鼠伤寒沙门氏菌/微粒体系统检测三十六种化学物质的诱变性试验

近年来,Ames 等人用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸缺陷型突变菌株建立了化学诱变物的检测系统。由于化学物质对微生物的诱变作用,     

鼠伤寒沙门氏菌/微粒体系统和姐妹染色单体互换检验化学物质致癌性的试验及其比较

用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸缺陷型突变株TA1535、TA1537、TA1538、TA98和TA100,结合大鼠肝脏微粒体酶系(“S-9”)作为化学诱变剂的检测系统,测定了农药、药物、食品添加剂、化学试剂和环境污染物共36种化学物质的诱变作用。所用方法基本参照Ames等人(1975)所用的纸片点样测定和平皿菌落计数的方法。大鼠肝脏微粒体酶系是先用五氯联苯注入雄性大鼠腹腔,5天后杀鼠取肝,冰冻离心     

鼠伤寒沙门氏菌多重PCR检测方法的研究

分别根据沙门氏菌16S rRNA、质粒毒力基因spvC、致病基因invB、fimA序列设计4对引物,对沙门氏菌株及非沙门氏株菌基因组DNA进行多重PCR检测。结果该方法能检测出6.3×10² 个cfu/ml纯培养的沙门氏菌,人工染菌食品模拟检测结果显示,熟鸡肉初始含菌量为17cfu/g、全脂奶粉为11cfu/g、生牛肉为13.6cfu/g,经过8h增菌,PCR检测为阳性。该体系能鉴定产生多种毒力因子的沙门氏菌,特异性强、敏感性高,为检测和鉴定沙门氏菌株提供了一个新方法。     

鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株的构建及其耐药性

[背景]鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种重要的人兽共患病原菌,其多重耐药性问题日益严重,双组分系统可调控鼠伤寒沙门氏菌的耐药性。[目的]通过构建鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株及回补株探究BaeSR双组分系统对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响。[方法]在BaeSR双组分系统和AcrB外排泵双缺失株（CRΔbaeSRΔacrB）的基础上构建baeR过表达株（CRpbaeRΔbaeSRΔacrB）及baeR回补株（CRcbaeRΔbaeSRΔacrB）,测定双缺失株、回补株和过表达株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）,并对其生长特性、生物膜形成能力及运动性进行分析。采用转录组学技术筛选与耐药相关的差异表达基因,RT-qPCR验证耐药相关基因。[结果]构建了鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株和baeR回补株。与双缺失株相比,过表达株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、乙酰甲喹、头孢他啶、头孢噻呋、阿莫西林和氨苄西林的MIC分别升高2-256倍,对大观霉素、安普霉素的MIC下降了50%;与双缺失株相比,回补株对头孢他啶...     

表达大肠杆菌LT-B/ST融合抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

编码LT-B/ST融合抗原的基因插入pYA248载体中,构建了重组质粒pXZL66。该重组质粒转入无毒鼠伤寒沙门氏菌SR-11,ΔCya,Δcrp,Δasd菌株X4072。此无抗药性的杂合菌株X4072(pXZL66)表达的LT-B/ST融合抗原具有LT和ST抗原性而没有生物毒性,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗候选株。     

乳酸杆菌S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌黏附及入侵Caco-2细胞的拮抗作用

【目的】对嗜酸乳杆菌的S-层蛋白(S-layer protein)进行提纯,研究嗜酸乳酸杆菌和S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌黏附和入侵的拮抗作用。【方法】应用阴离子交换柱(DE52)对嗜酸乳酸杆菌的S-层蛋白进行提纯,然后分别研究了嗜酸乳酸杆菌和S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌黏附及入侵Caco-2细胞的作用。【结果】S-层蛋白能显著地抑制鼠伤寒沙门氏菌的黏附及入侵;在竞争、排斥、置换3种黏附试验中,S-层蛋白可显著降低鼠伤寒沙门氏菌的黏附,其相对黏附力分别为1.17%±5.97%、8.71%±1.36%、10.56%±0.92%,差异极显著(p0.01),其中竞争试验效果最好;并且S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌黏附抑制作用极显著高于嗜酸乳酸杆菌(p0.01);此外,S-层蛋白也能显著抑制鼠伤寒沙门氏菌入侵。【结论】乳酸杆菌S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌可产生显著的拮抗作用,这可能与S-层蛋白和鼠伤寒沙门氏菌的宿主黏附受体存在竞争作用有关;提示乳酸杆菌S-层蛋白可用于预防和治疗鼠伤寒沙门氏菌感染,并有望成为抗生素的替代品。     

用体内激活的启动子调控HCV核心抗原表达可增强重组鼠伤寒沙门氏菌的免疫原性

为提高抗原表达质粒在重组伤寒沙门氏菌中的稳定性以增强重组伤寒沙门氏菌诱导的免疫应答 ,克隆鼠伤寒沙门氏菌pagC基因启动子 ,以其为转录调控元件构建HCV核心抗原表达质粒 ,转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌中。体外培养时 ,Mg2 能够剂量依赖性抑制该重组菌表达HCV核心抗原。将该重组菌和组成性表达的重组菌分别口服接种BALB/c小鼠 ,观察质粒的稳定性和小鼠的免疫应答。结果表明 ,体内激活的pagC基因启动子能明显提高质粒在重组鼠伤寒沙门氏菌中的稳定性和增强重组菌诱导的体液和细胞免疫应答 ,这为发展高效免疫、成本低廉的口服丙肝疫苗提供了一个新思路     

鼠伤寒沙门氏菌TA_(92)、TA_(94)预培养进行Ames试验的研究

自1975年Ames等首创用鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验检测化学物质的潜在致癌性以来,受到世界各国的重视,被首选为观察基因点突变的好方法,应用于筛选化学物质的遗传毒性和潜在致癌性。近年,Ames法又得到很大的改进,主要是     

利用CRISPR/Cas9系统建立内生链霉菌SAT1的基因簇敲除体系

hyBl(hygB-like)基因簇是内生链霉菌SAT1中的次级代谢基因簇,经分析它与潮霉素B基因簇具有52%的相似性,可能在SAT1抑制栗疫菌(Cryphonectria parasitica)的过程中发挥主要作用。为了深入研究该菌的抑菌机制和hyBl基因簇的功能,以hyBl为目标,利用CRISPR/Cas9技术建立SAT1的基因簇敲除体系。在实验过程中,通过protospacer的筛选、敲除载体的构建、接合转移供体菌、Ca~(2+)和Mg~(2+)的选择以及接合时间等多个条件的探索,建立了SAT1的基因簇敲除体系。最终以E. coli ET12567(pUZ8002/pCRISPomyces2-CB)为供体菌,在MS培养基(含10 mmol Mg~(2+))上接合16-18 h,成功获得突变株SAT1△hyBl(缺失14 kb的hyBl基因簇)。突变株对栗疫菌的抑制带宽较野生株降低了77%,这说明该基因簇指导合成的次级代谢产物在抑制栗疫菌方面具有重要的功能。本研究证明了利用CRISPR/Cas9系统可以对内生链霉菌SAT1进行基因簇编辑,也为深入研究该菌的抑菌机制、基因工程法验证未知基因簇功能提供了良好的技术支撑。     

吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997中噬菌体基因转移系统的建立及其应用

由吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997产生的格尔德霉素geldanamycin(GA)属安莎类抗生素, 具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性。本文应用链霉菌温和噬菌体C31衍生的KC515载体,在吸水链霉菌S.hygroscopicus 17997中建立并优化了S. hygroscopicus　17997的基因转染体系。利用所建立的基因转染体系,以基因阻断技术从S. hygroscopicus 17997基因文库含有多组PKS基因柯斯质粒中,鉴定了与GA PKS生物合成相关基因的柯斯质粒,该工作为GA生物合成基因簇的克隆奠定了基础。     

吸水链霉菌NND-52-C基因工程宿主载体系统的构建*

吸水链霉菌NND-52-C菌株是大环内酯类抗生素 阿扎霉素B的高产菌株。采用原生质体转化技术 ,将来自变铅青链霉菌TK2 4菌株的pIJ70 2质粒转化吸水链霉菌NND-52-C菌株的原生质体 ,建立了吸水链霉菌NND-52-C菌株的基因工程宿主载体系统。确定了NND-52-C菌株原生质体制备和再生的条件 ,其原生质体形成率达到 10⁸个 mL ,再生率约为0.2 % ,转化率为10²～10³个转化子 μg质粒DNA。     

应用分散和差速离心法分离嗜酸和耐酸链霉菌的试验及评价*

新的微生物资源的开发离不开菌种分离技术的改进和分离效率的提高。我们采用一种新的分离方法——分散和差速离心法(Dispersion and Differential Centrifugation,DDC),以传统的振荡法做对照,对12份酸性土壤样品进行了链霉菌的分离。结果表明DDC方法的分离效率是传统方法的2—20倍,且选择性好。用DDC方法共分离出链霉菌249株,归属于12个颜色类群,其中的45株代表菌株的形态和细胞壁类型均符合链霉菌的特征,最适生长pH均为4．5—5．5。结果表明应用DDC方法分离非常见的嗜酸和耐酸链霉菌是可行的。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统的构建及其雏鸡免疫保护试验

摘要:【目的】为构建鼠伤寒沙门菌环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统,并对其生物学特性进行检测。【方法】以鼠伤寒沙门菌SL1344Δcya株为亲本株,利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的同源重组技术,经两步法缺失并筛选asd基因缺失株(SL1344Δcya Δasd)。将含asd基因且无抗性的pYA3493质粒电转化至缺失株SL1344ΔcyaΔasd,构建重组菌株SL1344ΔcyaΔasd (pYA3493)。【结果】试验结果表明,重组菌株SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)生化特性和生长速度与参考株SL1344相比差异较大,与亲本株SL1344Δcya基本一致,SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2 S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力。对1日龄雏鸡攻毒试验表明,SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)毒力较参考株SL1344降低了约104倍。免疫保护试验显示,1日龄雏鸡免疫SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)后第17天,利用鼠伤寒沙门菌参考株攻毒,保护率为62.5%。【结论】鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统构建成功,且具有较好的免疫保护性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定基础。     

天蓝色链霉菌中抗生素合成相关双组分调控系统AfsQ1/Q2上游信号传导机制的研究

链霉菌是重要的工业微生物,能够合成众多具有生物活性的次级代谢产物,如抗生素、抗肿瘤药物以及免疫抑制剂等.次级代谢产物的合成受到多层次严格调控,深入开展相关机制研究将对工业菌株的高效育种提供重要理论指导.链霉菌中存在的两类关键信号传导系统,包括双组分系统(two-component system,TCS)和胞质外功能σ因子(extracytoplasmic function σ,ECF-σ),它们在次级代谢过程中发挥着重要的调控功能,但至今对于它们如何协同调控次级代谢的分子机制知之甚少.在前期研究工作中,我们在链霉菌模式菌株——天蓝色链霉菌中鉴定了一个参与抗生素生物合成调控的基因簇sigQ-afsQ1-4,其中sigQ编码ECF-σ因子(σ^Q),afsQ1/Q2编码一对TCS,afsQ3/Q4分别编码脂蛋白和跨膜蛋白.研究证实,TCS AfsQ1/Q2为抗生素生物合成的激活因子,sigQ的转录受到AfsQ1/Q2的直接调控,但σ^Q的功能正好相反,参与抗生素合成的负调控,即σ^Q对AfsQ1/Q2的功能存在拮抗作用.在前期工作...     

用活体小动物SPECT/CT影像系统检测纳米材料和药物在体内的生物效应

研究疾病在小动物模型体内的动态生物过程促进了高分辨率影像学方法的发展。这些方法能够阐明疾病或肿瘤在发生和发展过程中的分子相互作用,评价药物和显影剂的生物效应,并可动态连续监测药物在同一个体的治疗效果。单光子发射型计算机断层成像仪(single photon emission computed tomography,SPECT)在这些应用中具有很多优势。应用SPECT对标记核素发射的γ-射线信号探测分析,可获得病变组织或药物的三维空间分布信息。SPECT联合X-射线诊断设备CT(computed tomography)组成的SPECT/CT系统可辅助界定生物过程的解剖学背景,提高SPECT数据的定位准确度。文章概述了小动物SPECT/CT的特点、成像原理、核素的选择,及其在纳米材料和药物(如脂质体、碳纳米管、纳米粒包括聚合物、胶束和量子点等)方面的应用和研究进展。