DNA分子结构的多态性研究——Ⅲ阳离子型表面活性剂诱导λ-DNA由线圈型向球型的转变

应用圆二色光谱 (CD)、扫描电子显微镜 (SEM )和原子力显微镜 (AFM )方法 ,研究了噬菌体λ DNA在阳离子型表面活性剂胶束介质中结构形态的变化 .结果表明 :在λ DNA溶液体系中随着阳离子型表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)浓度的增加 ,其CD谱表现出λ DNA由B型DNA向DNA缩拢的构象变化过程 .SEM和AFM同时观测到λ DNA在CTAB诱导下 ,其结构形态由线圈状向小球状 (球径 =1.2 5 μm)最终至球状 (球径 =5 .4μm)的凝聚过程 .     

原子力显微镜观测紫外线诱导的K562肿瘤细胞DNA损伤

利用彗星电泳检测出UVB、UVC短时间照射会使肿瘤细胞的DNA发生断裂,而长时间照射之后彗星电泳无法检测到碎片,推测可能是由于DNA分子交联的原因[1],国内外尚无定论.为了更直观的研究这种现象,提取了UVB,UVA照射后K562细胞的DNA,并调节到合适的浓度在原子力显微镜下观测.实验结果表明UVB对K562肿瘤细胞DNA损伤的影响呈现时间/剂量效应,较短时间照射主要产生DNA的链断裂,较长时间辐射则主要产生DNA链的交联.UVC对K562肿瘤细胞DNA的损伤大于UVB.UVC短时照射即可引起DNA的断裂和交联,较长时间辐射主要产生交联和一些断裂;长时间照射不但产生大量交联,同时有大量断裂产生,并发生凝缩和缠绕等结构破坏.     

用琼脂糖电泳进行带移实验

基因表达凋控研究是现代分子生物学研究的中心,研究基因的表达调控离不开研究各种调控因子与基因间的相互作用。DNA印迹(DNA footprint)和带移(Bandshiftor Gel retardation)是研究调控因子与靶序列相互作用的基本方法。带移的基本原理是:当蛋白类调控因子与DNA靶序列结合后,其分子量变大,而且所带电荷与游离DNA有较大差异,在凝胶电泳中的电泳迁移率变小,电泳条带后移。由于进行DNA Foot-print之前一般需要通过带移实验确定反应的适合条件,故带移实验更具有其重要性。     

λDNA/HindⅢ片段在凝胶中的电泳性质分析:离子效应及其它

本文以λDN/HinaⅢ片段(2.0kbp至23.1kbp)为材料,研究在各价态金属离子作用下DNA片段在凝胶中电泳迁移率的变化规律.离子效应使DNA聚合链的挠性增大,末端距与持久长度减小,从而使电泳迁移率随离子强度的增加而减小;同时这种离子效应又是价态依赖的.DNA电泳行为的离子效应与Hervet关于DNA聚合键在凝胶中的电泳理论模型分析一致.同时尝试应用现代多聚电解质理论对电泳离子效应的半定量分析也得到了满意的结果.本文还对凝胶浓度、电场强度、以及分子量诸因素对DNA电泳性质的影响进行了实验研究与讨论.     

λDNA/HindⅢ片段在凝胶中的电泳性质分析:离子效应及其它

本文以λDN/HinaⅢ片段(2.0kbp至23.1kbp)为材料,研究在各价态金属离子作用下DNA片段在凝胶中电泳迁移率的变化规律.离子效应使DNA聚合链的挠性增大,末端距与持久长度减小,从而使电泳迁移率随离子强度的增加而减小;同时这种离子效应又是价态依赖的.DNA电泳行为的离子效应与Hervet关于DNA聚合键在凝胶中的电泳理论模型分析一致.同时尝试应用现代多聚电解质理论对电泳离子效应的半定量分析也得到了满意的结果.本文还对凝胶浓度、电场强度、以及分子量诸因素对DNA电泳性质的影响进行了实验研究与讨论.     

硫酸软骨素自组装膜上草酸钙Liesegang环的AFM研究

运用原子力显微镜（Atomic Force Microscope,AFM）研究了草酸钙在硫酸软骨素自组装膜上受控凝集结晶的现象,发现当硫酸软骨素的浓度为1.0g/L时,在云母表面形成的网状基底可以诱导过饱和的草酸钙溶液凝集结晶形成Liesegang环,这是草酸钙晶粒在膜表面扩散凝聚的结果,该环的形成和基底物的浓度以及草酸钙本身的过饱和度密切相关。表明了金属离子和硫酸软骨素分子之间复杂的相互作用与尿结石中的环状结构存在着一定的关系。从电荷聚集与晶格匹配等方面对Liesegang环的形成机理作了初步的探讨,为深入研究尿结石中环结构的形成提供了一定的实验依据。     

单细胞凝胶电泳联合原子力显微镜观测UVB诱导的细胞DNA损伤模式变化

目的：检测UVB诱导的真核细胞DNA损伤。方法：采用单细胞凝胶电泳与原子力显微镜。结果：不同照射剂量的UVB引起的真核细胞DNA损伤模式不同。在0～20J／m2照射剂量范围内DNA无损伤;在20--360J／m2照射剂量范围内DNA损伤程度加快;当照射剂量超过360J／m2时DNA损伤速度减慢,实验组之间无显著性差异,出现“平台”。原子力显微镜的观察结果表明随着UVB照射剂量的增加,DNA结构的变化经历了断裂、交联与断裂并存的损伤增强趋势。当照射能量达到280J／m2时细胞DNA大都形成断片,并相互交联在一起。这一结果表明彗星电泳检测到的UVB照射剂量达到一定剂量后,DNA损伤出现”平台”的原因可能是此时DNA发生了链内或链间交联。结论：不同照射剂量的UVB造成的细胞DNA损伤模式不同;原子力显微镜是一种比较直观的观测DNA损伤的方法。借助原子力显微镜我们可以深入了解单细胞凝胶电泳检测的原理,为DNA损伤检测提供更优良的检测手段。     

沉默MDR1基因可增强三尖杉酯碱诱导的SGC7901/ADM细胞凋亡

为探讨沉默MDR1基因对三尖杉酯碱诱导SGC7901/ADM细胞凋亡的影响,将本实验室构建的靶向MDR1基因的RNAi干扰载体pSilencer 2.1-3,转染胃癌SGC7901/ADM细胞,经三尖杉酯碱处理后,通过MTT法检测细胞活力,激光共聚焦显微镜和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡现象。研究发现,pSilencer 2.1-3稳定转染SGC7901/ADM细胞后,三尖杉酯碱对细胞的IC_950)值由(2.527±0.316)μg/m L降至(0.719±0.087)μg/mL,相对逆转率达到(72.435±2.921)%,从而提高了SGC7901/ADM细胞对三尖杉酯碱的敏感性。激光共聚焦显微镜下,细胞形态发生改变,染色质凝聚、边缘化,琼脂糖凝胶电泳DNA呈梯状条带,呈现明显的凋亡特征,结果表明,沉默MDR1基因增强了三尖杉酯碱诱导的SGC7901/ADM细胞凋亡。     

多聚亚基蛋白质在固-液界面团聚的测量与表征

以血红蛋白和乙肝表面抗原(HBsAg)为模型,联用双偏振光干涉分析仪(DPI)和原子力显微镜(AFM)研究在固-液界面上的吸附行为.结果发现:当溶液环境中血红蛋白的质量浓度为1.08 mg/mL时,测得在硅羟基表面吸附的平均厚度为3.54 nm,蛋白颗粒直径达60～ 150 nm,远高于血红蛋白的分子尺寸,说明血红蛋白在固-液界面上发生团聚.当HBsAg质量浓度为0.67 mg/mL时,测得在硅羟基表面及DEAE琼脂糖表面吸附的平均厚度分别为1.06和23.69 nm,表面吸附的蛋白颗粒直径分别为288～401和520 ～ 971 nm,是单分子HBsAg尺寸的13.1～44.1倍,表明在模型蛋白表面都形成了大的团聚体.     

鲎源抗菌肽对大肠杆菌的抑杀机理

【目的】研究鲎源抗菌肽鲎素对大肠杆菌抑杀的作用机理,为防治大肠杆菌引起的肠道疾病提供新的潜在抗菌药物。【方法】利用牛津杯法和微量MH肉汤稀释法测定其抗菌活性,激光共聚焦扫描显微镜观察鲎素对大肠杆菌的结合、分布及杀伤过程,透射电镜观察鲎素对大肠杆菌超微结构的影响,并采用琼脂糖凝胶阻滞电泳研究其对大肠杆菌基因组DNA和RNA的影响。【结果】鲎素对大肠杆菌的最小抑菌浓度与最低杀菌浓度分别为5 mg/L和20 mg/L;激光共聚焦扫描显微镜和透射电镜观察发现鲎素能快速作用于细胞表面,并发生聚集现象,随着作用时间的延长能导致细胞膜结构的破坏和细胞内含物的释放;通过琼脂糖电泳结果显示鲎素也能够作用于大肠杆菌基因组DNA,并呈浓度依赖关系,10 mg/L鲎素对基因组DNA无明显影响,80 mg/L鲎素能导致DNA断裂;凝胶阻滞电泳显示鲎素也能与基因组DNA和RNA发生结合。【结论】研究结果为深入探讨鲎素抑杀大肠杆菌的分子机制提供重要的理论依据。     

用原子力显微镜观察人类精子的表面结构

目的:探讨用原子力显微镜观察精子表面结构的方法。方法:经常规洗涤正常人精液后进一步除去精子表面和生理溶液中的蛋白质,直接用原子力显微镜观察人类精子的表面形态。结果:获得了人类精子表面的细微结构和精子头的三维数据。精子全长约47μm,精子头约4.6μm,顶体位于精子头前端1/2~2/3,顶体前端扁平。精子赤道区有两圈环形凸起。结论:不需特殊处理,用原子力显微镜能直接观察精子表面的超微结构,并获得量化的三维数据。     

铅、铬胁迫对大弹涂鱼血细胞遗传损伤的彗星实验检测

通过彗星实验研究重金属Pb、Cr对大弹涂鱼的外周血细胞的影响。用不同浓度的Pb、Cr对大弹涂鱼外周血细胞进行1 h的染毒后通过单细胞凝聚电泳检测DNA损伤情况。结果表明国标浓度的Pb（0.005 mg/L）、Cr（0.05 mg/L）对大弹涂鱼外周血细胞均无明显影响;而国标10倍、100倍和1000倍浓度的Pb或Cr胁迫均会造成血细胞DNA损伤,且离子浓度与血细胞DNA的损伤程度间均存在＂剂量-效应＂,即浓度越高,DNA损伤越严重。因此大弹涂鱼血细胞可作为评价重金属遗传损伤毒性效应的敏感性生物标志物。     

溴代2(5H)-呋喃酮对绿脓杆菌生物膜形成的抑制作用

研究溴代2(5H)-呋喃酮化合物作为细菌群体感应抑制剂.对绿脓杆菌P.aeruginosa(PA)生物膜(biofilms,BF)形成的影响.首先试验化合物对细菌的最低抑制浓度(MIC)和生长曲线,选择1/2 MIC的化合物浓度进行实验;平板培养法培养绿脓杆菌7 d.得到成熟BF,用扫描电镜和原子力显微镜观察溴代2(5H)-呋喃酮对BF形态结构的影响.初步生物活性试验显示溴代2(5H).呋喃酮对革兰氏阴性菌PA的生物膜形成具有明显抑制作用,扫描电镜和原子力显微镜观察可见BF被破坏,基质样物变稀疏,细菌群聚大为降低.     

抗癌药物奥沙利铂与DNA分子相互作用的研究

奥沙利铂被称为第三代铂类药物,特别对胃肠道肿瘤具有较好的疗效.目前大多数的研究表明奥沙利铂的主要作用靶点是DNA分子,但它与DNA分子形成的关键结构和作用机制仍处在探索阶段.本研究运用紫外可见吸收光谱和原子力显微镜观察探索奥沙利铂与DNA在活体外的相互作用过程,从而揭示奥沙利铂产生抗癌作用的主要分子结构基础.首先使用紫外光谱研究了较高浓度奥沙利铂与DNA的作用过程.在此基础上,进一步采用原子力显微镜在高定向热解石墨表面观察了不同浓度奥沙利铂与质粒DNA在37℃条件下作用不同时间后的结构形貌变化,分析了奥沙利铂与DNA相互作用的过程.高分辨原子力显微观察结果表明奥沙利铂与DNA作用后可导致质粒DNA的结构发生显著的变化.随着作用时间的增加,DNA分子逐渐由伸展的链状变化为相互缠绕并带有许多结点的紧密结构,最终变化为更紧密的球状结构.本研究结果表明奥沙利铂可通过化学键合作用和静电作用使质粒DNA逐渐凝集为紧密的球状结构,这种结构可能对奥沙利铂的抗癌活性和毒性产生重要影响.     

鉴定水稻中一个新的专一结合GCC元件的AP2/EREBP族转录因子

TSH1,是通过搜寻GenBank的EST库而获得的一个来源于水稻的含AP2/EREBP保守结构域的蛋白质.为了详细分析TSH1蛋白与其DNA顺式元件的结合特性,首先采用传统的凝胶阻滞实验和酵母单杂交技术,证实TSH1在体内和体外均专一性地结合于GCC元件,然后利用原子力显微镜技术精确测量了TSH1蛋白与GCC元件在单分子水平的相互作用力.结果表明,GST-TSH1与DRE元件没有特异性的结合,而GST-TSH1与GCC元件结合力的大小为(83.9±2.2)pN,这种特异性的结合可以被加入的游离TSH1蛋白明显降低.GST蛋白和突变GCC元件作为负对照显示出与GCC元件无特异性作用力.以上结果充分证明,TSH1是专一性地与GCC元件相作用的转录因子,而且原子力显微镜对于检测转录因子与DNA相互作用时单碱基的突变十分灵敏.通过比较几种评估转录因子与DNA顺式元件结合特异性的方法,阐述了原子力显微镜技术的特点及优越性.     

聚乙烯亚胺增强Pluronic介导的BALB/c小鼠骨骼肌原位基因传递和表达效率

目的在Pluronic L64介导的BALB/c小鼠骨骼肌基因传递体系中正确引入聚乙烯亚胺(PEI)以增强基因表达效率。方法以生理盐水组、质粒DNA (p DNA)组和Pluronic L64/p DNA (L/D)组为对照组,各比例PEI/p DNA与Pluronic L64混合物(L/P/D-0. 5、L/P/D-3、L/P/D-10)为实验组,将各组样品注射到小鼠胫骨前肌中。7 d后取组织,检测报告基因表达(β-半乳糖苷酶和荧光素酶)和肌肉组织病变情况。通过尾静脉注射考察L/P/D-0. 5组的体内急性毒性。最后,通过动态光散射仪和原子力显微镜测定L/P/D-0. 5组中PEI/p DNA复合物的粒径、电位及形貌。结果 1)报告基因表达评估:L/P/D-0. 5组外源基因表达效率最高;随着N/P增加,几乎检测不到外源基因的表达。2)生物相容性评估:无论原位注射还是尾静脉注射,L/P/D-0. 5组均没有显示出组织病变,而其他比例的L/P/D组出现了不同程度的组织学病变。3)物理特征表征:虽然在L/P/D-0. 5组中DNA未被完全压缩,但PEI/p DNA复合物已拥有良好的纳米粒径和形态结构,且表面电位为负。结论 L/P/D-0. 5体系能安全有效地增强外源基因在骨骼肌内的表达。     

稳恒磁场联合抗肿瘤药物协同杀伤肝癌细胞Hepa1-6

化学疗法为肿瘤临床治疗的常规方法,存在毒副作用大、抗药性强等缺陷。为了提高药物的利用效率,减少药物引起的毒副作用,将8.8 m T稳恒磁场分别与顺铂、阿霉素联用,经MTT检测发现磁场与药物联用可对肝癌细胞Hepa1-6生长具有协同抑制的效应,经HE染色发现联合处理组细胞发生明显的形态学改变。流式细胞仪检测显示磁场能增加顺铂对G2/M期细胞的滞留,而磁场与阿霉素共同作用可将细胞阻止于G1期和G2/M期。经彗星电泳检测表明磁场能够增强药物对DNA的损伤,且原子力显微镜观察发现联合处理组细胞膜表面出现较大且较深的孔洞,表面结构破坏严重。实验结果表明,抗肿瘤药物与磁场联用技术可有效抑制肿瘤细胞的生长,减少药物的使用浓度,为将抗肿瘤药物与磁场应用于临床治疗恶性肿瘤提供了一个全新的思路与策略。     

莪术油诱导人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的研究

该实验目的是探究莪术油(zedoray turmeric oil,ZTO)诱导人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的作用。不同浓度的ZTO作用人胃腺癌SGC-7901细胞48 h后,采用台盼兰拒染法检测细胞生长抑制率;光学显微镜、荧光显微镜、透射电镜下观察细胞的形态和超微结构;琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化;Annexin V-FITC法检测细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR和Western blot检测Bax、Bcl-2 m RNA和蛋白表达水平。结果显示,作用人胃腺癌SGC-7901细胞48 h,ZTO的最佳浓度是110μg/m L,IC50为(108.002±0.305)μg/m L;显微镜下细胞呈不同程度的凋亡特征;DNA电泳可见梯状条带;最佳药物浓度作用细胞48 h的早期凋亡率为(25.07±0.82)%;Bax表达水平升高,Bcl-2表达水平降低,Bax/Bcl-2比值显著升高(P0.05),表明ZTO通过上调Bax表达、下调Bcl-2表达诱导人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡。     

甜樱桃品种SSR-PCR反应体系的优化

以甜樱桃品种那翁为试材,研究了樱桃SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响,并比较了采用聚丙稀酰胺凝胶及琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异.结果表明:在PCR反应体系中,DNA最适浓度30～45 ng;Mg2+的最适浓度范围为1.5～3.0 mmol/L;dNTP最适浓度为0.2～0.3 mmol/L;引物的最适浓度为0.3～0.4 μmol/L;Taq聚合酶在20 μl反应体系中宜加入0.5 U.利用此反应体系,对24份樱桃代表资源进行了SSR反应,用6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测,扩增产物在100～250 bp之间,不同品种间DNA谱带多态性丰富.琼脂糖电泳检测的DNA多态性不如聚丙稀酰胺凝胶丰富.     

白术多糖WAM-1结构的色谱分析和原子力显微镜观察

通过热水浸提法从草本植物白术根茎提取的水溶性粗多糖,经DEAE-52纤维素柱层析分离和Sephadex G-200凝胶过滤柱层析纯化,得到组分WAM-1.采用高效液相色谱(HPLC)检测WAM-1的纯度,气相色谱(GC)对其单糖组分进行分析,原子力显微镜(AFM)对其分子外貌进行观测.结果显示:WAM-1为均一多糖,由葡萄糖和半乳糖以3.01:1摩尔比构成;在不同浓度溶液条件下,WAM-1分子以不同形态存在,多糖溶液的浓度对WAM-1的分子链构象及链间相互作用形式产生影响,推测可能与WAM-1分子内、分子间的氢键缔合作用有关.多糖浓度为10μg/mL时,可清晰的观察到WAM-1是以刚性链状形态存在,且具有多分支结构.