牛樟芝中一个新型还原型聚酮合酶基因的克隆及表达分析

为了研究牛樟芝中PKS基因与化合物之间的关系,该研究通过对牛樟芝基因组分析获得牛樟芝聚酮合酶基因,以此序列为模板设计含有起始密码子和终止密码子的特异引物并以牛樟芝c DNA为模板克隆获得一个高度还原型PKS(HR-PKS)基因全长,命名为AcPKS2;对AcPKS2基因进行生物信息学分析,并比较该基因在不同培养基上的表达量。结果表明:AcPKS2全长7 842 bp,有24个内含子,其外显子共编码2 613个氨基酸,该蛋白的相对分子质量为293.5 kDa,理论等电点pI为5.78。用CDD分析其结构域显示,该基因属于HR-PKS,其结构域组织排列为KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-TE,8个结构域其活性位点分别为β-酮基合成酶(DTACSSSL)、酰基转移酶(GHSIGETA)、脱水酶(RNDGSTSPL)、甲基转移酶(SFDIITAFDV)、烯酰还原酶(HAGVSSPAA)、酮基还原酶(GSPGQANYTAA)、酰基转移酶(YGLDSLTSVRL)、硫酯酶(KQPNGPY)。系统发育树显示AcPKS2与其他化合物未知的HR-PKS蛋白聚为一支,结构域和系统进化树分析显示该基因可能编码一种新的含TE结构域高度还原型聚酮合酶;表达分析结果显示葡萄糖和果糖能够诱导该基因的表达。     

球孢白僵菌中聚酮合酶基因多样性分析

本研究利用基因挖掘技术从球孢白僵菌(Beauveria bassiana)基因组中获得聚酮合酶(PKS)基因,并对这些基因序列进行生物信息学分析预测其功能,同时检测这些基因在不同培养基培养条件下的表达情况。结果显示:球孢白僵菌中含有13个PKS(Bdass1~13)基因,结构域分析显示球孢白僵菌中有还原型PKS 8个,非还原型PKS 2个,杂合型NRPS/PKS 3个;聚类分析显示Bdass8参与卵孢白僵菌素生物合成,Bdass5可能参与洛伐他汀九酮体的生物合成、Bdass4可能参与伏马菌素的生物合成、Bdass11可能参与phenolthiocerol的生物合成;非还原型PKS中Bdass7和Bdass10可能参与分生孢子色素的合成,Bdass1、Bdass2、Bdass3、Bdass6、Bdass9、Bdass12、Bdass13分别与其他未知聚酮合酶形成独立的分支;不同的PKS基因在不同培养基培养条件下其表达情况差异非常显著,如Bdass8、Bdass10和Bdass11在5种培养基上均强烈表达,Bdass4、Bdass6在5种培养基上微弱表达,Bdass1、Bdass5、Bdass11、Bdass12、Bdass13仅在几种培养基上表达,Bdass2仅在INO培养上微弱表达,Bdass3、Bdass7在5种培养基上均不表达。该研究为球孢白僵菌中PKS基因的功能鉴定奠定基础。     

红汁乳菇中一个聚酮合酶基因的鉴定和表达分析

聚酮化合物具有丰富的生物活性,为了解红汁乳菇(Lactarius hatsudake)中聚酮合酶基因,从红汁乳菇基因组中分离并克隆得到LhPKS1基因,通过生物信息学分析推测其功能,并通过RT-PCR验证该基因的表达量。结果显示,LhPKS1基因全长cDNA含有6 036 bp,编码2 011个氨基酸残基,结构域顺序依次为SAT-KS-AT-PT-ACP-TE,该蛋白无跨膜结构和信号肽,聚类分析显示LhPKS1蛋白与参与生物合成苔色酸的真菌PKS蛋白聚为一支。在以10%肌醇、2%和10%的山梨醇为碳源添加物及以番茄浸粉为氮源添加物时,该基因表达量较高。研究有助于通过LhPKS1基因的过表达及异源表达,为大量获取苔色酸类化合物及其骨架提供参考。     

真菌聚酮合酶基因分离方法的研究进展

真菌聚酮合酶在代谢中可催化合成多种具有重要生物学活性的次级代谢物,所以真菌聚酮合酶正逐渐成为药学、食品科学和农学等领域的研究热点。本文综述了近五年来建立的几种分离真菌聚酮合酶基因的方法。这些方法解决了真菌中聚酮合酶基因簇难以分离的问题,为改造和利用真菌聚酮合酶以及发掘真菌聚酮化合物资源提供了强有力的手段。     

草菇聚酮合酶编码基因vv-alb的克隆及其表达的初步分析

聚酮化合物（polyketides）是一类庞大的次级代谢家族,聚酮合酶（polyketide synthase,PKS）是介导聚酮化合物生物合成的关键酶。通过巢氏简并PCR与染色体步行的方法,获得了草菇中的编码PKS的基因vv-alb的全长序列,并通过荧光实时定量RT-PCR方法对vv-alb基因在草菇不同生长阶段与不同部位的表达情况进行了初步分析,为进一步研究PKS在草菇和其他食用真菌生物代谢过程中的作用奠定了一定的基础。     

长松萝中一个聚酮合酶基因簇的克隆和鉴定

【目的】探索药用地衣长松萝(Usnea longissima Ach)聚酮化合物的生物合成基因簇,克隆聚酮合酶(PKS)基因并分析其功能。【方法】以长松萝地衣型真菌为材料,通过巢氏PCR获得聚酮合酶基因片段和原位杂交筛选基因组文库获得聚酮合酶基因及相邻基因簇。并对获得聚酮合酶进行分子系统进化分析和基因表达分析。【结果】获得药用地衣长松萝中的编码聚酮合酶基因UlPKS5的全长序列以及相邻修饰基因β-内酰胺酶和脱水酶。聚酮合酶UlPKS5含有酮体合成酶(KS),酰基转移酶(AT),产物模板(PT)以及酰基载体蛋白(ACP)结构域。分子系统进化分析显示UlPKS5属于非还原型聚酮合酶中第五组,与蒽醌类化合物生物合成相关。通过半定量RT-PCR分析表明山梨醇(10%)和蔗糖(2%和10%)能够强烈诱导UlPKS5基因表达。【结论】聚酮合酶(UlPKS5)及相邻修饰基因β-内酰胺酶和脱水酶与长松萝中蒽醌类化合物生物合成相关。     

一个巨大的多烯抗生素基因族中聚酮合酶（PKS）基因单元在大肠杆菌？…

根据序列分析信息,将链霉菌ＦＲ－００８中与多烯大一端人酯抗生素生物合成直接有关的ＰＫＳ基因族内长２６７１ｂｐ的一个ＰＫＳ单元以正确框架克隆于表达载体ＰＥＴ－１５ｂ中Ｐ５７启动了下游的ＢａｍＨＩ位点上,经ＩＰＴＧ诱只得到微量ＰＫＳ表达;     

红色红曲菌M7中色素聚酮合酶基因敲除突变体的鉴定

摘要:【目的】研究红色红曲菌(Monascus ruber) M7中控制红曲色素合成的聚酮合酶基因(pksPT)的功能。【方法】对M7 中pksPT进行了生物信息学分析;借助农杆菌介导的红曲菌转化技术敲除M7中pksPT,获得pksPT缺失突变体(ΔpksPT),比较M7和ΔpksPT菌落形态、产孢能力、生长速度、色素和桔霉素产量的差异。【结果】pksPT全长8687 bp,编码蛋白含有2690个氨基酸,属于非还原Ⅲ型聚酮合酶,包括β-酮酯酰基合成酶(KS)、酰基载体蛋白(ACP)、酰基转移酶(AT)和甲基转移酶(ME)四种结构域,组合形式为KS-AT-ACPACP-ME。ΔpksPT的分析结果显示,pksPT的敲除不影响其产分生孢子和闭囊壳的能力;ΔpksPT不能产生任何一种红曲色素;其生长速度明显快于野生菌株M7;桔霉素产量较M7 提高了2.8倍。【结论】pksPT是M7中控制红曲色素合成的关键基因,红曲色素的合成显著影响红曲菌产桔霉素能力和生长速度。     

利玛原甲藻中聚酮合酶基因克隆与分析

为探讨聚酮合酶 (polyketide synthase, PKS)基因与藻毒素合成的关系,揭示PKS基因在赤潮毒素合成中的作用,采用兼并引物,通过PCR技术获得利玛原甲藻(Prorocentrum lima)可能存在的I型PKS基因;并对所获得PKS基因的同源性进行了分析,构建了基于PKS氨基酸序列的系统进化树;采用RT-PCR技术分析了PKS基因在利玛原甲藻中的表达状况;并通过多聚腺苷酸RNA的扩增、细菌的分离鉴定、限制性内切酶酶切、Southern blotting等技术对PKS基因进行了分析.结果表明,利玛原甲藻中PKS基因与海洋原甲藻聚为一支,在利玛原甲藻中有显著表达;以Oligo(T)引物进行RT-PCR扩增时,可出现18S rRNA和PKS基因相应条带;限制性内切酶酶切和Southern blotting结果显示,该基因中存在明显的甲基化;16S rRNA基因序列分析显示,从利玛原甲藻培养液中分离到的细菌与海洋放线菌假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)基因序列同源性达到99%,该菌株中并不存在PKS基因.结果显示,所获得的PKS基因是利玛原甲藻聚酮合酶基因,基因序列已提交GenBank (EF521601);PKS可能在腹泻性贝毒合成中起着关键作用.     

何首乌中Ⅲ型聚酮合酶基因FmPKS2的原核表达及鉴定

目的：对传统中药何首乌中Ⅲ型聚酮合酶基因FmPKS2进行原核表达并鉴定重组蛋白酶活性,为研究该酶基因在何首乌有效成分代谢合成及其调控中的功能奠定基础。方法：根据何首乌FmPKS2（GenBank登录号：GQ984139）基因序列,通过PCR扩增其全长的编码区,克隆至原核表达载体PET-28a,构建重组质粒PET-FmPKS2,将其转化原核表达菌株E.coli BL21（DE3）,并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白可溶性,通过Ni-NTA亲和树脂纯化可溶性蛋白后以丙二酰-COA和香豆酰-COA为底物进行催化反应,TLC鉴定反应产物。结果：经过诱导,重组菌表达分子量为42KD左右的融合蛋白,其中可溶性重组蛋白最优表达条件为IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间6h,温度25℃。纯化后的可溶性重组蛋白催化丙二酰-COA和香豆酰-COA得到的产物经TLC鉴定为二苯乙烯类化合物白藜芦醇。结论：成功实现FmPKS2的原核表达且融合蛋白以可溶形式存在,催化反应证明FmPKS2融合蛋白具有二苯乙烯合酶的活性。     

Fonsecaea monophora聚酮合酶基因的CRISPR-Cas9敲除载体的构建

目的改造pFC332质粒,简化实验流程,构建Fonsecaea monophora PKS1基因的CRISPR-Cas9敲除载体。方法设计引物PCR扩增pFC334质粒上的gRNA骨架,获得已经插入AarⅠ酶切位点的gRNA骨架片段后,使用PstI和MerI酶线性化pFC334载体,构建pFC334-AarⅠ载体,使用MreⅠ和BglⅡ酶对其和pFC332质粒进行双酶切,连接后获得pFC332-gRNA-AarⅠ载体,设计gRNA,最后将各片段插入到载体中。结果测序得到16533bp大小的改造后的pFC332-gRNA-AarⅠ质粒,构建了PKS1基因的CRISPR-Cas9敲除载体,通过PCR,酶切以及测序的方法确定敲除载体构建成功。结论成功构建Fonsecaea monophora聚酮合酶基因的CRISPR-Cas9敲除载体,为研究PKS1基因及DHN-黑素在Fonsecaea monophora的生物学功能奠定了良好的基础。     

竹黄菌发酵天然色素及其结构的初步研究

对竹黄菌发酵天然色素的条件进行了研究,确定培养基的碳源、氮源、温度和装液量分别为:木糖、硝酸钠、28℃和60mL/250mL。通过利用化学试剂显色反应、紫外光谱(UV)和液质连用(LCMS)等手段初步确定该天然色素为蒽醌类化合物。     

安徽省三种产地竹黄菌培养的初步研究

首次对安徽省三种产地的竹黄菌进行了组织分离培养和液体发酵,比较了该菌固体生长状况和液体发酵形成的竹红菌素产量。结果显示,广德卢村的菌种平皿生长速度为0．31cm／d,液体发酵产生的竹红菌素吸光度为0．21;宁国板桥菌种平皿生长速度为0．30cm／d,液体发酵产生的竹红菌素吸光度为0．30;休宁武城的竹黄菌平皿生长速度为1．85cm／d,菌株液体发酵产生的竹红菌素吸光度为O．39。结论表明,休宁武城菌种无论是平皿生长速度还是发酵形成的竹红菌素量都明显优于其它两地的菌株。     

苯二酚内酯合成途径中的聚酮合酶组合表达研究

由真菌聚酮合酶合成的苯二酚内酯类次生代谢产物结构和功能多样,在医药和农业上具有广泛的用途。苯二酚内酯由一对还原型聚酮合酶和非还原型聚酮合酶协同生物催化合成。还原型聚酮合酶和非还原型聚酮合酶由多功能结构域组成,每个结构域在生物合成的过程中程序化地执行特定的功能。通过交换不同真菌苯二酚内酯合成途径中非还原型聚酮合酶的起始物酰基转移酶结构域,在酿酒酵母中与相应的还原型聚酮合酶组合表达,合成了“非天然”的苯二酚内酯聚酮产物,并初步讨论了起始物酰基转移酶结构域的识别规律。     

植物类型III聚酮合酶超家族基因结构、功能及代谢产物

植物聚酮类化合物主要包括酚类、芪类及类黄酮化合物等,在植物花色、防止紫外线伤害、预防病原菌、昆虫危害以及作为植物与环境互作信号分子方面行使着重要的生物学功能。该类化合物具有显著多样的生物学活性,对人体保健及疾病治疗有显著意义。植物类型III 聚酮化合物合酶 (PKS) 在该类化合物生物合成起始反应中行使着关键作用,决定该类化合物基本分子骨架建成和代谢途径碳硫走向,为合成途径关键酶和限速酶。以查尔酮合酶为原型酶的植物类型III PKS超家族是研究系统进化和蛋白结构与功能关系的模式分子家族,目前已经分离得到14种植物类型III PKS基因,这些同祖同源基因及其表达产物既有共性,也表现出许多独特个性,这些个性赋予此类次生代谢产物结构上的多样性。以下综述了植物类型III PKS超家族基因结构、功能及代谢产物研究进展。     

植物类型Ⅲ聚酮合酶超家族基因结构、功能及代谢产物

植物聚酮类化合物主要包括酚类、芪类及类黄酮化合物等,在植物花色、防止紫外线伤害、预防病原菌、昆虫危害以及作为植物与环境互作信号分子方面行使着重要的生物学功能。该类化合物具有显著多样的生物学活性,对人体保健及疾病治疗有显著意义。植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶(PKS)在该类化合物生物合成起始反应中行使着关键作用,决定该类化合物基本分子骨架建成和代谢途径碳硫走向,为合成途径关键酶和限速酶。以查尔酮合酶为原型酶的植物类型Ⅲ PKS超家族是研究系统进化和蛋白结构与功能关系的模式分子家族,目前已经分离得到14种植物类型Ⅲ PKS基因,这些同祖同源基因及其表达产物既有共性,也表现出许多独特个性,这些个性赋予此类次生代谢产物结构上的多样性。以下综述了植物类型Ⅲ PKS超家族基因结构、功能及代谢产物研究进展。     

安丝菌素聚酮合酶模块2中脱水酶结构域的生化功能

[目的]I型聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)模块中不同的修饰是聚酮类化合物结构多样性的重要原因之一.抗癌药物安丝菌素化学结构中C11-C14区域存在特殊的双键迁移结构,可能与聚酮合酶模块2或者3中脱水酶结构域(Dehydratase,DH)的催化密切相关,本研究通过探究聚酮合酶模块2中DH结构...     

聚酮合酶的催化机制及聚酮类化合物的组合生物合成

聚酮类化合物(polyketides,PKs)是一类来源广泛、数目庞大的天然产物。聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)负责催化PKs的生物合成,是具有模块化结构的多功能复合酶,由一系列对称或非对称的二聚体模块组成。模块按照其功能的不同,可分为加载模块、延伸模块、卸载模块。各个模块中含有多个催化域,不同的催化域在聚酮链延伸过程中扮演着不同角色。模块以首尾相连的方式排列,通过非结构多肽接头或离散的对接结构域彼此连接,形成装配线来生产PKs。PKSs按照结构域和催化机制的不同,可以分为合成大环内酯类抗生素的I型PKSs(由迭代化PKSs和模块化PKSs组成)、合成芳香族聚酮类化合物的II型PKSs(也被叫做迭代类PKSs)和合成类黄酮化合物的III型PKSs。利用组合生物合成方法,如对不同聚酮物质或同一物质的不同结构域或模块进行交换,以及特异性地插入、替代、缺失关键基因,或者通过点突变等操作,可以形成重组PKSs,进而改变聚酮类化合物的结构。选择不同的起始和延伸单元,引入不同类型的PKSs后修饰酶以及对PKSs后修饰酶基因进行改造等方法,均可用于合成非天然PKs。本文概述了3大类型聚酮合酶的结构、催化机制和组合生物合成近期研究进展,为今后合理设计产量高、效价高、化学性质稳定的新型聚酮类化合物提供参考依据。     

一个巨大的多烯抗生素基因簇中聚酮合酶(PKS)基因单元在大肠杆菌中的双重诱导超量表达

根据序列分析信息,将链霉菌FR－008中与多烯大环内酯抗生素生物合成直接有关的PKS基因簇内长2671bp的一个PKS单元以正确框架克隆于表达载体pET－15b中P（T7）启动子下游的BamHI位点上,经IPTG诱导只得到微量PKS表达。同样地克隆于pBV220中PRPL启动子下游的PKS基因在42℃诱导后也不能超量表达出PKS蛋白。然而克隆于串联启动子PRP（T7）或PRPLP（T7）下游的PKS基因却得到了超量表达。在PRPLP（T7）下游PKS基因的超量表达依赖于IPTG及42℃两个条件的双重诱导,而42℃及IPTG单独诱导只得到常量表达。而在PRP（T7）启动子下游时PKS基因在42℃、IPTG单独诱导或42℃＋IPTG双重诱导时均可获得超量表达。据此构建了启动子PR、P（T7）串联排列的表达载体pH2330。外源基因克隆于该载体起始密码子下游的多克隆位点时,表达的外源蛋白可用Ni（＋＋）"柱亲和纯化。此外,用在大肠杆菌中表达的PKS蛋白作为抗原免疫大白兔制备了特异性的抗体,Westernblotting实验证明该抗体是PKS特异性的,可用于PKS基因簇及PKS异源表达的深入研究。     

植物类型III聚酮合酶超家族晶体结构与功能

植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶(PKS)催化合成多种植物次生代谢产物的基本分子骨架,参与植物体许多重要生物学功能的行使,一直是研究蛋白结构与功能关系、基于结构进行分子改造的重要模式分子家族。目前在蛋白质数据库(PDB)中有超过80个不同种属来源的类型Ⅲ PKS的三维结构被报道,其中包括了研究最为透彻的查尔酮合酶在内的7种酶的晶体结构,这些结构的发表对于阐明该类酶复杂多变的底物专一性、链延伸和不同的环化反应机制奠定了结构基础。三维空间结构解析以及基于定点突变的结构功能分析是进行酶工程、基因工程的基础。以下系统综述了植物类型Ⅲ PKS超家族晶体结构和功能的研究进展。