溶藻弧菌耐药基因qnr的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)喹诺酮类耐药基因qnr并分析其蛋白结构,为研究该蛋白的生物学功能奠定基础。[方法]根据NCBI上公布的相关序列设计qnr基因特异性引物,利用PCR方法扩增基因序列,进行DNA测序及生物信息学分析。[结果]从溶藻弧菌染色体上获得qnr基因大小为651 bp,编码216个氨基酸,进化分析可知其与副溶血弧菌有很近的亲缘关系,二级结构分析含有五肽重复序列,三维结构与大肠杆菌质粒上的qnr蛋白空间结构极为相似。[结论]通过对蛋白质序列分析和结构预测,初步确定该基因为喹诺酮耐药基因,为水产细菌的耐药机制研究奠定基础。     

麦洼牦牛TF基因的克隆及蛋白质结构分析

[目的]探讨麦洼牦牛转铁蛋白(Transferrin,TF)的结构及生理功能。[方法]采用RT-PCR方法,从麦洼牦牛心脏克隆出TF基因,并运用多种生物信息学软件对其进行核苷酸序列及蛋白质结构分析。[结果]克隆得到的麦洼牦牛TF基因开放阅读框为780 bp,编码259个氨基酸,分子质量为28.33 k Da,理论等电点8.57,不含跨膜区域,存在信号肽序列,二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主,无β-折叠,同源建模预测出牦牛TF蛋白与猪血清转铁蛋白有相似的三级结构,同源性可达71.91%。[结论]成功克隆了麦洼牦牛TF基因并分析了其蛋白质结构,为进一步研究TF蛋白功能提供理论基础。     

沙眼衣原体LpxA基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)LpxA基因并分析其生物学特性。[方法]根据Ct LpxA基因序列设计特异性引物,利用PCR扩增LpxA基因,并把LpxA基因连接到p MD18-T载体,挑取阳性克隆进行PCR和DNA测序验证。最后使用生物信息学软件分析LpxA蛋白的生物学性质。[结果]从Ct基因组中PCR扩增得到840 bp的Ct LpxA基因,该基因共编码280个氨基酸。LpxA蛋白无信号肽,定位在细菌细胞质。二级结构预测得知α-螺旋占19.6%,延伸链占32.8%,β-转角为11.4%,无规卷曲为36%。三级结构预测得知3个相同的LpxA分子组成同源三聚体。预测得知LpxA蛋白有11个B细胞表位。[结论]克隆得到Ct LpxA基因,并预测了其结构和功能。     

人ARNTL基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆人ARNTL基因并分析其生物学特性。[方法]通过NCBI数据库中的人ARNTL基因设计引物,进行PCR扩增,将其连接在pGEX-4T-1载体上,然后通过双酶切及测序鉴定克隆的正确性,再使用在线软件分析预测人ARNTL的生物学特性。[结果]酶切结果显示人ARNTL基因开放阅读框为1 878 bp,编码625个氨基酸残基,分子量为68 690.67 Da, pI为6.40。ARNTL蛋白是主要位于细胞核中的亲水性蛋白,不含跨膜结构域,无信号肽,其二级结构由α螺旋、无规则卷曲和延伸链构成,并且三级结构与二级结构预测结果一致。[结论]成功克隆了人ARNTL基因,并对人ARNTL蛋白进行了生物信息学分析,为深入研究该蛋白的分子作用机理打下一定基础。     

利用抑制性消减杂交（SSH）技术研究不同毒力的鳗弧菌菌株的基因多样性

[目的和方法]鳗弧菌是一种嗜盐的革兰氏阴性细菌,也是鱼类弧菌病的主要病原.对斑马鱼的半数致死量研究结果表明,鳗弧菌菌株VIB72具有较高的毒力,而菌株CW1的毒力较低.本文利用抑制性消减杂交(SSH)技术对这两个菌株的遗传差异进行了研究.[结果]通过对差减文库筛选,分离到59个对菌株VIB72的阳性克隆,并对这些克隆的DNA序列进行了测定.17个基因片断与其它细菌的已知功能的基因有较高的同源性,其中包括可溶性溶胞壁质转糖基酶、转移蛋白MobA和MobC、转座子IS66、抑制相关蛋白(金属β-内酰胺酶和乙酰转移酶家族)、毒素蛋白(DT-201和alveicin A免疫蛋白)、与OLD家族相似的ATP依赖性核酸内切酶以及SocE和GTP结合蛋白HflX(有高频率的溶原化).这些基因片断有可能是鳗弧菌毒力岛的一部分.其他的基因片断与其它的已知基因没有明显的相关性.[结论]这些结果表明,SSH技术成功地鉴定了不同致病性的鳗弧菌菌株的基因差异及潜在的毒力基因.     

从江香猪TPM3基因的克隆与序列分析

[目的]对从江香猪TPM3基因进行扩增、克隆和序列分析。[方法]通过RT-PCR从猪背最长肌中扩增TPM3基因CDS区并进行克隆,利用DNAMAN和BioEdit等软件对克隆的序列进行分析。[结果]成功克隆了从江香猪TPM3基因并构建了pUCm-T-TPM3载体;获得了TPM3-1和TPM3-2两个序列,TPM3-1有两个碱基的差异,相似度达99.73%;TPM3-2有一个碱基的变化,同时插入了一段76 bp的片段,相似度达99.87%;密码子偏好性分析显示,UUG编码亮氨酸的频率为0.49%,而CUG编码亮氨酸的频率为2.89%,说明第49位碱基的转换可能提高蛋白的合成效率;RNA二级结构分析显示,碱基突变会影响TPM3基因RNA二级结构和最小自由能的变化;蛋白理化性质分析显示,氨基酸的改变对α螺旋、β折叠及转角等二级结构影响不明显。[结论]从江香猪TPM3基因的碱基突变可能影响原肌球蛋白的合成,为探究其对从江香猪肉质及种资源的开发利用提供试验依据。     

梅毒螺旋体蛋氨酸亚枫还原酶基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆梅毒螺旋体(Treponema pallidum)蛋氨酸亚枫还原酶(methionine sulfoxide reductase,Msr)基因并对其进行生物分信息学分析。[方法]根据梅毒螺旋体Msr基因序列,设计特异性引物,PCR法扩增目的基因,将其连接到p MD19-T载体,进行DNA测序及生物信息学分析。[结果]从梅毒螺旋体中扩增得到的大小为873 bp的Msr基因,编码291个氨基酸。Msr蛋白含有Msr A和Msr B的保守区,为亲水性蛋白,无信号肽,定位在细菌细胞质。三维结构与牛Msr蛋白(PDB:1fvg.1)类似。Msr蛋白含有几个B表位。[结论]克隆获得了Tp Msr基因,并分析了其生物学特性。     

人NR2F2基因的克隆及其生物信息学分析

[目的]克隆人NR2F2(Nuclear Receptor subfamily 2,group F,member 2)基因并分析其生物学特性。[方法]根据NCBI数据库提供的人NR2F2基因序列设计其特异性引物,通过PCR扩增目的基因,并将其连接到p ET-28a载体上,然后进行酶切鉴定与DNA测序来确定人NR2F2基因克隆的正确性,再利用生物信息学在线工具分析人NR2F2蛋白的生物学特性。[结果]酶切鉴定与DNA测序结果表明人NR2F2基因开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸残基,分子量为29 162.79 Da,p I为5.96。NR2F2蛋白是主要位于细胞质和细胞核中的亲水性蛋白,不含跨膜结构域,无信号肽,其二级结构由α螺旋、无规则卷曲和延伸链构成,并且三级结构与二级结构预测结果一致。[结论]克隆获得人NR2F2基因,其编码的蛋白质属于类固醇/甲状腺激素受体超家族,α螺旋和无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件。GO注释分析表明,人NR2F2属于转录因子,参与序列特异性DNA结合、基因转录、RNA的生物合成、RNA代谢等过程。     

葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆及序列分析

目的:从葡萄中克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并对其序列进行生物信息学分析.方法:利用葡萄总RNA为模板,采用RT - PCR技术克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并亚克隆进T- Vector.利用生物信息学工具对其核酸和蛋白序列进行分析.结果:测序结果显示其cDNA序列全长为1 257bp,含有一个1 179bp的开放阅读框.生物信息学分析表明葡萄白藜芦醇合酶基因编码392个氨基酸,分子量为42.9kDa,理论等电点为5.97,具有芪合酶家族固有的氨基酸保守结构域,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成.结论:该基因的克隆、生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础.     

海洋创伤弧菌反式翻译系统关键因子SmpB基因的克隆及原核表达

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种重要的"人鱼共患病"病原菌。通过克隆创伤弧菌反式翻译系统核心因子小蛋白B(Small molecular protein B,SmpB)基因,构建携带目的基因的原核表达质粒,为后续研究SmpB蛋白的互作网络、SmpB蛋白与创伤弧菌致病性之间的关系并以此开发新型的抑菌靶标奠定基础。使用LiCl沉淀法提取创伤弧菌基因组DNA,以它为模板,PCR扩增目的基因,并构建到pET-28a原核表达载体上测序鉴定后对SmpB序列进行生物信息学分析,将正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果表明使用LiCl沉淀法成功提取到高质量创伤弧菌基因组DNA,以其为模板,扩增到smpB基因,并成功构建pET-28a原核表达重组质粒,测序鉴定正确;smpB基因全长为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.41 kD,理论等电点为10.28,不稳定系数为35.02,总平均亲水性为-0.635,SmpB蛋白整体表现为稳定亲水性蛋白。生物信息学分析显示其高级结构核心部分为5个β折叠组成的桶状结构,外围由3个α螺旋组成,SmpB C-端亦为α螺旋。诱导表达的重组融合蛋白相对分子质量大小在25.0 kD附近,显示在E.coli中成功表达了SmpB蛋白。     

从江香猪λ1干扰素基因的克隆及序列分析

[目的]对从江香猪λ1干扰素(interferon-λ1,IFN-λ1)基因进行扩增、克隆和生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank登录的猪IFN-λ1基因序列(FJ455508)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从淋巴细胞中扩增IFN-λ1基因CDS区并进行克隆和生物信息分析。[结果]从江香猪IFN-λ1基因CDS全长576 bp,共编码191个氨基酸,其分子式为C949H1543N277O270S7,相对分子质量21.38 k Da;该蛋白等电点为9.42,为亲水性蛋白。从江香猪IFN-λ1含有丰富的二级结构,以α-螺旋(64.40%)和无规卷曲(25.65%)为主,蛋白质三级结构中主要以α-螺旋为主,同源性及系统进化树分析结果表明从江香猪与野猪IFN-λ1核苷酸同源性最高(为100%),亲缘关系最近。[结论]从江香猪IFN-λ1基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其抗病毒功能奠定了基础。     

鸡importin β1基因的克隆及生物信息学分析

[目的]对鸡importin β1基因进行克隆和生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank公布的鸡importin β1基因序列(XM_015299473)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从DF-1细胞中扩增importin β1基因CDS区并进行克隆和测序,利用生物信息学工具对其理化性质、二级结构和系统进化树进行分析。[结果]鸡importin β1基因CDS全长2 268bp,共编码755个氨基酸,该蛋白等电点为4.61,相对分子质量84.15 k Da,分子式为C3712H5901N979O1152S46。蛋白质二级结构预测显示,鸡importin β1蛋白含有丰富的二级结构,以α-螺旋为主(占64.90%)。importin β1基因同源性及系统进化树分析结果表明鸡与鹌鹑的亲缘关系最近。[结论]鸡importin β1基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础。     

尾叶桉GLU4无性系F5H基因的克隆表达及序列分析

[目的]克隆尾叶桉(Eucalyptus urophylla)GLU4中F5H基因全长,并对其进行序列和表达模式分析。[方法]根据NCBI公布的F5H基因保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4茎部组织为试验材料克隆其g DNA和c DNA片段,利用荧光定量PCR分析其在植株不同组织中的表达模式。[结果]该基因g DNA长2 358 bp,c DNA长1 610 bp,含有2个外显子、1个内含子。开放阅读框编码529个氨基酸,Eu F5H编码的蛋白为一个带负电荷、存在跨膜结构、定位在内质网起始分泌途径中的蛋白质,二级结构包含典型的的α-螺旋和β-折叠,根据三级结构推测其可能具有羟化酶活性。Eu F5H蛋白与蓝桉亲缘关系较近,Eu F5H在不同组织中表达水平差异显著,其中半木质化茎中表达水平相对最高。[结论]成功获得了尾叶桉GLU4木质素合成酶基因F5H的全长序列。     

人精氨酸酶Ⅰ基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆人精氨酸酶Ⅰ(human-ARGⅠ)基因并分析其生物学特性。[方法]根据NCBI数据库提供的人精氨酸酶Ⅰ基因序列设计其特异性引物,利用PCR扩增目的基因,并将其连接到p CMV-MYC载体上并利用生物信息学工具分析人精氨酸酶Ⅰ蛋白的生物学特性。[结果]酶切鉴定与DNA测序结果显示人精氨酸酶Ⅰ基因全长969bp,编码322个氨基酸残基;人精氨酸酶Ⅰ蛋白属于精氨酸酶——组蛋白去乙酰化酶超家族,是位于细胞质中的稳定亲水性蛋白,无信号肽,不含跨膜结构域,其二级结构由无规则卷曲,α-螺旋和延伸链构成,并且三级结构与二级结构预测结果高度一致,建模结果准确可靠。[结论]人精氨酸酶Ⅰ基因全长969 bp,编码322个氨基酸残基,分子量为34 734. 94,p I 6. 72,其氨基酸序列中无信号肽,无跨膜结构域,是非分泌型及亲水性蛋白,是属于精氨酸酶-组蛋白去乙酰化酶超家族,无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件,并且三级结构与二级结构预测结果高度一致,建模结果准确可靠。     

植物乳杆菌LY-78乳酸氧化酶基因克隆与生物信息学分析

[目的]对植物乳杆菌LY-78乳酸氧化酶基因(lox)进行克隆及生物学信息学分析。[方法]PCR克隆lox基因,测序后采用多种生物学信息软件预测该基因对应蛋白的理化性质和结构特征。[结果]植物乳杆菌LY-78的乳酸氧化酶基因全长1 101 bp,编码366个氨基酸,其蛋白分子量38 730.1 Da,p I 5.58,亲水性非分泌蛋白。该蛋白氨基酸序列系统进化树分析表明,该基因序列保守性较高,可以反映近缘物种的亲缘关系;具有保守的α-羟基酸脱氢酶结合结构域。[结论]为揭示植物乳杆菌LY-78乳酸氧化酶的生理功能及在苯乳酸代谢机理中的作用提供了理论依据。     

金川牦牛HIF-3A克隆及生物信息学分析

[目的]克隆金川牦牛低氧诱导因子-3A(HIF-3A)并进行生物信息学的分析。[方法]采用PCR方法从金川牦牛血液中克隆出HIF-3A,通过生物学软件Protparam、SOPMA、ProtScale、NetPhos、SignaIP、TMHMM、PSORTⅡ、Protfun2.2对核酸序列以及蛋白进行分析。[结果]金川牦牛HIF-3A长度为513 bp、ORF为441 bp、一共编码氨基酸146个,相对分子质量为15 729.19 Da,和普通牛的CDS区有8个碱基不同,突变了5个氨基酸,预测无跨膜区域,不存在信号肽序列,主要位于细胞质与线粒体中,有β-转角和α-螺旋。在同源性比较中与牛的同源性达到了97.5%,与其他物种同源性较低。[结论]成功克隆出金川牦牛的HIF-3A基因,且不同属的物种间不具有较高的保守性,为非分泌蛋白。     

昆虫病原菌(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因CHI克隆及生物信息学分析

本研究旨在对昆虫病原菌玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因CHI进行克隆、测序及相关生物信息学分析.序列分析结果显示:IfCHI基因编码区全长为1152bp,编码383个氨基酸,理论等电点(pI)D为9.72,属不稳定水溶性蛋白,其二级结构为混合型,蛋白质溶剂可及性主要分为三类,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成,同源序列分析及多重序列比对分析存在明显的差异.该昆虫病原菌玫烟色棒束孢IfCHI编码基因的成功克隆及生物信息学分析,为进一步研究病原菌CHI基因的遗传特性和表达机制以及为寻找更多的查尔酮类化合物提供了理论基础.     

藏药黑紫獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因克隆及生物信息学分析

[目的]对藏药黑紫獐牙菜香叶醇-10羟化酶(geraniol 10-hydroxylase,G10H)基因分子克隆和生物信息学分析。[方法]采用PCR方法扩增并克隆了藏药黑紫獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因,再用DNAMAN、Mega等生物软件以及TMHMM Server.v.2.0、Prot Scale等在线软件对该基因进行了生物信息学分析。[结果]所得G10H基因总长为1 488 bp,编码495个氨基酸(Gen Bank accession KR709239),无信号肽,部分跨膜,蛋白质二级结构主要以α螺旋(22个)、β折叠(8个)为主,黑紫獐牙菜G10H与9个物种氨基酸序列具有高度的同源性。[结论]该酶N端无信号肽,为非分泌蛋白。G10H酶要实现其功能,在核苷酸和氨基酸水平上必须具有相当的保守性。     

玉米大斑病菌钙调磷酸酶B亚基基因的克隆与生物信息学分析

[目的]克隆玉米大斑病菌CnB基因,并进行初步的生物信息学分析.[方法]采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,扩增玉米大斑病菌CnB基因全长cDNA序列和DNA序列.运用相关生物信息学软件对该基因序列进行分析和预测其编码蛋白的结构功能.[结果]CnB基因含4个外显子和3个内含子,最大开放阅读框为525 bp(GenBank登录号EF 469732),编码174个氨基酸;预测蛋白含约59.77%的α螺旋,8.62%的β转角,6.32%的延伸串,25.29%的不规则卷曲;含有高度保守的4个"EF-hand"Ca2 结合区域,属于Ca2 结合蛋白家族成员,与小麦叶枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、灰葡萄孢(B.cinerea)、粗糙麦孢霉(Neurospora crassa)等病原真菌中CnB基因有90%以上的氨基酸同源性.[结论]首次在玉米大斑病菌中克隆得到CnB基因,为进一步研究该基因功能奠定基础.