋白的表达情况。结果:经PCR和测序鉴定,证实两个重组质粒含有目的基因片段;SDS-PAGE和Western Blotting证实两种蛋白在大肠杆菌中获得表达,但表达量具有明显的不同;Anthepro软件对蛋白跨膜结构的分析,验证蓖麻△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶在结构上的不同。结论:蓖麻的RCD脂肪酸去饱和酶和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶都得到了表达,但线虫fat-1脂肪酸去饱和酶表达量偏低;这可能与fat-1脂肪酸去饱和酶是一类跨膜蛋白的性质直接相关。因此,对于线虫fat-1脂肪酸去饱和酶的基于蛋白纯化的结构分析有待进一步的研究。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化

目的:构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法:用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到ftsE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果:构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0.1 mmol/L IPTG诱导3 h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论:实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

小鼠Nanog基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

按照nanog基因编码序列设计合成引物,利用RT-PCB从小鼠的囊胚期胚胎中扩增得到该 基因,并将该基因克隆到pET-28b(+)载体上,获得pET-28b(+)-nanog原核表达重组质粒,限制 性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆 菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达,western杂交证实该 蛋白具有6-His抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

猪尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

本研究报道了猪尿酸氧化酶(Porcine urate oxidase,pUOX)的原核表达载体的构建、pUOX的蛋白表达条件的优化以及对pUOX经纯化后进行活性检测和酶学性质分析。利用RT-PCR从猪肝总RNA中克隆pUOX,定向插入原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET30a(+)/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。重组质粒pET30a(+)/pUOX经双酶切鉴定和序列分析,证实已成功构建了重组表达载体。重组表达菌经IPTG诱导表达了约为41kD的蛋白,与预期分子量一致,并对pUOX蛋白表达条件进行了优化,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞中,包涵体经过变性、复性后,用Ni2+-NTA对复性蛋白进行亲和纯化,并对纯化蛋白进行了活性检测和酶学性质分析,纯化的重组pUOX的比活为50.63IU/mg,并发现重组蛋白在最佳温度、热稳定性等方面与天然pUOX相同,为后续动物实验奠定重要的基础。     

小鼠精囊自身抗原的原核表达和纯化

目的：在原核细胞中表达小鼠精囊自身抗原（SVA）,并对表达产物进行鉴定和纯化。方法：提取小鼠附睾组织总RNA,RT-PCR获得SVA的cDNA,设计并合成特异引物序列,进一步扩增出不含信号肽的SVA编码序列,连入原核表达载体pET28a中,经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达,Western印迹分析表达产物His-SVA,采用Ni-NTA纯化融合蛋白His-SVA。结果：原核表达获得融合6个组氨酸的SVA,用抗His单克隆抗体进行Western印迹鉴定,检测到相对分子质量约18×10^3的目的蛋白,与理论值一致;经Ni-NTA纯化获得较高纯度的His-SVA融合蛋白。结论：获得了在大肠杆菌中表达的小鼠附睾蛋白SVA,为后续研究其对小鼠生殖的影响奠定了基础。     

Pfu酶原核的高效表达及其活性分析

目的:在大肠杆菌中高效表达重组Pfu酶.方法:将pfu基因构建于载体pET28a上,重组质粒pET28a-pfu转化DH5α,获得了含pET28a-pfu重组表达菌株.在重组菌株OD600为0.2时,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达10～12 h后,菌体超声波破壁后,80℃条件下热变性30 min去除部分杂蛋白;粗酶液再经Ni离子亲和层析进一步纯化.结果:获得了高纯度的重组Pfu酶,利用该酶成功扩增出目的基因片段.结论:纯化的Pfu酶具有较高的活性,比活性为62 500 U/mg,该研究表达的重组酶完全可以替代商用Pfu酶.     

大肠杆菌O157:H7的sRNA伴侣蛋白Ufq的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的sRNA伴侣蛋白Hfq.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出基因hfq,并插入含6xHis标签序列的原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点中,构建重组表达质粒pET28a(+)-hfq,以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)...     

猪链球菌2型溶血素基因与38KDa蛋白基因克隆及联合表达

目的:研究有效的猪链球菌病疫苗。方法:以四川株猪链球菌2型基因组DNA为模板分别扩增溶血素基因和38KDa基因主要功能区基因;并经连接、克隆及酶切鉴定。分别构建原核表达载体pET32a-Sly、pET32a-38KDa,提取阳性克隆质粒分别进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片断,将目的片断定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为60Ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western-blotting)证实该重组蛋白可以与SS2阳性血清发生特异性反应。结论:本研究为重组蛋白的免疫保护应用奠定基础。     

小鼠β-防御素30的原核表达和纯化

目的:在原核细胞中表达小鼠β-防御素30(DEFB30),并对表达产物进行鉴定和纯化。方法:用RT-PCR方法扩增小鼠Defb30的cDNA序列,将2个拷贝的cDNA序列串联连入原核表达载体pET28(a),构建重组表达载体pET28(a)-Defb30,并将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,以Western印迹分析表达产物His-DEFB30,用Ni-NTA亲和柱纯化融合蛋白。结果:构建了Defb30基因的原核表达载体,经IPTG诱导,相对分子质量约15×103的融合蛋白获得表达,Western印迹分析证实此蛋白即为目的蛋白,经Ni-NTA柱亲和纯化,获得了高纯度的融合蛋白His-DEFB30。结论:获得了在大肠杆菌中表达的DEFB30,为研究该蛋白的免疫避孕效果、抗菌活性奠定了基础。     

人三叶因子1大肠杆菌及毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的:构建人三叶因子1(hTFF1)的大肠杆菌及毕赤酵母表达载体。方法:从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF1 cDNA,用PCR方法扩增hTFF1基因,并将其分别克隆到大肠杆菌的表达载体pET32α及毕赤酵母的表达载体pCAPZαA中,构建原核及真核重组表达质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1。结果:通过双酶切和基因序列分析确定插入pET32α和pGAPZαA中的片段为hTFF1基因片段。结论:重组质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1成功构建,为在比较原核和真核细胞中hTFF1高效表达的情况及下一步的功能研究奠定了基础。