CpG ODN增强rHBsAg疫苗对小鼠免疫应答影响的研究

通过CpG寡核苷酸(CpG ODN)与重组HBsAg蛋白疫苗(rHBsAg)联合免疫C57BL/6BL/6小鼠,观察CpG ODN对小鼠免疫状况的影响。试验分对照、乙肝疫苗以及用乙肝疫苗加CpG三组,MTT法分别进行HBsAg特异性刺激淋巴细胞转化试验、HBsAg特异性刺激细胞毒性T细胞杀伤试验、自然杀伤细胞非特异性杀伤试验,以及ConA刺激淋巴细胞转化试验;ELISA测定HBsAb、INF-γ、IL-12和IL-4结果中,疫苗加CpG组抗原特异性转化试验指数为4.05±0.31;疫苗加CpG组抗原特异性CTL率为82.27±22.64,在统计学上差异显著(P<0.05);而HBsAb、INF-γ、IL-12的结果分别为51.85±14.41、802.25±104.25和373.62±66.58,与对照组及疫苗组比较,差异显著(P<0.05)。CpG ODN能作为一种新的免疫佐剂更好地增强重组乙肝表面抗原蛋白疫苗诱导小鼠产生高效的体液和细胞免疫应答。     

肺炎链球菌ΔA146Ply蛋白抵抗鼻咽部感染的研究

本研究旨在研究无佐剂添加的肺炎链球菌ΔA146Ply蛋白的免疫保护作用。利用大肠杆菌原核表达系统成功表达ΔA146Ply后用Ni2+柱纯化并去除内毒素。将ΔA146Ply蛋白刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)24 h后收集细胞上清,检测得细胞因子IL-6、TNF-α、IL-12p70分泌显著增加。以无佐剂添加的ΔA146Ply、加Al佐剂的ΔA146Ply及PBS分别免疫小鼠后,采用ELISA试剂盒检测血清特异性抗体效价,结果显示含ΔA146Ply的免疫组小鼠的抗体效价较PBS组显著升高,而加Al佐剂组与无Al佐剂组之间无显著差异;取脾细胞再刺激后收集细胞上清,测得含ΔA146Ply的免疫组小鼠的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17A分泌量较PBS免疫组显著增高,加Al佐剂的ΔA146Ply免疫组的IFN-γ和IL-17A分泌量较无Al佐剂的ΔA146Ply免疫组显著增高,但IL-4的分泌二者无显著差异。末次免疫后鼻腔攻毒肺炎链球菌CMCC31693(19F),3 d后铺板计细菌载量,结果显示无佐剂ΔA146Ply免疫组小鼠的鼻咽部及肺部定植细菌较PBS组显著减少,而加Al佐剂组只有肺部定植细菌的减少且与无佐剂ΔA146Ply免疫组无差异。HE染色和炎症细胞因子检测结果显示,含ΔA146Ply免疫组的小鼠肺部炎症反应都较PBS组显著减轻。这些结果显示ΔA146Ply无需Al佐剂辅助即可诱导小鼠产生较强的免疫效应,有效抵抗肺炎链球菌的鼻咽部感染。     

佐剂CpG-ODN与重组HBsAg疫苗联合免疫乙型肝炎病毒转基因小鼠的免疫应答研究

目的 以CpG-ODN为佐剂与重组HBsAg(rHBsAg)疫苗合用,研究其对乙型肝炎病毒转基因(HBV Tg)小鼠模型的免疫应答效果.方法 40只HBV Tg小鼠随机分为4组,每组小鼠分别注射rHBsAg疫苗(单用rHBsAg组)、rHBsAg疫苗+CpG-ODN(试验组)、rIFNα-2b(IFN组)、生理盐水(对照组).经多次免疫HBV转基因小鼠,于免疫前、后不同时间采血,动态观察各组小鼠血清中HBsAg量、抗-HBs阳性率和HBV DNA的变化,检测肝组织中HBsAg的表达.检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群和白细胞介素2(IL-2)、IL-12(p70)以及γ干扰素(IFN-γ)的含量,分别检测免疫小鼠的脾细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤功能并计算各组小鼠肝组织活性指数(HAI).结果 rHBsAg组和rHBsAg+CpG组在免疫小鼠后2周100%诱导抗-HBs;rHBsAg+CpG组能显著降低血清中的HBsAg量或使HBsAg转阴,rHBsAg+CpG组肝组织中HBsAg的表达量与血清中一样降低,并降低血清中HBV DNA的拷贝数.rHBsAg组的CD3+、CD4+、CD8+细胞在T细胞中所占百分比,IL-2、IL-12(p70)和IFN-γ的含量以及淋巴细胞特异性增殖和杀伤效应均明显高于对照组(P＜0.05).rHBsAg+CpG组与rHBsAg组比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞应答(P＜0.05),且以Th1型细胞免疫应答为主.在rHBsAg+CpG组肝组织中出现大量淋巴细胞,肝脏的HAI在4个组中最高.结论 CpG-ODN作为佐剂可以增强重组HBsAg疫苗诱导HBV转基因小鼠产生抗病毒免疫应答,重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN可作为免疫治疗慢性HBV感染的可行性途经.     

呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病小鼠模型的建立与评价

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是导致婴幼儿严重下呼吸道感染的最重要病原体,但该病毒的灭活疫苗可引起RSV疫苗增强性疾病(RSV vaccine-enhanced disease,RVED),因此至今仍未研制出安全、有效的疫苗。RVED的发生机制目前仍不清楚。使用能有效模拟RVED的动物模型是探索RVED发生机制的主要手段,而本研究的目的就是建立能稳定模拟RVED表现的小鼠模型。将BALB/c小鼠分成3组,即甲醛灭活RSV疫苗接种组(FV组)、活RSV接种组(VV组)和对照组(BV组),并模拟自然感染对其攻毒。通过小鼠体重监测、肺组织苏木精-伊红染色、荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、流式细胞术等,观察FV组小鼠感染RSV后的病毒载量、肺部炎症和T细胞免疫状态。结果显示,与VV组和BV组相比,FV组小鼠RSV攻毒后的体重占初始体重百分比显著降低,肺部炎症最明显,且仅FV组出现支气管和毛细血管周围有大量淋巴细胞浸润及嗜酸性粒细胞浸润。荧光定量PCR显示,FV组小鼠的肺部RSV载量最低。流式细胞术显示,攻毒4d后FV组CD~(4+) T细胞数与其他两组相比显著增加,且CD~(4+) T细胞分泌的白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)及IL-4/γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)比值显著高于其他两组,而CD~(8+) T细胞分泌的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和IFN-γ低于VV组。结果提示,RVED小鼠呈现出Th2优势型免疫应答及CD~(8+) T细胞功能不足,模型初步建立成功,为RVED发生机制的探索和RSV疫苗的研发奠定了良好基础。     

汉滩病毒核蛋白CTL表位肽联合不同免疫佐剂的免疫学特性研究

目的:研究汉滩病毒(HTNV)核蛋白细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽联合不同免疫佐剂免疫C57BL/6小鼠后的免疫学特性,确立一种免疫效果良好的多肽免疫C57BL/6小鼠方案。方法:分别用氢氧化铝、弗氏佐剂和脂质体作为免疫佐剂与汉滩病毒核衣壳蛋白上的CTL表位肽段混合,经皮下注射免疫C57BL/6小鼠,共免疫3次,每次间隔2周;免疫结束后分离小鼠脾细胞,并分别采用ELISPOT和CTL杀伤试验进行检测。结果:HTNV核蛋白CTL表位肽联合弗氏佐剂加脂质体组小鼠脾细胞分泌IFN-γ能力和CTL杀伤能力优于其他各实验组(P0.01)。结论:HTNVCTL表位肽联合弗氏佐剂加脂质体免疫C57BL/6小鼠效果最佳,可为HTNV多肽疫苗的免疫策略提供参考。     

新型冠状病毒Omicron BA.4/5变异株RBD-Fc蛋白的表达及其免疫效果的评价

本研究针对新冠病毒Omicron BA.4/5的受体结合域（Receptor binding domain, RBD）构建一个连接Fc受体的二聚体蛋白BA.4/5-RBD-Fc(BRF)并评价其免疫原性。结果显示，两种佐剂组小鼠的二免后血清均可产生高滴度的IgG抗体且显著高于一免后血清（P<0.0001）,BRF+AlOH/CpG组小鼠血清产生较为平衡的IgG1和IgG2a抗体应答，而BRF+BFA03组小鼠血清能产生更多的偏向Th2应答的IgG1抗体，且IgG1/IgG2a比值显著高于BRF+AlOH/CpG组（P<0.0001）。BRF+AlOH/CpG组产生的Th1应答的细胞因子干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)高于BRF+BFA03组（P<0.01），而产生的Th2应答细胞因子白介素4(Interleukin-4,IL-4)IL-4显著低于BRF+BFA03组（P<0.01）。BRF蛋白结合不同佐剂两次免疫小鼠后的血清均可以有效中和目前Omicron主要的流行亚型BA.2与BA.4活病毒，产生高达19 334 598和17 224 096的...     

不同佐剂对含S+PreS1融合抗原的乙型肝炎病毒颗粒疫苗免疫原性的影响

本研究在前期工作基础上,用CHO细胞表达的含PreS1+S融合抗原的新型基因工程HBV颗粒疫苗(HBSS1)与Al(OH)3、CpG及CpG+Al(OH)3等佐剂配伍,在Balb/C小鼠模型上研究不同佐剂对HBV颗粒疫苗肌肉注射后免疫应答的影响,主要包括抗体滴度、抗体亚型分类及特异性细胞免疫(γ-IFNELISpot检测)。结果表明:CpG佐剂结合HBSS1颗粒疫苗可快速诱导(单针免疫)高水平的抗PreS1及S抗体,IgG2a/IgG1比率1,同时可诱导较高抗原特异的细胞免疫应答;Al(OH)3+CpG双佐剂组一次免疫后可诱导产生最高的抗S抗体滴度(1:105),其产生的抗体亚类包括IgG1、IgG2a与IgG2b;在S抗原N端(13~49aa)存在优势CTL表位。结论:CpG佐剂结合HBSS1颗粒疫苗应是发展新型治疗性乙肝疫苗的较佳选项。     

超抗原SEA增强小鼠对HBV DNA 疫苗的免疫反应

观察超抗原SEA(D227A)的真核表达载体(pmSEA),对HBVDNA疫苗诱导Balbc小鼠(H2d)免疫应答的调节作用。肌内注射空载体pcDNA3、HBVDNA疫苗加pmSEA佐剂(pHBVS2S+pmSEA)或不加佐剂(pHBVS2S);ELISA法测定血清抗HBs;ELISPOT检测分泌IFNγ的脾淋巴细胞;4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL活性。HBVDNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度明显高于不加佐剂组,其IgG1IgG2a的比例不同于多肽免疫组,二者分别为0.282与10。HBVDNA佐剂组均能增强IgG1和IgG2a的产生,是不加佐剂组的1.36、1.73倍。佐剂组小鼠脾淋巴细胞IFNγ的分泌量是不加佐剂组2～3倍。CTL细胞杀伤活性(E:T=100)佐剂组与不加佐剂组分别为:69.77%±7.5%、42.81%±7.7%,差异显著(P<0.05)。HBVDNA疫苗具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生特异性的抗体及CTL反应;pmSEA佐剂能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答,有望成为DNA疫苗的免疫佐剂。     

纳米复合佐剂的抗肿瘤免疫调控作用及效果研究

目的:探究纳米复合佐剂在肿瘤内的免疫调控作用及抗肿瘤效果。方法:制备包载CpG的β葡聚糖纳米颗粒(CNP),体外培养小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDC),分5组进行体外免疫处理,分别为PBS对照组、β葡聚糖组、β葡聚糖纳米载体(NP)组、CpG组和CNP组,利用流式仪分析BMDC成熟情况。将体外培养的黑色素瘤B16F10细胞接种于C57BL/6N小鼠右后肢皮下,建立肿瘤模型,第6 d挑选肿瘤大小相对一致的24只小鼠均分为4组,即PBS组、NP组、CpG组、CNP组进行治疗,后颈部皮下注射给药,共给药4次,每次间隔3 d,期间隔天测量肿瘤体积,最后一次给药后第3 d眼眶取血,测定血浆中γ干扰素(IFN-γ)浓度,处死小鼠后分离肿瘤及脾脏,流式细胞术检测瘤内浸润性T淋巴细胞比例及脾脏内T细胞比例。结果:CNP佐剂处理后BMDC成熟比例约为CpG佐剂组的2.8倍。在小鼠体内接种肿瘤15 d后,CNP治疗组肿瘤体积较其他组均减小,血浆中IFN-γ含量显著高于其他实验组,约为CpG组的1.5倍,肿瘤浸润性T淋巴细胞与其他组相比也有明显升高。结论:构建的葡聚糖-CpG纳米复合佐剂能够有效激活BMDC,改善肿瘤微环境,具有良好的体内抗肿瘤效果。     

GM-CSF作为Ⅱ型登革病毒E蛋白免疫佐剂的免疫效果观察

目的观察粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)作为II型登革病毒E蛋白免疫佐剂的保护效果,评估GM-CSF作为蛋白疫苗免疫佐剂的可行性。方法提取GM-CSF质粒(pCAG-GM)、将表达II型登革病毒E蛋白的重组质粒(E/pGEX-6P-1)进行诱导,表达产物用亲和层析纯化。将BALB/c小鼠随机分为E蛋白组、佐剂组(E蛋白+GM-CSF)和对照组进行免疫,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体终点效价;采用蚀斑减少中和试验(PRNT)检测II型登革病毒中和抗体水平;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测小鼠免疫后细胞因子的水平;用攻毒试验观察各组小鼠保护率。结果 E蛋白组和佐剂组小鼠血清中抗体终点效价、中和抗体水平均在免疫后有一定的升高,差异无统计学意义(P0.05);佐剂组细胞因子(IFN-γ和IL-10)水平较E蛋白组均有明显上升,差异具有统计学意义(P0.05);但攻毒试验显示,佐剂组小鼠全部死亡,生存率为0,而E蛋白组的小鼠保护率为33%。结论 GM-CSF免疫佐剂可抑制II型登革病毒E蛋白的免疫保护作用,其作为蛋白疫苗免疫佐剂仍需慎重。