SD大鼠维生素D受体真核过表达载体构建及功能分析

[目的]构建SD大鼠维生素D受体真核过表达载体并将其在癌细胞中表达及分析不同癌细胞VDR表达的差异性。[方法]通过基因工程方法从p UC18-rat-VDR质粒载体上通过PCR扩增得到了大鼠VDR片段全长,并构建CD513-VDR-EGFP真核超表达载体;经常规PCR、XbaⅠ和Bam HⅠ双酶切及测序鉴定后提取重组质粒CD513-VDR-EGFP并进行细胞转染。利用Western Blot和q PCR方法分析蛋白和基因表达差异。[结果]荧光显微镜下可见单独转染CD513-EGFP和单独转染CD513-VDR-EGFP的293T细胞和He La细胞表达强烈的绿色荧光蛋白,并检测到蛋白及基因表达差异性的存在。[结论]成功构建重组质粒CD513-VDR-EGFP并在目的细胞中过表达(P0.01),本底水平表达的VDR在He La细胞中的表达略高于293T细胞(P0.05)。     

大鼠骨髓间充质干细胞VDR和CYP27B1的表达

[目的]探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)中维生素受体(vitamin D receptor,VDR)和CYP27B1的表达。[方法]首先以全骨髓贴壁法分离得到大鼠BM-MSCs,通过成骨和成脂诱导分化鉴定其分化潜能,再通过RT-PCR检测大鼠BM-MSCs中VDR和CYP27B1的mRNA表达。[结果]从大鼠骨髓中分离得到具有成骨和成脂分化潜能的BM-MSCs,VDR和CYP27B1基因在大鼠BM-MSCs中有表达,其相对于β-actin的mRNA值分别为1.10和0.39。[结论]这为维生素D3在大鼠BM-MSCs的自分泌和旁分泌代谢研究奠定基础,为维生素D3治疗骨质疏松的研究提供理论依据。     

猪脂肪组织和原代脂肪细胞中GPR43基因的转录表达规律

根据GenBank已发表的人、小鼠及大鼠GPR43(G protein-coupled receptor 43)基因序列, 设计并合成一对引物, RT-PCR扩增获得猪GPR43基因cDNA, 并利用PCR技术检测该基因在不同猪种、不同发育阶段、不同部位脂肪组织及原代脂肪细胞中的转录表达规律。结果显示, 成功克隆猪GPR43 cDNA片段, 长度为486 bp (GenBank登陆号为EU122439); 同源性分析发现, 猪GPR43与人、小鼠和大鼠同源性达83%以上; GPR43 mRNA表达量在脂肪型猪种上显著高于瘦肉型猪种, 随月龄增长表达量逐渐上升, 且皮下脂肪表达量较内脏脂肪高; 在猪前体脂肪细胞诱导分化过程中, GPR43 mRNA表达量呈时间依赖性升高。揭示GPR43 mRNA表达与猪肥胖程度、年龄、脂肪沉积部位以及脂肪细胞分化程度密切相关。     

维生素D受体在C57BL/6小鼠十二指肠中的定位表达分析

目的为探讨维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)在C57BL/6小鼠十二指肠中的定位与表达,研究维生素D系统与肠道发育过程的相关性。方法利用实时定量PCR(quantitative PCR,q PCR)、苏木精伊红染色、免疫荧光染色、免疫印迹(Western blotting,WB)的检测技术,对C57BL/6小鼠十二指肠中VDR定位表达做定性与定量的分析。结果 VDR的mRNA在C57BL/6小鼠十二指肠组织中的表达在其出生的第21天达到峰值。此外,VDR主要分布在C57BL/6小鼠十二指肠上皮细胞和平滑肌细胞的胞质中。对组织样品的WB检测显示,C57BL/6小鼠十二指肠发育过程中,VDR没有发生明显的核转位。结论从分子生物学角度分析了VDR在C57BL/6小鼠十二指肠不同生长发育阶段的表达规律,为了解和完善VDR在肠道中的作用奠定理论基础。     

Sirt3在不同热量饮食下的大鼠脂肪组织中的表达

Sirt3是一种NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶,在肾脏、棕色脂肪、心脏和其它代谢活跃的组织中高表达. 多项研究表明,Sirt3在细胞能量代谢、衰老、肿瘤发生等方面起着重要的作用.为探讨Sirt3基因在不同热量饮食下的SD大鼠脂肪组织中的表达差异和意义,将60只3周龄,重量(60±5) g的断乳SD雄性大鼠,随机分为热量限制组、自由摄食组、高热量组,其中高热量组用于构建肥胖SD大鼠模型,喂养16周后处死,分别用Western印迹和real-time RT-PCR方法检测各组大鼠肾周脂肪组织中Sirt3基因的蛋白和mRNA的表达量.Western印迹检测与real-time RT-PCR检测结果一致: Sirt3基因的蛋白和mRNA在肥胖大鼠脂肪组织中的表达低于自由摄食组（P<0.05）,在热量限制组大鼠脂肪中的表达高于自由摄食组(P<0.05).研究结果说明,Sirt3基因在不同热量饮食下的SD大鼠脂肪组织中的表达有差异,可能与能量代谢及肥胖有着密切关系.     

无菌猪和普通猪早期脂肪发育及脂肪组织基因转录表达的差异

通过比较无菌仔猪和普通仔猪在生长早期脂肪沉积的差异及脂肪组织基因转录表达谱的不同,评估肠道微生物定植对猪脂肪组织早期发育的直接影响.分别采集25日龄无菌仔猪(3头)和普通仔猪(3头)的颈部皮下脂肪,切片后经HE染色观察不同猪脂肪细胞的形态差异;Western Blot检测脂肪合成调控因子的蛋白表达差异;ELISA法测定...     

大鼠脂肪间充质干细胞的鉴定及肝内移植的研究

目的:从脂肪组织中获取间充质干细胞(ADMSCs)并验证其多向分化潜能,探讨ADMSCs在肝再生中的作用。方法:获取大鼠脂肪组织,用胶原酶消化法获取干细胞,并进行体外扩增、传代,取第3代细胞分别用不同诱导培养液进行成骨、成脂诱导,诱导后通过细胞形态学和特殊染色观察诱导效果。用PKH26标记细胞,制作部分肝切除模型,将标记的自体ADMSCs经门静脉植入体内,2周后切下取肝脏制成冰冻切片,荧光显微镜观察植入细胞在肝脏的定位,免疫荧光染色观察其白蛋白的表达。结果:从脂肪组织中分离出的细胞能在体外大量扩增,能被诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞,ADMSCs移植2周后,可见PKH26标记细胞散在分布于肝内,免疫荧光染色显示标记细胞白蛋白染色阳性。结论:大鼠脂肪组织中可以获取具有多向分化潜能的间充质干细胞,该细胞在肝再生环境中能向肝细胞分化,参与肝再生。     

胰岛素和胰岛素突变体促进大鼠脂肪细胞摄取葡萄糖

报道了大鼠脂肪细胞摄取葡萄糖测定胰岛素体外活性的简便方法 .在胰岛素存在下 ,脂肪细胞摄取葡萄糖的量比对照增加 5～ 6倍 .当胰岛素浓度在 0 .2～ 1 0μg/L时 ,脂肪细胞摄取D [3 ³H] 葡萄糖的量与胰岛素浓度对数呈线性关系 .葡萄糖和 3 O 甲基葡萄糖抑制指脂肪细胞摄取D [3 ³H]葡萄糖 .利用这一方法测定了[B₂ Lys] 胰岛素和 [B₃ Lys] 胰岛素的体外活力 ,分别为胰岛素的 6 1.6 %和 154% .     

猪雌激素受体关联受体a基因的克隆、表达及其对脂肪细胞脂质聚集的影响

雌激素受体关联受体α(Estrogen-related receptor α,ERRα)是调控机体能量代谢的关键转录调控因子,其在白色脂肪组织中的作用尚不清楚。本研究旨在通过touch down-PCR方法克隆猪ERRα基因的ORF序列;通过Western blotting和细胞免疫荧光染色法分析其在猪各组织及成熟脂肪细胞中的表达模式;利用ERRα特异性抑制剂XCT790处理原代培养的猪成熟脂肪细胞,探讨其对成熟脂肪细胞甘油三酯聚集的影响。结果显示,所克隆的猪ERRα基因ORF序列长1269bp(GenBank Accession No.FJ446485,尚未公布),编码422个氨基酸,其核苷酸和氨基酸序列与其他物种高度同源;ERRα蛋白高表达于猪白色脂肪组织(White adipose tissue,WAT)、肾脏以及心脏中,在脾脏中表达量较低;细胞免疫荧光化学染色显示,ERRα蛋白广泛分布于脂肪细胞的细胞核和胞浆中;XCT790在10μmol/L浓度时显著抑制了ERRα蛋白的表达和成熟脂肪细胞中甘油三酯的聚集。本研究将为有效调控体脂沉积提供新的靶点和理论参考。     

脂肪细胞Npy4r促进高脂饮食诱导肥胖

脂肪组织的神经支配与调节在能量代谢稳态的维持中发挥重要作用。神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)及其脂肪细胞受体信号通路促进高脂饮食诱导的肥胖,其中NPY受体1(NPY receptor Y1,NPY1R)与受体2(NPY2R)是主要的NPY外周受体。NPY受体4(NPY4R)也在脂肪组织表达,然而尚不清楚其是否参与肥胖的发生发展机制。本研究建立了NPY及其受体的免疫荧光成像技术和脂肪细胞回复性表达Npy4r小鼠。根据对不同部位脂肪组织的荧光显微术观察,发现NPY在肩胛间棕色脂肪和皮下脂肪的围绕血管区域以点状形式表达,NPY系统的各受体在脂肪组织的空间分布上具有明显的组织特异性：NPY1R在棕色脂肪、主动脉周围脂肪和性腺脂肪较为富集,NPY2R在棕色脂肪和主动脉周围脂肪较为富集,NPY4R在棕色脂肪与性腺脂肪较为富集。继而通过比较脂肪细胞回复性表达Npy4r小鼠与全身Npy4r基因静默小鼠在高脂喂食下的体重与糖代谢,发现脂肪细胞Npy4r促进高脂饮食诱导的肥胖(P <0.0001)。本研究明确了NPY及其受体NPY1R、 NPY2R和NPY4R在不同部位脂肪组织的蛋...     

京尼平对小鼠棕色和白色脂肪组织UCP1表达的影响

目的:棕色脂肪组织活化和白色脂肪组织棕化是改善减肥的良好策略。本研究利用冷刺激作为阳性对照,观察京尼平对小鼠脂肪组织活化与棕化的作用。方法:8周龄雄性C57BL/6J小鼠30只,随机分为正常对照组、京尼平组、冷刺激组, 每组10只。京尼平组小鼠腹腔注射给予京尼平处理(15 mg/(kg·d),连续9 d),对照组用生理盐水处理,冷刺激组小鼠在室温(22℃±2℃)下处理4 d后,置于4℃环境中进行冷刺激处理5 d(24 h/d)。检测各组小鼠每天摄食量、体重和体温变化,取肩胛下区、腹股沟区及附睾周围部分脂肪组织观察形态学的变化,测定棕色脂肪组织、皮下白色脂肪组织以及内脏白色脂肪组织解偶联蛋白1(UCP1)的表达。结果:与正常对照组相比,京尼平组小鼠白色脂肪湿重下降16%,冷刺激组下降28%,均有明显差异(P＜0.05);京尼平组和冷刺激组白色脂肪组织颜色变深,HE染色显示脂肪细胞内的脂滴变小,数量增加;京尼平组小鼠的皮下、内脏白色脂肪组织和棕色3种脂肪组织中的UCP1表达量均明显增加(P＜0.05)。结论:京尼平通过上调UCP1的表达促进棕色脂肪组织活化和白色脂肪组织棕化,此效应是京尼平降脂减轻体重的作用机制之一。     

不同强度电针对肥胖大鼠脂肪组织炎症相关因子的影响

探讨不同强度电针对肥胖大鼠脂肪组织核因子-κBp65(NF-κBp65)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的作用差异.将SD大鼠随机分为普通饮食组、高脂饮食组、5 V电针组、2.5 V电针组,除普通饮食组外其余各组大鼠均饲以高脂饲料.取"足三里"、"三阴交"穴,不同强度电针治疗14 d后,用蛋白质印迹技术(Western blot)检测肥胖大鼠附睾脂肪组织NF-κBp65的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测肥胖大鼠附睾脂肪组织MCP-1、TNF-α的含量.研究发现两电针组肥胖大鼠体重、Lee’s指数、脂肪组织中NF-κBp65表达、MCP-1和TNF-α含量较高脂饮食组显著降低(P<0.01),5 V电针组较2.5 V电针组下降效果更为明显(P<0.01,P<0.05).结果表明电针可改善肥胖脂肪组织炎症反应状态,减轻肥胖大鼠体重,且5 V电针组效果优于2.5 V电针组.     

山羊Wnt10b基因生物学特征及组织细胞表达模式分析

为了获得山羊Wnt10b基因序列,并阐明其组织表达谱及在前体脂肪细胞和成肌细胞分化过程中的表达模式。本研究利用胶原酶消化法获得山羊皮下和肌内前体脂肪细胞,利用组织块法获得成肌细胞;采用RT-PCR方法克隆山羊Wnt10b基因序列,荧光定量PCR技术检测该基因在各组织、前体脂肪细胞与成肌细胞诱导分化过程中的表达情况。由分析可知,获得山羊Wnt10b基因序列1 232 bp(Gen Bank登陆号:KU950832),其中CDS为1 176 bp,5'UTR 44 bp和3'UTR 12 bp,编码391个氨基酸残基,山羊Wnt10b氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列同源性达98%;Wnt10b m RNA在山羊脂肪组织中表达水平最高,极显著高于其他组织(p0.01);Wnt10b m RNA随着山羊肌内前体脂肪细胞和成肌细胞的分化表达呈上升趋势,但其在皮下前体脂肪细胞中的表达模式却相反。结果表明,山羊Wnt10b基因在脂肪组织中表达水平最高,可能在脂肪沉积和脂代谢中发挥重要的调控作用,但在皮下和肌内前体脂肪细胞成脂分化的表达模式不同,提示该基因在山羊不同部位脂肪沉积中可能发挥不同的调控作用。     

鼻黏膜间充质干细胞的培养、鉴定及诱导分化

目的建立Sprague Dawley(SD)大鼠鼻黏膜间充质干细胞(NM-MSCs)的获取、分离、培养方法,初步了解其生物学特性。方法通过SD大鼠鼻黏膜贴壁法体外分离、培养NM-MSCs,光镜下细胞形态学观察,用免疫荧光技术检测间充质干细胞和神经干细胞标记物,用流式细胞术检测细胞表面标记物,再诱导其向骨组织及脂肪组织方向分化,最后对其进行细胞周期检测及分析。结果分离培养的NM-MSCs光镜下以梭形与多角形细胞为主,呈放射状排列,且生长旺盛;免疫荧光染色显示NM-MSCs同时表达STRO-1和Nestin;第4代NM-MSCs不表达CD19、CD31、CD34、CD45及HLADR细胞表面标记物,但表达CD90、CD105基质细胞标记物;NM-MSCs经成骨、成脂诱导后,茜素红染色和油红O染色均呈阳性;细胞周期分析显示NM-MSCs符合干细胞生长的特性。结论 SD大鼠NM-MSCs组织块贴壁法获取容易,操作简单,且可大量扩增用于细胞实验研究,经体外诱导后具有多向分化潜能,具有间充质干细胞的一般生物学特性。SD大鼠鼻黏膜组织块贴壁法为组织细胞工程研究提供了充足的种子细胞来源。     

花生四烯酸对大鼠前体脂肪细胞生长与分化的影响(英文)

以大鼠前体脂肪细胞原代单层培养为模型,用不同浓度花生四烯酸(AA)处理细胞.通过台盼蓝排斥试验及噻唑蓝比色法(MTT)反映各组细胞增殖状况;Hoechst33342荧光染色观察AA处理后细胞核形态变化;油红O染色提取法分析细胞分化程度;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)分析环氧合酶2(COX2)mRNA表达情况,探讨外源性AA对大鼠前体脂肪细胞生长分化的影响及其可能机制.120μmolLAA处理前体脂肪细胞24～72h,细胞活力明显高于对照组;160μmolLAA作用48h时,前体脂肪细胞表现出明显的凋亡现象;脂肪细胞经40～80μmolLAA作用72h时,细胞油红O染色的吸光度值显著减少;40μmolLAA在作用的24h时,可显著上调COX2mRNA的表达量.说明外源性AA以时间性和剂量依赖性调节前体脂肪细胞的生长与分化,40～80μmolLAA在不显著增加脂肪数目的同时,可抑制前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞转化、减少脂肪生成量,对控制动物体脂的形成有一定参考价值,COX2mRNA表达量的上升可能是AA抑制前体脂肪细胞分化的内在机制.     

骨髓间充质干细胞对大鼠血管性痴呆模型GAT1的调节作用研究

目的探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠血管性痴呆模型中γ氨基丁酸转运体(GAT)1的调节作用。方法体外分离纯化SD大鼠BMSCs,双侧颈内动脉持续结扎建立大鼠血管性痴呆模型后经尾静脉注射5×10~6 BMSCs,4周后通过免疫组织化学和免疫印迹实验检测大鼠脑内GAT1的表达变化,单因素方差分析检验各组表达差异,组间数据多重比较采用Student's t检验。结果对照组(大鼠血管性痴呆模型接受PBS注射)海马和皮层的GAT1表达较假手术组(暴露双侧颈内动脉未结扎)明显降低(P0.01)。BMSCs移植4周后,蛋白灰度值分析结果显示大鼠血管性痴呆模型海马部位的GAT1表达(0.32±0.06)较对照组(0.18±0.03)明显增高,差异具有统计学意义(t=10.68,P=0.002),免疫组化结果显示GAT1阳性细胞在海马CA1区(43.10±2.87)个较对照组(24.30±3.97)个明显增多(t=18.99,P=0.001,)。细胞移植后皮层部位GAT1的表达[蛋白灰度值:0.55±0.04,阳性细胞量:(49.15±2.78)个]较对照组[蛋白灰度值:0.51±0.03,阳性细胞量:(47.82±3.27)个]无明显变化,差异无统计学意义(t=6.49,3.50;P=0.12,0.39)。结论 BMSCs移植有助于大鼠血管性痴呆模型海马(尤其是CA1区)GAT1的表达水平增高。     

神经管缺陷大鼠模型胚胎形态学改变及PLA2、COX-2表达

目的:研究神经管缺陷大鼠模型胚胎形态学改变及PLA2、COX-2表达.方法:16只SD雌性大鼠分为2组:第一组为正常对照组,8只,受孕后正常饲养;第二组为糖尿病模型组,8只,受孕后第6天经过尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)构建先天性神经管缺陷组大鼠.妊娠12日后取出所有胚胎做HE染色观察胚胎形态学及免疫荧光染色的方法观察PLA2、COX-2表达.结果:(1)HE染色及免疫荧光发现糖尿病胚胎的神经管形态发育明显畸形(2)免疫荧光发现PLA2、COX-2糖尿痛胚胎的表达明显降低.结论:PLA2、COX-2基因表达在SD大鼠神经管的发育过程中起着重要的作用.可能对临床治疗神经管畸形提供了一种新方法.     

过表达鸡Gata2或Gata3基因抑制Pparγ基因的转录

脂肪细胞分化是脂肪组织发育的一个重要过程. 目前,鸡脂肪细胞分化的分子调控机制还不十分清楚. 哺乳动物的研究结果表明,转录因子GATA结合蛋白2(Gata2)和GATA结合蛋白3(Gata3)具有抑制脂肪细胞分化的功能,它们在白色脂肪组织和棕色脂肪组织中的表达模式不同. 鸡没有棕色脂肪组织,目前还没有关于Gata2 和Gata3作用于鸡脂肪细胞分化的研究报道. 本研究利用半定量RT PCR的方法分析了Gata2和Gata3基因在鸡腹部脂肪组织和前脂肪细胞中的表达规律,发现鸡腹部脂肪组织中高水平表达Gata2 基因,低水平表达Gata3基因|鸡前脂肪细胞中Gata2 基因的表达水平远高于Gata3基因的表达水平,油酸诱导分化后的鸡前脂肪细胞Gata2基因的表达水平明显下调.此外,鸡过氧化物酶体增殖体激活受体γ(Pparγ)启动子（－1985/－89）报告基因荧光素活性分析和半定量RT PCP发现,在DF1细胞中过表达Gata2 或Gata3抑制鸡PPARγ基因的转录. 本研究结果为进一步研究鸡脂肪细胞分化的分子调控机制和Gata2和Gata3基因的生物学功能提供了参考.     

MiR-125a-5p抑制3T3-L1前体脂肪细胞分化

MicroRNAs(miRNAs) 是一类在脂肪组织发育中发挥重要作用的小非编码RNA. 为探明miR-125a-5p在3T3-L1前体脂肪细胞中的作用,采用实时qPCR检测了miR-125a-5p在小鼠各组织及3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中的表达|使用经化学修饰的miR-125a-5p模拟物agomir及抑制剂antagomir转染3T3-L1前体脂肪细胞,采用实时qPCR 和 Western印迹检测成脂标志基因Pparγ和aP2的表达,油红O染色观察脂肪细胞脂质积累. 结果显示,miR-125-5p在小鼠脂肪组织中高丰度表达,在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中表达下降.过表达miR-125a-5p,与对照组相比,成脂标志基因Pparγ和aP2在mRNA和蛋白质水平均明显下降|油红O染色及定量结果显示脂质积累减少. 抑制剂处理结果显示,Pparγ和aP2在mRNA和蛋白质水平均有不同程度上升,但油红O染色及定量结果差异不显著. 以上结果表明,miR-125a-5p在脂肪细胞分化中发挥负调控作用.