鞍带石斑鱼精子诱导斜带石斑鱼雌核生殖

石斑鱼性成熟时间长和雌雄同体的特性延长了其育种的周期, 采用人工雌核生殖策略能够显著提高选育效率。研究筛选了鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)精子人工诱导斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)雌核生殖的最佳条件, 并通过形态学、流式细胞术和微卫星分子标记等方法进行鉴定。结果显示, 灭活的异源精子可成功诱导斜带石斑鱼人工雌核生殖, 精子灭活的最佳紫外照射强度为518 mJ/cm2; 卵子受精后6min在4—6℃的条件下进行冷休克处理, 可获得最优的40%的表观受精率(卵子正常分裂比率)和29.7%的孵化率, 而未冷休克的对照组具有83.5%的表观受精率和80%的单倍体率。多重比较结果表明, 在表观受精率方面人工诱导的时间差异(P=0.579)和水温差异(P=0.133)并不显著; 而在孵化率上, 处理时间组间差异极显著(P=0.002), 而在水温组中差异不显著(P=0.396)。胚胎发育结果显示, 人工雌核生殖诱导会导致孵化率降低, 单倍体胚胎出现明显的发育障碍。微卫星分子标记鉴定结果显示, 石斑鱼人工雌核生殖子代的遗传物质大部分来自于母本, 同时也存在异精效应。     

斜带石斑鱼仔鱼变态过程中甲状腺的发育变化

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)属鲈形目,科,石斑鱼属,为暖水性中下层鱼类,是我国南方沿海重要的经济养殖鱼类。长期以来,许多海水鱼仔稚鱼培育阶段的一大难题是成活率低1。目前斜带石斑鱼的大规模苗种培育仍未很好解决,仔鱼经历第二背鳍棘从生长到吸收的变态过程时死亡率很高。       

点带石斑鱼的亲鱼培育、产卵受精和胚胎发育

在水泥池人工养殖条件下,对人工诱导性逆转的“功能性雄性”、天然雄性及天然雌性点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)亲鱼进行强化培育,自然产卵受精。2002年繁殖季节,共获3cm以上的点带石斑鱼苗145万尾。亲鱼培育、产卵受精和胚胎发育的程序：(1)经过强化培育的亲鱼,自然产卵受精,受精率平均81％,最高97％;(2)成熟的“人工变性雄鱼”的精子头部呈球型,精子头径约3．7—6．1gm,尾长12．4～44．5μm;在水温26℃、盐度3％、pH7．9条件下,精子游动时间最长超过58min,精液中90％精子在31min停止游动,与天然雄亲鱼的精子无异,可作为生产雄亲鱼的来源;(3)在东山岛,产卵期由4月初持续到11月中旬,产卵高潮集中在4月底至5月底、9月底至10月初。在24h内,自然产卵通常从16：30持续到次日1：30;(4)产卵适宜水温为23．5—28．6℃,最适产卵水温为25．5—26．5℃;(5)水温26℃时,受精卵在盐度2．82％～2．96％,的海水中呈悬浮状态,盐度2．82％以下时下沉,盐度2．96％以上时上浮;(6)在水温24．9—27．6℃、盐度3％—3．3％、pH7．6—8．2的情况下,胚胎发育时间为21h。     

异源精子诱导稀有鮈鲫的人工雌核发育

用经过紫外线灭活的异源精子启动稀有鮈鲫卵子发育,再经过热休克分别抑制极体排放和第一次卵裂,得到了极体雌核发育和有丝分裂雌核发育的存活个体。通过正交试验确定诱导极体雌核发育的最佳参数为受精后2min、40℃休克处理2min;诱导有丝分裂雌核发育的最佳参数为受精后17min、40℃休克处理2min。雌核发育个体的形态学特征没有显示出受到父本影响的迹象。RAPD分析表明雌核发育个体扩增片段全部来自于母本,没有发现异源父本DNA成分进入稀有鮈鲫基因组的迹象。实验中还发现,鲤×稀有鮈鲫的正常杂交组合能以极低的几率产生出雌核发育的稀有鮈鲫。     

异源四倍体鲫鲤的受精细胞学

异源四倍体鲫鲤的成熟卵子处于第二次减数分裂中期,精子通过受精孔进入卵内.精子入卵以后,受精孔立即被受精塞堵住.受精后8 min,受精卵出现明显的精子星光,同时进入第二次减数分裂后期,即将排出第二极体;13 min时,精子头部开始膨胀,趋向核化;18 min时,雌雄原核均已形成,并向胚盘中央靠近;23 min时,雌、雄原核开始接触;33 min时,雌、雄原核完全融合成为一个合子核;38 min时,受精卵开始第一次卵裂,53 min后分裂形成两个子核.该研究证明异源四倍体鲫鲤和大多数二倍体鱼一样,具有正常的受精细胞学程序,受精方式为单精受精.     

异源四倍体鲫鲤的受精细胞学

异源四倍体鲫鲤的成熟卵子处于第二次减数分裂中期,精子通过受精孔进入卵内。精子入卵以来,受精孔立即被受精塞堵住。受精后8min,受精卵出现明显的精子星光,同时进入第二次减数分裂后期,即将排出第二极体;13min时,精子头部开始膨胀,趋向核化;18min时,雌雄原核均已形成,并向胚盘中央靠近;23min时,雌,雄原核开始接触;33min时,雌,雄原核完全融合成为一个合子核;38min时,受精卵开始第一次卵裂,53min后分裂形成两个子核。该研究证明异源四倍体鲫鲤和大多数二倍体鱼一样,具有正常的受精细胞学程序,受精方式为单精受精。     

彭泽鲫雌核发育的细胞学研究

通过对彭泽鲫♀×彭泽鲫♂、彭泽鲫♀×尖鳍鲤♂“杂交”后代的细胞学观察发现 ,同源与异源精子在彭泽鲫卵中的发育情况基本一致。精子入卵后一般呈固缩状态 ,不解凝 ,不形成雄性原核 ,但都能看到未解凝精核与雌性原核接触 (未融合 )的现象。刚产出的成熟卵子没有看到极体 ,但受精 1 0分钟有极体排出 ,是卵子发育排出的惟一极体。根据观察结果 ,彭泽鲫在细胞学上表现出典型的雌核发育行为特征 ,是以雌核发育方式繁殖的种群     

9种石斑鱼遗传多样性和系统发生关系的微卫星分析

利用实验室克隆的13个青石斑鱼微卫星分子标记, 对中国南海海域9种石斑鱼(青石斑鱼、蜂巢石斑鱼、鲑点石斑鱼、黑边石斑鱼、鞍带石斑鱼、赤点石斑鱼、七带石斑鱼、斜带石斑鱼和棕点石斑鱼)进行了遗传多样性和系统发生关系的分析。研究结果显示, 13个微卫星标记共检测到了84个等位基因, 9种石斑鱼中的平均等位基因数、平均多态信息含量(PIC)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)和平均Hardy-Weinberg遗传偏离指数(D)分别在2.69~5.38、0.1976~0.4267、0.4615~0.6239、0.3510~0.4754和0.1097~0.2836之间变动, 说明9种石斑鱼的遗传多样性都处于中等水平。用NJ法进行聚类分析的结果将9种石斑鱼分为3个支系：斜带石斑鱼、棕点石斑鱼和鞍带石斑鱼为第1支; 青石斑鱼、赤点石斑鱼和七带石斑鱼为第2支系; 蜂巢石斑鱼、黑边石斑鱼和鲑点石斑鱼为第3支系, 该支系与第2支系的关系较近。本研究支持将宽额鲈(鞍带石斑鱼)归入石斑鱼属。     

重组斜带石斑鱼生长激素及其抗血清在放射免疫测定中的应用

将斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)生长激素成熟多肽cDNA序列克隆到质粒pRSET,与6x组氨酸等原核编码序列融合获得重组质粒pRGH6,转入大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达,表达量占细菌总蛋白的43％。免疫印迹证明表达产物为含斜带石斑鱼生长激素的融合蛋白,Ni^2 亲合层析柱纯化融合蛋白,以此为抗原免疫家兔制备特异性的抗血清。以纯化的重组生长激素和特异性的抗血清建立斜带石斑鱼生长激素的放射免疫测定法,该方法的灵敏度、特异性和重复性均达到测定血液生长激素的水平。研究了多巴胺的受体激动剂阿扑吗啡对静态孵育斜带石斑鱼脑垂体碎片释放生长激素的影响,结果表明,阿扑吗啡能以剂量依存方式促进斜带石斑鱼垂体释放生长激素。     

南方鲇受精细胞学观察

对17℃和24℃水温条件下受精的南方鲇Silurus meridionalis受精卵进行了细胞学观察.结果表明,南方鲇属于单精入卵、单精受精,在17℃的水温条件下,受精后约20 s精子进入卵子细胞质,受精后20 min左右卵子形成第2极体,并排出体外,受精后25 min左右雌雄原核形成,40～45 min雌雄原核开始接触并部分融合,50 min雌雄原核完全融合形成合子核.24℃条件下除了雌雄原核的形成和融合的时间早一些外,其他受精细胞学程序与17℃基本一致.     

人工诱导泥鳅雌核发育的细胞学研究和诱导参数优化

为培育泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)全雌品种,研究通过细胞荧光染色后进行细胞学观察确定人工诱导泥鳅雌核发育的热休克起始时间,并进一步利用核型和流式细胞分析等方法对人工诱导雌核发育泥鳅进行鉴定。结果显示,二倍体泥鳅受到灭活的鲤(Cyprinus carpio)精子刺激后,第二极体与卵核分开的时间在人工授精后3—5min;卵子在人工授精后3.5min后再热休克2min的诱导孵化率达到10.26%。通过分析野生型泥鳅胚胎、人工诱导雌核发育泥鳅胚胎、泥鳅×鲤杂交胚胎和单倍体泥鳅胚胎的发育,发现部分雌核发育的胚胎可以正常发育,而杂交胚胎和单倍体胚胎会出现明显的发育障碍。核型和流式细胞检测分析表明利用本研究获得的热休克参数进行处理可得到二倍体雌核发育子代,二倍率达64.71%。研究从细胞学层面获得泥鳅雌核发育的诱导参数,可为利用人工诱导雌核发育开展全雌泥鳅育种提供指导。     

泥鳅精子和卵子结构及受精过程的细胞学观察

研究旨在探讨泥鳅精子受精时限及为其人工繁殖提供基础资料。采用光镜、电镜技术对泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）精子、卵子和不同时间段的受精卵进行了观察。结果显示:泥鳅精子头部无顶体,主要为核占据,核凹窝较浅,中段具不对称的袖套,尾部轴丝为9+2结构,无侧鳍。卵子动物极卵膜仅有一受精孔,受精孔为深凹陷、短孔道型。在20-21℃水温条件下,授精后3s,精子开始穿过精孔管或已经进入卵子;授精后5-8s,形成精子星光;授精后70s,卵子处于第二次减数分裂后期;授精后6-8min,第二极体形成,等待排出;授精后20-25min,雌雄原核融合;授精后25-30min,受精卵进入第一次有丝分裂中期;授精后40-45min,第一次有丝分裂结束,二细胞形成。研究表明:成熟卵子精孔管内口径（2.2860.364）m,而精子头部直径与其接近,单精受精;入水后150s内可受精。     

罗氏沼虾四倍体诱导的研究

对罗氏沼虾卵子极体排出时间和第一次卵裂时间进行了观察,并在此基础上,采用热休克和细胞松弛素 B(C,B)两种诱导方法成功诱导出了罗氏沼虾四倍体。石蜡切片显示,当罗氏沼虾卵子完全成熟时,第一极体已经 排出。第二极体排出的时间约在受精后55min。经过雌性原核和雄性原核的联会,第一次卵裂的时间约在受精后 210-230min。设计了多种处理条件,其中热休克诱导罗氏沼虾四倍体的最好条件是:受精后210min,用40℃水温处 理胚胎1．5min,在这种条件下,最高可以得到35．86％的四倍体率;而C．B诱导罗氏沼虾四倍体的最好条件是:受精 后230min,用1．0mg/L的C．B处理胚胎10min,此时最高四倍体诱导率达33．78％。     

体重对斜带石斑鱼能量收支的影响

鱼类能量学是研究能量在鱼体内转换的学科,其核心问题之一是能量收支各组分之间的定量关系及其各种因子(如温度[1—5]、盐度[6]、体重[7—11]、性别[12]、摄食水平[13—18]、饵料种类[19,20]等)的影响作用。欧美等发达国家对鱼类能量学研究起步较早,迄今已经初步建立了多种鱼类的能量收支模式[21,22];国内在该领域较系统的研究起始于90年代初[23—25],主要局限于淡水鱼类,近年来又对海水鱼类进行了大量研究[26]。斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)俗称青斑,为暖水性中下层鱼类,是广东省海水网箱养殖的主要品种之一。斜带石斑鱼分布于西太平洋的硫球群岛、澳大利亚以及贝劳和菲济群岛的东部,常栖息于大陆沿岸和大岛屿,但在河口和离岸100m深的水域中也可发现[27]。通过本项研究将有助于揭示海洋暖水性中下层鱼类的能量学特征。1材料与方法1·1材料来源与驯养实验用斜带石斑鱼,采自广东省大亚湾水产试验中心。实验用斜带石斑鱼经淡水浸泡10min后,置于室内容积0·5t桶内驯养,待摄食和生长趋于正常后,开始实验。驯化时间为30d。实验于2006年10—11月在广东省大亚湾水产试验中心进行。1...     

斜带石斑鱼TLR3基因的克隆及其在刺激隐核虫感染时的表达分析

TLR3(Toll like receptor 3)是Toll样受体家族的重要成员,通过识别病原相关分子模式,诱导宿主天然免疫应答。研究从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)中克隆得到TLR3 cDNA序列,全长为2937 bp,包括107bp的5′非编码区、100 bp的3′非编码区和编码909个氨基酸的2730 bp的开放阅读框。TLR3全长氨基酸序列包含1个信号肽、18个富含亮氨酸的重复序列(Leucine-rich Repeat LRR)、1个跨膜结构域和1个胞内TIR结构域(IL-R1 homologous region)。同源比对显示,斜带石斑鱼TLR3与其他已报道硬骨鱼类的TLR3具有较高的同源性(52%—67%)。组织表达分析显示,TLR3在健康斜带石斑鱼的组织中具有较广的表达分布,其中在前脑、体肾和脾脏中表达量较高。刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染斜带石斑鱼后:在皮肤中TLR3的表达量呈现先降低后升高的趋势,从感染后第7天开始上调,并在第10天达到高峰;而在脾脏中,TLR3的表达量在感染6h时就显著上调并达到峰值。结果表明斜带石斑鱼TLR3在抗刺激隐核虫的免疫应答过程中可能发挥重要作用。     

人工诱导南方鲇雌核发育的最适参数

用紫外线照射南方鲇(Silurus meridionalis)精子,用遗传失活的精子人工授精,采用热休克方法抑制南方鲇第二极体的排出。根据热休克起始时间、持续时间和休克温度三因子三水平设计正交试验,探索获得人工诱导南方鲇雌核发育的最理想条件。结果表明,紫外线照射精子15 min,热休克起始时间为受精后5 min,持续时间为1 min,休克温度为41℃,对人工诱导南方鲇雌核发育最有利。该实验为进一步分析人工繁殖南方鲇的雌化机制以及南方鲇性别决定的分子机制奠定了基础。     

点带石斑鱼染色体显带技术及其描绘研究

点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)属于鲈形目, 科、石斑鱼亚科、石斑鱼属, 是中国东南沿海暖水性礁栖的名贵海产经济鱼类. 采用PHA活体注射结合秋水仙素培养, 取点带石斑鱼全肾, 低渗处理, 空气干燥制片法制作染色体标本, 利用Alu I 限制性内切酶介导的原位切口平移显带技术, 在点带石斑鱼有丝分裂中期染色体上诱导出带纹清晰、分散良好的多重带. 结果显示, 多数染色体显现出8-10条带纹, 最少的一对染色体也有4条带纹, 同源染色体带纹基本一致, 在每对染色体上的数目及其分布具明显特征性且相对稳定, 同时发现不同分裂相的同一号染色体上, 特征带纹鲜明一致, 带纹数目基本吻合, 具有可重复性和可操作性; 然后用人X和Y染色体文库特异DNA为探针, 对点带石斑鱼的有丝分裂中期分裂相染色体进行了描绘研究. 结果表明, 点带石斑鱼染色体组中测出了人X染色体特异DNA同源片段的3个保守同线群, 分别在点带石斑鱼的第7、第13和第22号同源染色体上, 它们的杂交信号最近边距着丝粒的百分比距离分别大约为62.3%、43.4%及44.4%; 人X染色质同源片段的大小约占点带石斑鱼基因组的4.63％. 但用人Y染色体DNA描绘点带石斑鱼染色体时, 没有检测出可见的同源片段. 研究结果可以为从低等脊椎动物到人类性染色体的进化过程提供一种新的研究思路.       

草鱼人工雌核发育的细胞学观察

运用组织学方法研究了用紫外线辐射处理后的鲤鱼精子诱导草鱼卵子雌核发育的细胞学过程。结果表明精核在卵子内主要有２种变种（１）始终保持固缩状态,不形成雄性原核;（２）形成雄性原核。冷休克处理可破坏卵子第二次成熟分裂的纺锤体。冷休克处理后,室温孵化期卵子内变化有２种（１）卵子内重新形成了纺锤体和纺锤丝,其中部分卵子可排出第二极体;（２）卵子内纺锤体或纺锤丝不恢复。     

文蛤受精及早期胚胎发育过程的细胞学观察

用普通光镜、荧光显微镜技术和石蜡切片技术三种方法,对文蛤卵在受精及早期胚胎发育过程中的外形和核相变化进行了详细观察。结果表明:文蛤成熟未受精卵呈圆球形,直径90.06μm±5.59μm,核相处于第一次成熟分裂中期;精子为鞭毛型,全长48.05μm±1.60μm,头部呈狭茧形,长度为3.06μm±0.17μm;精卵混合后,精子迅速附着于卵子表面,受精后5min-10min,精子进入卵内并明显膨胀,激活卵子启动两次成熟分裂;分别在受精后20min、30min,受精卵完成第一次和第二次成熟分裂,先后排出第一、第二极体;成熟分裂完成之后,精、卵核体积迅速膨胀到最大,核膜重新出现,形成弥散状的雌、雄原核;受精后35min左右,雌、雄原核在卵子中央发生染色体联合,共同排列在纺锤体的赤道板上,形成第一次有丝分裂的中期分裂相;受精后40min-45min,在纺锤丝的牵引下染色体被拉向两极,结果形成2个大小不等的卵裂球;受精后55min-60min,第二次卵裂结束,形成1大3小4个卵裂球,卵裂过程中的核相变化与第一次卵裂基本相同,只是卵裂方向是与第一次卵裂的卵裂沟呈基本垂直的纵裂;受精后80min-90min,第三次卵裂完成,仍为不等全裂,但自此次起开始进行螺旋分裂。此外,实验中也发现了少量的多精入卵、多极分离和天然三倍体等异常现象。     

银鲫雌核发育的细胞学观察

在受精卵内,精子核呈凝缩状态,不形成雄性原核,没有看到两性原核融合。在刚产出的成熟卵子中没有看到极体,直到受精后10分钟(在水温19°—21℃)才有唯一的一个极体排出。在同一尾银鲫产出的同批卵子中,绝大多数具有成熟分裂中期的卵核,并在精子入卵后继续进行发育(雌核发育),接着排出唯一的一个极体;授精7分钟的少数卵子具有三极纺锤体状的核。根据现在的观察,双凤水库的银鲫是以雌核发育方式繁殖的种群。