利用精氨酸和缬氨酸设计新型α-螺旋抗菌肽

摘要：【目的】抗菌肽是生命体的自身免疫系统的重要组成部分。其中两性的α-螺旋抗菌肽在抗菌肽家族中又占有重要的地位,发挥着重要的作用。为了得到具有更高抗菌活性同时具有很低细胞毒性的抗菌肽,根据α-螺旋二级结构衍生出来的螺旋轮模型,设计了一条在疏水一侧含有8个缬氨酸和亲水一侧含有5个精氨酸的新型16残基抗菌肽。【方法】测定了设计得到的新型抗菌肽的最小抑菌浓度、对于红细胞和哺乳动物肾细胞的细胞毒性以及杀菌动力学。 【结果】抗菌活性检测表明,新型抗菌肽VGR16显示了强并快速的杀菌作用,其最小抑菌浓度在16－64     

β-发卡抗菌肽的全新设计及其生物学活性

通过缬氨酸和精氨酸的交替连接形成β-发卡结构的两条侧链,D-脯氨酸和甘氨酸形成β-转角单元以及侧链末端的两个半胱氨酸连接形成一个二硫键,来设计得到全新的由16残基构成的β-发卡抗菌肽VR。对设计得到的抗菌肽VR的生物学活性进行了检测,主要测定了新型β-发卡抗菌肽VR的最小杀菌浓度、对红细胞的溶血活性、杀菌动力学和盐敏感性。结果发现,VR和蜂毒素具有相似的杀菌活性,而溶血活性远低于蜂毒素,这表明VR比蜂毒素具有更高的细胞选择性。在NaCl的浓度低于100 mmol/L时,VR的杀菌活性没有受到影响;在NaCl的浓度为100 mmol/L时,VR具有50%的杀菌活性。综上可见,VR具有较优异的生物学活性,拥有成为抗生素替代物的发展潜力。     

苦荞α-螺旋发夹抗菌肽的分子改造抑制植物真菌活性

本研究对来源于苦荞的α-螺旋发夹抗菌肽FtAMP抗真菌机制与结构之间的关系进行了研究。首先人工合成了FtAMP分子中N-端和C-端的α-螺旋(FtAMP-N和FtAMP-C）,探究两个α-螺旋究竟是哪个螺旋在起抗菌作用。然后以FtAMP为模板,α-螺旋区电荷和两亲性特征为变化要素,利用螺旋轮投影和特定氨基酸残基替换的方法,对其进行初步分子改造,并通过对多肽结构和活性比较,探讨FtAMP结构-功能的关系。研究表明,FtAMP-N和FtAMP-C都显示出良好的抗菌活性。根据螺旋轮投影方法分析螺旋的两亲性特征,并以FtAMP氨基酸序列为模板,分别表达4个FtAMP突变体(FtAMP-E12A、FtAMP-E12A/E9K、FtAMP-E12A/E9A和FtAMP-E12A/E9K/T24E）。圆二色光谱分析显示,4个多肽都可正确折叠成α-螺旋结构,在208 nm和222 nm处有典型的双负峰,表明氨基酸的改变及其表达过程中并未改变多肽的二级结构。抗真菌活性分析显示,与FtAMP相比,4种突变体对植物真菌的抑制作用均有一定增强。特别是FtAMP-E12A/E9K突变体,其抗真菌作用增强约1倍,同时诱导溶血活性并不显著,选择特异性提高近2倍。该研究也进一步表明,α-螺旋发夹抗菌肽发挥抗真菌效应主要与其螺旋结构有关,而与其抑制剂的活性位点没有关系,为该类抗菌肽结构和功能的关系提供了一定的参考。     

抗菌肽RIKL的分子设计及生物学活性分析

天然抗菌肽具有较强的杀菌能力,但高生物相容性抗菌肽的构建一直阻碍着该领域的发展.为了提高抗菌肽的选择特异性,通过分子动力学分析探讨了抗菌肽的结构特性,并检测其生物学活性.首先以(RXKY)2(YRY)2 (X代表Ile,Y代表Leu)为模板设计新型抗菌肽分子RIKL.通过圆二色谱(circular dichroism,...     

α-螺旋型抗菌肽结构参数与功能活性的关系

随着耐药病原菌出现,寻求更为安全有效的新型抗菌制剂迫在眉睫。抗菌肽具有广谱抗菌活性,杀菌快,不易产生耐药性等优点,是理想的新型抗菌剂,具有广阔前景。α-螺旋型抗菌肽是抗菌肽中的一大类。本文从α-螺旋型抗菌肽螺旋度,疏水力矩,疏水性,净正电荷数等方面阐述了结构与功能关系,及构效关系在α-螺旋抗菌肽分子设计与改造中的应用。     

肝脏表达的抗菌肽-2

抗菌肽是在多种生物体中表达的具有抗菌活性的肽类物质的总称.肝脏表达的抗菌肽-2(liver-expressed an-timicrobial peptide-2,LEAP-2)在肝脏中产生后分泌到血液中参与血液循环,从而发挥抗菌活性等作用.本文简要介绍LEAP-2的发现过程,对LEAP-2的基因组成、结构、诱导表达机理、抗菌活性以及基因调控等方面的研究进行综述,并展望LEAP-2可能的生理功能.     

杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性测定

为获得溶血活性低、抗菌活性高的杂合抗菌肽,以家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin为母体肽,并结合毕赤酵母偏爱密码子的原则,设计出6条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽,将其命名为CC22、CC28、CC29、CC30和CC34(1),CC34,利用SOE-PCR技术合成所需的目的基因,并将其克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA,通过电击转化技术,将其转化至毕赤酵母SMD1168中,经含有Zeocin的抗性平板筛选阳性转化子,YPD液体培养72h后,经Tricine-SDS-PAGE检测出目的蛋白,然后采用高效液相色谱法对其进行纯化。检测结果显示,表达产物CC29对大肠杆菌、鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)均为25μg/ml;CC34(1)对大肠杆菌表现相对较弱的抑制作用,最小抑菌浓度为100μg/ml;CC34对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为50μg/ml;且杂合抗菌肽对有益菌均没有表现出抑制作用。6条杂合肽的溶血活性均呈现较低水平,其中表现出抗菌活性的3条抗菌肽中,以CC29的溶血活性最低,CC34(1)和CC34相对次之。结合抑菌活性,CC29和CC34的抑菌效果较为明显,从而确定溶血活性低且抗菌活性较高的CC29和CC34为新型杂合抗菌肽。     

大肠杆菌α-溶血素分泌系统基因表达调控研究进展

引起人泌尿道感染的大肠杆菌(UPEC)的α-溶血素分泌系统属于Ⅰ型分泌系统,能够分泌一种RTX毒素蛋白-α-溶血素。近年来α-溶血素分泌系统的应用日益广泛,特别是在减毒活载体疫苗中呈递外源抗原。本分析了大肠杆菌α-溶血素分泌系统的遗传特性,详细介绍了其基因的表达调控,为构建更加有效的分泌型载体提供了理论基础。     

家蝇新型抗菌肽Muscin的基因克隆、表达模式及抑菌活性

【目的】鉴定家蝇 Musca domestica (Linnaeus)中一种新型抗菌肽(Muscin)基因,并分析其功能。【方法】通过数字基因表达谱和生物信息学分析,在家蝇转录组中筛选得到一条抗菌肽基因,命名为 muscin。以实时荧光定量PCR技术研究该基因的组织分布以及用大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus混合细菌刺激后的表达量变化。并对合成肽Muscin进行抑菌活性检测及溶血率测定。【结果】muscin基因cDNA序列全长379 bp,包含完整的开放阅读框153 bp。推导Muscin多肽序列由50个氨基酸残基组成,N端含有由25个氨基酸残基组成的信号肽。成熟肽中富含疏水性氨基酸残基和带正电荷的氨基酸残基,理论等电点为9.39。基因定量结果显示 muscin 基因在血细胞和脂肪体中表达量最高。通过细菌刺激进行免疫诱导后,幼虫体内该基因的表达水平明显上调,并在6 h达到高峰。抑菌和溶血实验显示c-Muscin对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抑菌活性,且溶血活性较低。【结论】Muscin是一种新型的广谱抗菌肽,可能参与家蝇抗菌免疫反应,且具有一定药物开发潜质。     

泥鳅抗菌肽在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性检测

【背景】泥鳅抗菌肽Misgurin是泥鳅非特异性免疫防御系统的重要组成部分,具有广谱和较强的抗菌能力,所以获得大量抗菌肽是很有必要的。【目的】为了实现高效表达泥鳅抗菌肽Misgurin。【方法】将泥鳅抗菌肽的目的基因与p PIC9K表达载体连接,构建重组表达质粒p PIC9K-misgurin,Sal I酶切线性化,再通过电击法将其整合到毕赤酵母SMD1168染色体上。在MD固体培养基挑选阳性克隆子到MD液体培养基中,30°C、200 r/min摇瓶培养96 h,转接到BMMY液体培养基进行诱导表达,每隔24 h加入5%的甲醇。通过比较抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的大小,筛选出活性较高的菌株p PIC9K-misgurin-22。将该菌株在100 L的发酵罐中诱导表达,48 h后进行活性检测。【结果】经Tricine-SDS-PAGE蛋白胶检测和质谱分析鉴定,p PIC9K-misgurin-22菌株诱导表达的活性物质为抗菌肽Misgurin。发酵罐发酵48 h相对于摇瓶发酵48 h,抗大肠杆菌的生物效价提高了1.47倍,抗金黄色葡萄球菌的生物效价提高了1.43倍;抗菌肽Misgurin对鲍曼不动杆菌、沙门氏菌有较弱的抗菌活性,对致病菌产气荚膜梭菌和益生菌如枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、乳酸菌没有抗菌活性,无明显溶血活性;当温度达到90°C时发酵液的抗菌活性明显减弱,调发酵液的p H值在1.0-12.0之间都有抗菌活性;加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K后抗菌活性减弱。【结论】获得了一株在毕赤酵母中表达量较高、有工业化生产潜力的产抗菌肽Misgurin的菌株。     

模拟α-螺旋多肽类似物抑制剂设计的研究进展

抑制剂筛选主要是通过反复、高通量地筛选化合物库,这个过程存在着对已有化合物库的依赖性和一定的机遇性。通过分析蛋白质数据库(PDB)发现,大多数蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)界面以α-螺旋结构为主体。α-螺旋多肽的骨架结构及其热点氨基酸残基(hotspots)为高效理性设计小分子抑制剂提供了模板。对近几年来依据多肽类似物和小分子化合物模拟α-螺旋结构设计抑制剂的研究进展进行了概述,同时对依据模拟α-螺旋设计抑制剂骨架的结构原理进行了讨论。     

天蚕素类抗菌肽分子设计研究进展

天蚕素是一类由31~39个氨基酸残基组成的阳离子型线性α螺旋抗菌肽,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒以及抑制肿瘤细胞等生物活性。天蚕素与传统抗生素作用机制不同,具有不易产生耐药性的特点,因此成为解决传统抗生素多重耐药性问题的一个新突破口。然而,天蚕素在抗菌活性、选择性、毒性以及稳定性等方面还存在诸多问题,并且天然天蚕素提取工艺复杂,成本较高,不适合大规模生产,其对细菌的高毒性也限制了原核工程菌的使用。近年来多肽分子设计的研究方法颇受青睐,为解决多肽物质诸多问题开辟了新的途径。针对天蚕素类抗菌肽研究过程中面临的主要问题综述了其分子设计的研究进展。     

生肌螺旋-环-螺旋蛋白

HLH 蛋白是近几年来发现的一类 DNA 结合蛋白,其分子中含有一螺旋-环-螺旋(HLH)结构.至今,其家族成员已超过20个,它们参与转录调节、细胞癌变以及细胞分化等过程.骨骼肌发育成熟的各个阶段均受到特异生肌转录调节蛋白因子的控制.这些因子包括 Myo D1,myogenin 以及 Myf-5等,它们均系 HLH 家族成员,在生肌过程中起非常重要作用.     

鹰嘴豆种子发芽和成熟过程中α-淀粉酶抑制剂的活性研究

以5种不同来源的α-淀粉酶为检测试剂,对鹰嘴豆种胚芽和子叶α-淀粉酶抑制剂在发芽和成熟过程中的抑制活性进行测定。结果表明:α-淀粉酶抑制剂主要存在于胚芽中; 发芽过程中,发芽1 d后,胚芽提取液对AOA的抑制活性降为9.9%,而对HSA、PPA和PA的抑制活性都检测不到。子叶提取液对AOA和HSA的抑制活性分别降为21.5%和28.3%,而对BSA和PPA则检测不到活性。发芽4 d后,无论是子叶还是胚芽提取液对5种来源的α-淀粉酶都检测不到抑制活性; 种子成熟过程中,子叶和胚芽提取液对α-淀粉酶的抑制活性均随种子成熟度的提高而提高,30 d时达到最大,且胚芽提取液对HSA、PA的抑制活性较高,分别为48.9%和47.5%。     

柞蚕抗菌肽D中精氨酸、赖氨酸和色氨酸等氨基酸残基的化学修饰

用不同的化学试剂修饰了柞蚕抗菌肽D分子中的色氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸残基。NBS修饰抗菌肽D,以及氨肽酶M对抗菌肽D作用的结果表明色氨酸残基对抗菌肽D抑制E.coli D31的作用影响不大。CHD和MLH对精氨酸和赖氨酸残基的修饰,导致抗菌肽D失去抑制E.coli的作用,但可逆地消除CHD和MLH的修饰作用后,抗菌肽D恢复了对E.coli D31的抑菌作用。这些结果初步认为,抗菌肽D抑菌作用与分子中的荷电性有关,改变了分子的电荷,也就同时失去了其抑菌功能。 此外,对精氨酸残基修饰的结果还表明,抗菌肽D的免疫原性与精氨酸残基有关。但是,抗菌肽D的免疫决定簇与其生物活性中心并不完全平行。     

温度对枯草芽胞杆菌α-淀粉酶活性的影响

目的：探讨温度对枯草芽胞杆菌分解淀粉的影响,找出α-淀粉酶活性区问。方法：设淀粉实验组及无淀粉对照组。接种枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌4组16管,空白对照、实验管4组8管,15℃、25℃、37℃、40℃温箱连续培养,测量不同时间段内pH值及酶活值,观察颜色的变化。结果：在15℃～40℃下温度越高接种管颜色、pH值、透光度变化越明显。结论：温度对枯草芽胞杆菌。一淀粉酶活性影响较大,尤其在25℃～40℃区间内分解淀粉能力很强,这为选择微生物法解决淀粉导致的水源富营养化提供了依据．也是可行的。     

利用ELP自断裂标签在大肠杆菌中生产抗菌肽Oxysterlin 1

抗菌肽是目前最有希望的抗生素替代品,但是使用重组技术生产抗菌肽的策略大多步骤烦琐且价格昂贵,不利于抗菌肽的规模化生产.Oxysterlin 1是一种新型的天蚕素抗菌肽,主要对革兰氏阴性菌有抗菌活性,具有较低的细胞毒性.文中利用一种简单经济的方法在大肠杆菌中实现Oxysterlin 1的表达和纯化.将Oxysterlin...     

抗菌肽SMAP-29结构功能及分子设计策略

抗菌肽是生物体内产生的一种具有生物活性的小分子多肽,具有广谱抗细菌、抗病毒、抗真菌甚至抗癌作用。SMAP-29是来源于绵羊骨髓细胞,包含29个氨基酸的Cathelicidin类α-螺旋结构抗菌肽。SMAP-29具有多种生物活性,包括抗革兰氏阳/阴性菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫、抗螺旋体、抗衣原体和中和内毒素活性,并且具有作用机制独特、快速杀灭细菌的特点。以下综述了SMAP-29抗菌肽家族的基因和蛋白结构、结构与活性关系、作用机制、生物功能、基因重组表达,重点阐述了SMAP-29结构、分子设计的必要性和基于     

α-螺旋跨膜蛋白拓扑结构预测方法的评价

在基因组数据中,有20%～30%的产物被预测为跨膜蛋白,本文通过对膜蛋白拓扑结构预测方法进行分析,并评价其结果,为选择更合适的拓扑结构预测方法预测膜蛋白结构。通过对目前已有的拓扑结构预测方法的评价分析,可以为我们在实际工作中提供重要的参考。比如对一个未知拓扑结构的跨膜蛋白序列,我们可以先进行是否含有信号肽的预测,参考Polyphobius和SignalP两种方法,若两种方法预测结果不一致,综合上述对两种方法的评价,Polyphobius预测的综合能力较好,可取其预测的结果,一旦确定含有信号肽,则N端必然位于膜外侧。然后结合序列的长度,判断蛋白是单跨膜还是多重跨膜,即可参照上述评价结果,选择合适的拓扑结构预测方法进行预测。