禾谷炭疽菌磷酸二酯酶生物信息学分析

[目的]磷酸二酯酶(Pde)作为G蛋白信号传导途径上的效应酶,发挥着重要作用。该酶已在粟酒裂殖酵母菌、稻瘟病菌等中有相关报道。通过对禾谷炭疽菌中Pde生物信息学分析,以期为深入开展该蛋白定位、功能研究等方面研究,以及实现以控制病原菌G蛋白信号途径功能新的药物靶标的开发提供有力的理论支撑。[方法]基于酿酒酵母中已经报道的典型Pde序列,利用Blastp以及关键词对禾谷炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,并通过SMART保守结构域分析、理化性质、疏水性、细胞信号肽、跨膜区结构、亚细胞定位以及二级结构等生物信息学分析,此外,通过对禾谷炭疽菌中的典型Pde与其他物种中的同源序列进行遗传关系比较分析。[结果]明确禾谷炭疽菌中存在2个Pde,上述Pde均含有最低比例的色氨酸,均属于亲水性蛋白,均不含有信号肽以及均定位于细胞质等特征。[结论]通过对比,发现禾谷炭疽菌、酿酒酵母中的Pde具有诸多相同性质,提示不同真菌之间存在的保守性。     

全基因组预测希金斯炭疽菌的候选效应分子

[目的]希金斯炭疽菌可以侵染十字花科诸多植物引起炭疽病,给各国农业生产造成了巨大经济损失。对该菌候选效应分子进行预测,并对其特征进行明确。[方法]利用Signal P、Prot Comp等程序对该菌中分泌蛋白进行找寻,并对分泌蛋白所具有的氨基酸大小、信号肽长度以及理化性质等进行分析。结合已经报道的真菌效应分子具有的典型特征,明确该菌存在的候选效应分子数量及特征。[结果]希金斯炭疽菌含有658个分泌蛋白,氨基酸长度集中于50~300 aa之间;信号肽长度以17~21个aa的序列最为集中;信号肽切割位点属于A-X-A类型;分泌蛋白在分子量、等电点、不稳定系数等方面均存在差异,但大多数分泌蛋白属于亲水性蛋白。其中,预测功能的蛋白为290个,其功能较多的集中于酶类,包括脂肪酶、α-L-鼠李糖苷酶、果胶酯酶等。依据候选效应分子典型特征,明确该菌中含有388个候选效应分子。[结论]通过上述生物信息学分析方法,结合真菌效应分子典型特征,有效地实现了希金斯炭疽菌候选效应分子的预测,其信号肽切割位点类型与其他已经报道的致病疫霉、粗糙脉孢霉等分泌蛋白信号肽切割位点一致,分泌蛋白功能涉及较多的酶类,也与其他已经报道的病菌分泌蛋白功能相类似。     

希金斯炭疽菌RGS蛋白生物信息学分析

目的:由希金斯炭疽菌侵染菜心、萝卜等十字花科蔬菜引起的炭疽病,不仅降低了蔬菜的产量,还影响着蔬菜的品质。RGS作为植物病原菌G蛋白信号转导过程中的重要调节因子,在众多生理生化过程中发挥着重要作用。对希金斯炭疽菌中典型RGS进行明确以及生物信息学分析,为深入开展该菌RGS功能研究打下坚实的理论基础。方法:基于酿酒酵母中4个典型RGS序列,利用Blastp以及关键词对希金斯炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,以及通过SMART保守结构域分析,获得典型的RGS,并对上述RGS进行二级结构、疏水性、信号肽以及亚细胞定位等生物信息学分析。结果:希金斯炭疽菌中的RGS在蛋白质二级结构中均含有较高比例的α螺旋结构,均不含有典型的信号肽序列,均为亲水性蛋白;其中3个定位在细胞核中,其他2个则分别定位于高尔基体、线粒体上。结论:希金斯炭疽菌中有5个典型的RGS,在二级结构特征、亲水性方面一致,但其亚细胞定位位置不同。     

禾谷炭疽菌磷脂酰肌醇转移蛋白生物信息学分析

目的:禾谷炭疽菌侵染玉米、小麦等农作物引起的炭疽病,给各国农业生产造成了巨大经济损失。植物病原菌在对植物侵染、定殖、扩展等致病过程中,细胞信号转导起着重要的作用。磷脂酰肌醇转移蛋白(PITP)参与众多生理生化过程,并在细胞信号转导过程中发挥重要作用。本研究为深入开展禾谷炭疽菌PITP的功能研究打下坚实的理论基础,同时,也为进一步开展其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。方法:基于酿酒酵母中已经报道的5个典型PITP序列,对炭疽菌属蛋白质数据库进行Blastp比对以及关键词搜索,并通过SMART保守结构域分析。结果:明确禾谷炭疽菌存在3个典型的PITP,同时,明确上述蛋白疏水性、细胞信号肽、跨膜区结构、亚细胞定位以及二级结构等情况。结论:与其他物种中9个同源序列进行遗传关系比较分析,该菌与希金斯炭疽菌亲缘关系较近。     

十字花科黑腐病菌III型效应物XopXccR1植物亚细胞定位

[目的] 植物病原细菌通过III型分泌系统（type III secretion system,T3SS）将III型效应物（type III secreted effectors,T3SEs）分泌转运到宿主细胞的不同位点上,进而行使不同的致病功能。本研究旨在确定Xcc 8004 III型效应物中分子量最大的蛋白XopXccR1在植物中的亚细胞定位。[方法] 利用生物信息学方法分析XopXccR1的跨膜信息。通过同源重组方法将XopXccR1全长、N端（1–1220 aa）和C端（1221–2030 aa）分别克隆到植物表达载体pCAMBIA-2300-35S：：EGFP上,利用根癌农杆菌介导的瞬时表达浸染本生烟,通过激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果。[结果] XopXccR1全长和N端定位在本生烟细胞膜上,而C端定位在细胞质中。[结论] XopXccR1的N端与C端可能分别存在定位信号,N端信号主导全长蛋白的最终定位。     

菜心炭疽病菌拮抗细菌的筛选及鉴定

从土壤中分离筛选获得2株对菜心炭疽病菌——希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)具有强烈抑制作用的芽孢杆菌菌株19E2、13A1。通过形态特征观察、生理生化特性测定, 结合16S rDNA序列同源性分析以及部分基因特异性序列分析, 将2株菌鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。抑菌试验的结果表明: 当19E2和13A1的培养液在PDA培养基中的浓度为10%时, 抑菌率分别达到75.62%和85.35%, 当培养液浓度升高到20%时, 可完全抑制菜心炭疽病菌生长。抗菌谱测定结果显示: 2株菌对辣椒炭疽菌(C. capsici)、胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)、灰霉 (Botrytis cinerea)、苞叶芋柱帚霉(Cylindrocladium spathiphylli)和尖镰孢(Fusarium oxysorum)等重要病原菌具有明显的作用效果。     

裂殖壶菌EST文库cdc2基因的筛选与分析

利用已建立的裂殖壹菌(Schizochytrium sp FJU-512)EST文库,通过序列比对分析发现p34cdc2相似基因的3′端序列,分离含该EST序列的质粒ROCHA2004,以T7引物进行反向测序,获得p34cdc2相似基因的全长序列,结合NCBI的ORF finder以及Blastx程序获得p34cdc2蛋白的氨基酸序列;利用同源模建方法构建了该蛋白的三维空间结构,并预测其功能结构域;对该蛋白进行系统发育分析,构建进化树,结果显示该蛋白同小麦(Triticum aestivum)的p34cdc2序列亲缘关系最近。     

禾谷炭疽菌RGS蛋白生物信息学分析

【目的】明确禾谷炭疽菌中存在的典型RGS,及其信号肽、跨膜区、二级结构特征,明确该菌RGS与其他病菌之间的关系,最终为深入开展RGS定位、功能研究打下坚实的理论基础,也为进一步开展其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。【方法】基于酿酒酵母中已经报道的4个典型RGS序列,利用BLASTp以及关键词对禾谷炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,以及通过SMART保守结构域分析。同时,通过对禾谷炭疽菌中典型RGS氨基酸序列进行细胞信号肽、跨膜区结构以及二级结构等生物信息学分析,此外,通过对禾谷炭疽菌中的典型RGS与其他物种中的同源序列进行遗传关系比较分析。【结果】明确禾谷炭疽菌存在6个典型的RGS,上述RGS在蛋白质二级结构中均含有较高比例的α螺旋结构,而在信号肽方面,除CgRGS6含有明显的信号肽序列外,其他RGS则没有;6个RGS中3个定位在细胞核中,其他则定位在质膜、内质网、线粒体上。【结论】禾谷炭疽菌中的RGS与C.higginsianum、C.gloeosporioides Cg-14/Nara gc5、C.orbiculare等炭疽菌属中的病菌具有较高的同源序列,以及较近的亲缘关系。     

土生空团菌(Cenococcum geophilum Fr.)18S rDNA中的I型内含子

【目的】分析土生空团菌[Cenococcum geophilum Fr.(Cg)]18S rDNA中Ⅰ型内含子的核苷酸序列和二级结构特征,探讨影响土生空团菌遗传多样性的因素。【方法】对23个Cg菌株18S rDNA的3’端进行PCR扩增,对其中14个菌株的扩增片段测序。利用MAGE version 4.0软件构建Neighbor-Joining系统发育树,利用Mfold预测内含子的二级结构。【结果】序列分析表明,19个中国菌株中14个在18S rDNA中有Ⅰ型内含子。结合GenBank中的相关数据,可知Cg菌株18S rDNA中内含子的序列长度为488-590 nt,显示出92.3%-100%的同源性。在其5’端序列比较保守,在3’端序列差异较大。二级结构分析表明Cg菌株18S rDNA中的内含子都有10个配对区(P1-P10),在P5区域由P5,P5a,P5b,P5c,P5d组成,在P9的3’端有2个配对区(P9.1、P9.2)。【结论】来源于不同寄主及地域的Cg菌株有丰富的遗传多样性,本文没发现地理因素和寄主来源对Cg的遗传分化有影响。     

大豆GmC4H基因的克隆及同源基因的生物信息学分析

本研究分别在大豆品种中豆27和九农20中克隆大豆肉桂酸-4-羟化酶基因(Glyma.20G114200),得到长度为1 797 bp的C4H基因c DNA序列。比对两者c DNA序列发现4个碱基差异位点。通过对二者氨基酸序列进行理化性质及结构与功能分析发现,C4H基因编码蛋白的5~24位氨基酸之间和32~55位氨基酸之间存在跨膜区域;C4H蛋白含有细胞色素P450结构域。大豆C4H基因的四个拷贝分别分布于第2、第10、第14和第20号染色体上,Glyma.20G114200与Glyma.10G275600的蛋白质同源性高,而另外两个同源基因Glyma.02G236500和Glyma.14G205200的蛋白质同源性高。结果表明,可能大豆4个C4H同源基因在进化过程中发生了功能的较大分化。     

人VASH_1蛋白结构和功能的生物信息学分析

[目的]对人VASH_1蛋白结构和功能进行生物信息学分析。[方法]利用生物信息学工具对人VASH_1蛋白的基因结构、跨膜区域、空间结构、理化性质和功能区进行预测。[结果]人VASH_1蛋白由365个氨基酸残基组成,该蛋白等电点9.50,相对分子质量40 956.5Da,分子式为C1805H2874N532O536S11。通过分析发现该蛋白为非跨膜的亲水蛋白,主要由无规卷曲构成。[结论]人VASH_1蛋白是由365个氨基酸残基组成的亲水蛋白,含有21个磷酸化位点和13个可能的抗原位点,与多种蛋白间存在相互作用。     

拟南芥类受体胞质激酶RBK2的生物信息学分析

[目的]对拟南芥类受体胞质激酶RBK2(ROP binding protein kinases 2)的结构、分子进化和基因表达等进行预测分析。[方法]利用生物信息学在线相关数据库和分析软件对目的蛋白的基本理化性质、二级及三级结构、同源性、基因表达、蛋白定位、相互作用蛋白进行分析预测。[结果]拟南芥类受体胞质激酶RBK2是一个亲水性不稳定蛋白,主要构成原件为α螺旋及β片状折叠,进化树构建及多序列比对显示其与琴叶拟南芥中名为激酶家族蛋白的蛋白进化距离最近。主要存在于细胞质和细胞核中,其编码基因在成熟花粉中强烈表达,且RBK2与PP2C家族蛋白有较强的相互作用。[结论]拟南芥RBK2很可能通过参与信号转导途径在植物种子萌发、花粉成熟及细胞分裂等方面发挥重要作用。     

大黄鱼QM-like(PcQM)蛋白生物信息学分析

[目的]通过分析PcQM蛋白质的结构,预测其高级结构和功能,为进一步研究PcQM蛋白提供理论依据。[方法]利用Blast P和相关分析蛋白质理化性质与结构的软件,对PcQM蛋白进行结构与功能预测分析。[结果]PcQM蛋白不存在N端信号肽,存在多个酶切位点,无跨膜结构,定位在细胞质中。不存在二硫键,该蛋白含26.05%α-螺旋结构(H),20.93%β-折叠结构(E),53.02%无规则卷曲(L)。最后,通过Swiss-Model程序预测了PcQM蛋白的三级结构。[结论]较全面地分析和预测了PcQM蛋白的理化性质、二级结构和三级结构等。为深入分析PcQM在大黄鱼(Larimichthys crocea)体内免疫调节功能研究,提供了理论依据。     

单核细胞增多性李氏杆菌野毒株InlB的分子特征及其表达和纯化研究

采用PCR技术扩增单核细胞增多性李氏杆菌TA野毒株内化素B(InlB)基因,进行编码分子的序列和结构分析,并克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中诱导表达。该基因全长1893bp,编码630个氨基酸,其中前35个氨基酸残基构成信号肽序列。在推导的InlB蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括1个α-螺旋的Cap结构域、6个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1个免疫球蛋白样结构域(IR)、1段B重复序列和3个串联的GW结构域,同时还存在5个潜在的N-联糖基化位点,Leu占所有氨基酸残基的10.2%。与GenBank已经报道的18个不同流行株InlB基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分别在91.1%~99.6%和92.3%~99.8%之间。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE和Western blot分析证实该基因已经正确表达。用Ni2 亲和层析柱纯化了InlB重组蛋白。     

苹果炭疽菌的分子鉴定与检测

测定苹果炭疽菌rDNA全序列,比对苹果炭疽菌和其它炭疽菌ITS序列以及构建系统关系树,发现苹果炭疽菌与胶孢炭疽菌的ITS序列相似性高达99．8％,并与胶孢炭疽菌聚在一起,可以明确苹果炭疽菌应属于胶孢炭疽菌。进一步的序列比对发现,苹果炭疽菌的18S rDNA3’端比其它胶孢炭疽菌多出一段379bp的序列,根据这一特有片段设计引物CgF1与通用引物ITS4配对,结果仅能从苹果炭疽菌中扩增出1232bp的特异性条带。用苹果炭疽菌接种离体苹果,以接种发病的病组织总DNA为模板,利用引物CgF1／ITS4进行PCR扩增,同样可以扩增出1232bp的特异性条带,而健康苹果组织DNA中未能扩增出任何条带,表明该方法可用于苹果炭疽菌的鉴定和快速检测。     

SARS-CoV-2非结构蛋白NSP14的生物信息学分析

目的:通过生物信息学手段预测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中非结构蛋白NSP14的性质特征。方法:以SARS-CoV-2的NSP14氨基酸序列为研究对象,通过Blastp与SARS-CoV的NSP14进行比对,并利用ProtParam、ProtScale、PredictProtein和SWISS-MODEL等生物信息学软件工具对NSP14的理化性质、结构和活性区域等进行预测。结果:SARS-CoV-2的NSP14由527个氨基酸残基构成,是一种可溶性亲水蛋白,与SARS-CoV中NSP14氨基酸序列的一致率达到95%。NSP14二级结构中无规则卷曲含量最高,该蛋白质包含了N-糖基化位点、cAMP或cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-豆蔻酰化位点等5个保守基序。NSP14同时具备N端核糖核酸外切酶和N7-甲基转移酶2个结构域,其活性区域的总面积和体积分别为1469.712?~2和1708.967?~3。结论:基于SARS-CoV-2中NSP14的氨基酸序列,运用生物信息学相关软件分析和预测了NSP14蛋白的性质和结构,为新型冠状病毒疫苗研制和药物筛选提供理论依据。     

橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)疏水蛋白Hydr基因的克隆与原核表达

为了研究Hydr在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)中的功能,本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌疏水蛋白Hydr基因,并利用原核表达系统对其进行表达.结果显示:Hydr基因DNA为520bp,cDNA为417 bp,编码139个氨基酸,包含2个内含子,在蛋白的N端含有由19个氨基酸组成...     

稻瘟菌糖蛋白激发子(CSBI)的纯化及其鉴定

稻瘟菌（Magnaporthe grisea）ZC1l3菌株97-151a菌丝经离心、超滤、Sephacryl S-100凝胶柱、DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析,纯化获得糖蛋白激发子CSBI。CSBI经SDS-PAGE后银染显示单一条带,糖,蛋白比例约为9．32。CSBI对非亲和性互作水稻叶片中过氧化物酶的诱导显著高于亲和性互作水稻（P〈0．05）。经N端氨基酸同源序列比对表明,CSBI与MG07877．4推测蛋白的同源性最高。经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定也表明CSBI是该推测蛋白。     

深海细菌Pseudomonas sp.IOFA1醇脱氢酶酶学性质研究

[目的]对来自印度洋深海的一株假单胞菌醇脱氢酶(Adh)进行序列分析和酶活性质分析。[方法]首先以同源比对和进化树聚类为手段分析该酶序列信息。其次,在E.coli宿主中进行重组表达和镍柱亲和纯化后,对重组醇脱氢酶的酶活性质进行进一步地研究。[结果]结果显示Adh蛋白与其它物种已知醇脱氢酶的氨基酸序列最高相似性为81%,分属于第三类醇脱氢酶蛋白。酶学性质分析表明,重组酶Adh的最适作用温度为42℃,表现出良好的中低温适应性;最适p H值为5.0,在p H 4~6时具有较高的活性,表明Adh为酸性醇脱氢酶。Zn~(~(2+))、Na+在终浓度为0.5 mmol/L时对Adh有明显的激活作用,尤其是Zn~(2+)可使Adh的酶活显著提高11%。[结论]实现了adh基因在大肠杆菌的高效表达,为Adh的应用提供了理论依据。