鸡球虫重组疫苗的研究进展

球虫病是由艾美耳球虫引起的一种对家禽危害极为严重的全球性寄生虫病,目前仍以药物防治为主。由于球虫抗药株的不断出现、研制新药的费用昂贵和药物残留的日趋严重,使得球虫疫苗研究成为近年的热点。采用ＤＮＡ重组技术获得的重组疫苗逐渐受到人们的重视,发展很快。综述近年来家禽球虫重组疫苗的研究情况,探讨重组疫苗的利用前景、存在问题和解决途径。     

柔嫩艾美耳球虫重组鸡痘病毒的构建与免疫保护研究

以鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杂交株F2的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增了杂交株F2的Rhomboid蛋白家族相关基因,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建出克隆质粒pMD-Rhomboid.以KpnⅠ、PstⅠ双酶切重组质粒pMD-Rhomboid和鸡痘病毒载体质粒pUTA2,并将纯化的Rhomboid基因亚克隆至鸡痘病毒载体pUTA2复合启动子下游,构建出真核表达重组质粒pUTA-Rhomboid.采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过BrdU药物加压筛选,并通过RT-PCR和蛋白质印迹等方法检测,筛选出一株球虫鸡痘重组病毒rFPV-Rhomboid.进一步经CEF扩增病毒后,免疫雏鸡,监测免疫指标.结果表明:重组病毒接种鸡外周血中的CD4 、CD8 含量显著高于非免疫对照组(P<0.05);与对照组相比,重组病毒对鸡的增重效果差异显著(P<0.05),对E.tenella的攻击具有一定的保护作用,显示出较好的应用前景.     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠中益生菌的影响

双歧杆菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．）及乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．）被认为是动物机体内重要的有益微生物菌群之一。本文对鸡感染柔嫩艾美耳球虫后盲肠中上述两种微生物的变化情况进行了研究。结果表明：鸡在感染球虫后第４、７、１０ｄ时盲肠中双歧杆菌的数量显著减少（Ｈ＜０．０５）;在球虫感染后的第４、７、１４ｄ时,盲肠中的乳酸杆菌呈显著下降趋势（Ｐ＜０．０５）。     

基于18S rRNA和线粒体16S rRNA基因序列的柳蚕进化分析

为探讨柳蚕Actias selene Hübner与鳞翅目昆虫的系统发育关系,本研究利用PCR扩增获得了柳蚕核糖体18S rRNA和线粒体16S rRNA基因的部分序列,长度分别为391bp和428bp。并采用邻近距离法(NJ)、最大简约法(MP)、类平均聚类法(UPGMA)构建系统进化树。结果表明,柳蚕线粒体16SrRNA基因序列与大蚕蛾科昆虫的16SrRNA基因序列均表现出偏好于碱基AT的倾向。柳蚕与所研究的其它蚕类的遗传距离介于0.016至0.140之间,其中与温带柞蚕Antheraea roylii的遗传距离最小,与野桑蚕Bombyx mandarina的遗传距离最大。而基于鳞翅目昆虫18S rRNA基因部分序列的进化分析显示,柳蚕与柞蚕Antheraea pernyi之间的遗传距离最小(0.010),与蓖麻蚕Samia ricini的遗传距离最大(0.017)。     

柔嫩艾美耳球虫脱囊过程的扫描电镜观察

本文对柔嫩艾美耳球虫的体外脱囊过程进行了扫描电镜观察。结果表明该虫表面粗糙,无其他生物学结构。孢子囊呈橄榄状,斯氏体明显。在脱囊介质作用下,孢子囊壁强度发生变化,出现不同程度的塌陷和皱折。未观察到因斯氏体消失而直接留下的开口。子孢子香蕉状,表面有数个微孔呈不规则排列,顶器短突状,无其他表面结构。     

鸡球虫Etp28基因的克隆及其在杆状病毒系统中的表达

本文克隆了鸡柔嫩艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌａ）广东株子孢子折光体抗原Ｅｔｐ２８基因,与国外发表的柔嫩艾美耳球虫ＭｅｒｃｋＬＳ１８株比较,仅在第４９２位有一个属于同义突变的碱基变异（Ｃ→Ｔ）。随后在修饰的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ－）载体系统中得到了高效表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明表达产物为５３ｋＤ的融合蛋白ＧＳＴ－６×Ｈｉｓ－Ｅｔｐ２８,其产物占细胞总蛋白量的２１．３％,在草地夜蛾培养细胞（Ｓｆ９）中的得量为０．４２ｍｇ／Ｌ×１０６个细胞。免疫保护效果实验初步结果表明该重组抗原能够提供一定的抗球虫保护作用。     

柔嫩艾美耳球虫配子发生的超微结构

利用透射电镜对柔嫩艾美耳球虫配子生殖阶段的超微结构进行了,大配子体和小配子体于相邻的宿主肠上皮细胞内相产生,由末代裂殖子入后,长大变圆而形成,小配子的形成为直接分化型,首先细胞核分裂成为多核体,随后细胞核向周边移动,然后紧靠细胞处的限制向外突出,临近突出部位的限制膜下陷,在核上方形成中心粒,中心粒发育为基粒,鞭毛中的微管和附着微管,早期形成的小配子仍与小配子体的殖体相连,成熟的小配子与配子体分离,外型香蕉状,外被单位膜,内有一电子结构十分致密的细胞核,核的头端侧面有一个巨大的线粒体,小配子有鞭毛2根,每根鞭毛内有微管,组成为9＋2结构,此外,小配子至少有6根附着微管,大配子体和大配子外被单位膜,内部形成大量的成囊体1和成囊体2,并有大量的支链淀粉和脂肪体,中央有一个细胞核,卵囊臂有5层,细胞核位于细胞中央,细胞内有大量的支链淀粉和脂肪体。     

柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株的分离与鉴定

目的 分离并鉴定安徽肥西病鸡盲肠内的柔嫩艾美耳球虫.方法 通过雏鸡进行单卵囊接种与增殖试验,对所获卵囊用形态学方法进行初步鉴定;运用PCR方法扩增该分离株的ITS-1基因序列,并与相关序列进行比对、构建系统进化树.结果 该球虫分离株孢子化卵囊的平均大小为21.1 μm ×18.0 μm,卵形指数为1.17,潜隐期为140 h;其ITS-1基因序列与柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)GQ856310相似性达98.2％,二者的亲缘关系非常接近.结论 该球虫分离株为柔嫩艾美耳球虫(E.tenella),暂命名为柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株.     

肠艾美耳球虫孢子发育与裂殖生殖研究

用单卵囊分离技术纯化肠艾美耳球虫Eimeria intestinalis Cheissin,1948卵囊。卵囊呈宽梨形,平均大小为27.38×19.97μm。在室温21—26℃,第63和116小时完成孢子化率分别为31％和71％。人工感染无球虫兔,潜隐期9天,排卵囊的持续期为9天,高峰期为感染后第12—13天。裂殖生殖4代,第一代裂殖体寄生于空肠和回肠的肠腺上皮细胞内,出现时间为感染后61—85小时;裂殖体有大小两种类型。第2代至第4代裂殖体寄生于空肠、回肠,寄生部位扩展至肠绒毛上皮细胞,有大、中、小三种类型裂殖体。第2至第4代分别出现于感染后96—132小时;144—180小时;192—240小时。感染后73—216小时之间均见有含两个裂殖子的小裂殖体,大小为2.5—5.9×3—9.48μm;感染后96—240小时,见粗细两种类型的裂殖子,粗裂殖子有核1—8个,细裂殖子多为一个核。裂殖生殖寄生于空肠、回肠;仅在216小时曾在蚓突的个别绒毛和腺上皮细胞内见有裂殖体。12指肠、盲肠和结肠均未见虫体寄生。作者特别瞩目于试验中发现的裂殖体和裂殖子的多型现象,并将无性世代划分为4代。     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠中益生菌的影响*

双歧杆菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．）及乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．）被认为是动物机体内重要的有益微生物菌群之一。本文对鸡感染柔嫩艾美耳球虫后盲肠中上述两种微生物的变化情况进行了研究。结果表明：鸡在感染球虫后第４、７、１０ｄ时盲肠中双歧杆菌的数量显著减少（Ｈ＜０．０５）;在球虫感染后的第４、７、１４ｄ时,盲肠中的乳酸杆菌呈显著下降趋势（Ｐ＜０．０５）。     

基于18S rRNA的中国大陆沿海石磺科贝类分类的初步分析

对采自上海崇明、福建宁德、海南海口等沿海地区9个群体的石磺科贝类进行外部形态特征差异分析和内部结构比较,在初步分类基础上利用核糖体小亚基18S rRNA基因部分序列对9个群体进行系统发育分析,以菊花螺为外群,结合GenBank上石磺科4个18S rRNA基因序列构建系统发生树来探讨我国大陆沿海石磺科属种间的亲缘关系.结果显示:我国石磺科贝类南方沿海种类多于北方沿海;除报道的瘤背石磺(Onchidium struma)和石磺(O.verruculatum)外,可能还有新记录5种:Onchidium属1种、Platevindex属2种、Peronia属1种和Paraoncidium属1种.分子系统发生树显示,我囝大陆沿海石磺科9个群体可分为4个亚群,分别为Onchidium、Platevindex、Paraoncidium、Peronia,其中Peronia亚群的置信度较高;Onchidium verruculatum应更名为Peronia verruculata.     

菌种1137116S rRNA序列分析及鉴定

通过PCR方法扩增菌种11371的16S rRNA基因并测序,将序列提交GenBank(登录号:DQ531606),并与其他链霉菌属种进行比较,通过DNAStar软件得到菌种16S rRNA基因序列进化树。同时采用插片法、显微镜观察等方法对株菌11371进行形态特征、培养特征、生理生化特征鉴定。结果表明,11371的16S rRNA序列与其他链霉菌具有一定的同源性,结合生理、生化指标鉴定结果,进一步确定菌种为不吸水链霉菌一株新亚种(Streptomyces ahygroscopicus subsp.wuzhouensis n.sub-sp.),菌株11371 16S rRNA序列为GenBank中首例Streptomyces ahygroscopicus的16S rRNA序列。     

大黄鱼16SrRNA和18SrRNA基因的测定与序列分析

利用多对引物,扩增并测定出大黄鱼16SrRNA基因和18SrRNA基因的部分序列,其长度分别为1202bp和1275bp,16SrRNA基因序列的GC含量为46．12％,18SrRNA基因的Gc含量为53．oo％。将大黄鱼16SrRNA基因序列与GenBank中15种硬骨鱼类的同源序列结合,同时将其18SrRNA基因序列与GenBank中9种脊索动物的同源序列相结合,运用软件获得各自序列间差异百分比,转换和颠换数值等信息。基于这两种基因序列,利用NJ法和BI法,分别构建16种硬骨鱼类和10种脊索动物的分子系统树。18SrRNA构建的系统树包括三大支,一支为哺乳类、鸟类和爬行类共6个物种,一支为两栖类的1个物种,另一支为2种硬骨鱼类。16SrRNA构建的系统树显示大黄鱼所在的石首鱼科与鲈科和盖刺鱼科亲缘关系较近。此外还讨论了这两个基因的序列特征。     

基于16S rRNA部分序列中国蝙蝠科蝙蝠系统发生分析

蝙蝠科蝙蝠遍布全世界,是蝙蝠中种类最多的一个科.尽管从形态学、胚胎学和分子生物学等方面认为蝙蝠科内长翼蝠亚科应该提升到科、鼠耳蝠属应该提升到亚科的分类地位,但是其科内的系统关系长期以来一直处于争议之中.本文对蝙蝠科11种38个标本线粒体16S rRNA部分序列进行了测序,并结合以前报道的13种(属于7科13属)蝙蝠的线粒体16S rRNA部分序列构建了系统树,结果表明:长翼蝠亚科可以提升到科的分类地位、鼠耳蝠属提升到亚科的分类地位,这与前人报道的结果一致;相对于由鼠耳蝠亚科、彩蝠亚科和管鼻蝠亚科构成的分支,蝙蝠亚科和Antrozoinae是一个并系群.蝙蝠亚科内的亲缘关系也进行了进一步的讨论.     

一株耐盐细菌的16S rRNA基因序列分析

从舟山群岛滩涂土壤中获得了海水和底泥样品,并从中提取到了一株耐盐细菌,通过用不同盐浓度的培养基培养,挑取单菌落,反复划线纯化,得到了耐盐菌的单菌落。通过菌株基因组DNA的提取、菌株的抗性实验、质粒的提取、16S rRNA的PCR扩增及克隆、16S rRNA的全序列分析等手段,对该菌株的16S rRNA的基因序列进行了研究。     

蝰科(Viperidae)蝮亚科(Crotalinae)线粒体12S rRNA基因序列分析及其系统发育

对蝮亚科(蛇岛蝮Gloydius shedaoensis Zhao、黑眉蝮Gloydius saxatilis Emelianov、乌苏里蝮Gloydius ussurriensis Emelianov、竹叶青Trimeresurus stejnegeri Schmidt 和分别来自不同地区的尖吻蝮Deinagkistrodon acutus Guenther、短尾蝮Gloydius brevicaudus Stejneger各两条)6种蛇共8个个体测定、分析了约370bp线粒体12S rRNA基因序列,以游蛇科链蛇属半棱鳞链蛇Dinodon semicarinatus 序列为外群构建分子系统树.分子数据结果支持尖吻蝮形态学的属级分类地位;提示蛇岛蝮位于黑眉蝮的蛇岛亚种分类地位,同时探讨了蛇岛蝮的起源问题;并提示短尾蝮和乌苏里蝮同位于种级分类地位.     

Phylogeny of Molting Protostomes (Ecdysozoa) as Inferred from 18S and 28S rRNA Gene Sequences

Phylogenetic relationships within the group of molting protostomes were reconstructed by comparing the sets of 18S and 28S rRNA gene sequences considered either separately or in combination. The reliability of reconstructions was estimated from the bootstrap indices for major phylogenetic tree nodes and from the degree of congruence of phylogenetic trees obtained by different methods. By either criterion, the phylogenetic trees reconstructed on the basis of both 18 and 28S rRNA gene sequences were better than those based on the 18S or 28S sequences alone. The results of reconstruction are consistent with the phylogenetic hypothesis classifying protostomes into two major clades: molting Ecdysozoa (Priapulida + Kinorhyncha, Nematoda + Nematomorpha, Onychophora + Tardigrada, Myriapoda + Chelicerata, and Crustacea + Hexapoda) and nonmolting Lophotrochozoa (Plathelminthes, Nemertini, Annelida, Mollusca, Echiura, and Sipuncula). Nematomorphs (Nematomorpha) do not belong to the clade Cephalorhyncha (Priapulida + Kinorhyncha). It is concluded that combined data on the 18S and 28S rRNA gene sequences provide a more reliable basis for phylogenetic inferences.__________Translated from Molekulyarnaya Biologiya, Vol. 39, No. 4, 2005, pp. 590–601.Original Russian Text Copyright © 2005 by Petrov, Vladychenskaya.     

Bacterial,archaeal and eukaryotic diversity in Arctic sediment as revealed by 16S rRNA and 18S rRNA gene clone libraries analysis

We studied the microbial diversity in the sediment from the Kongsfjorden, Svalbard, Arctic, in the summer of 2005 based on the analysis of 16S rRNA and 18S rRNA gene clone libraries. The sequences of the cloned 16S rRNA and 18S rRNA gene inserts were used to determine the species identity or closest relatives by comparison with sequences of known species. Compared to the other samples acquired in Arctic and Antarctic, which are different from that of ours, the microbial diversity in our sediment is much higher. The bacterial sequences were grouped into 11 major lineages of the domain Bacteria: Proteobacteria (include α-, β-, γ-, δ-, and ε-Proteobacteria); Bacteroidetes; Fusobacteria; Firmicutes; Chloroflexi; Chlamydiae; Acidobacteria; Actinobacteria; Planctomycetes; Verrucomicrobiae and Lentisphaerae. Crenarchaeota were dominant in the archaeal clones containing inserts. In addition, six groups from eukaryotes including Cercozoa, Fungi, Telonema, Stramenopiles, Alveolata, and Metazoa were identified. Remarkably, the novel group Lentisphaerae was reported in Arctic sediment at the first time. Our study suggested that Arctic sediment as a unique habitat may contain substantial microbial diversity and novel species will be discovered.     

基于12S和16S rRNA序列的湍蛙属部分物种的系统发育关系

测定了湍蛙属 6个种共 10个种群 ,以及 4个外群种的线粒体 12S和 16SrRNA基因片段 ,比对后有94 0bp序列 ,发现 35 2个变异位点、 186个简约性位点。运用NJ法、MP法、ML法构建了系统关系树 ,各系统树一致表明内群为一单系群 ,分为两组 :第一组中 ,四川湍蛙两种群先聚合 ,再和棕点湍蛙聚为一支 ;第二组中 ,香港湍蛙和戴云湍蛙聚为一支 ,而香港大屿山离岛湍蛙种群首先与华南湍蛙相聚 ,再与武夷湍蛙构成姐妹支。研究结果表明 :香港地区增加 1种湍蛙分布 ;戴云湍蛙是一有效种 ;四川湍蛙的石棉和洪雅种群间遗传差异达到或超过其他种间的分歧水平。