家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

羧肽酶A1全酶及其活性中心基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR方法扩增出CPA1全酶及活性中心基因,分别克隆入载体pGEM-T easy,测序分析。将两段目的基因亚克隆于表达载体pGEX—IT-1,测序证实序列插入正确后转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组蛋白。结果表明,成功克隆了人CPA1全酶及其活性中心基因并得到了原核表达产物,为进一步分析比较CPA1全酶及其活性中心的特性、了解CPA1结构与功能的关系并最终得到CPA1最小活性结构域奠定基础。     

花生AhRab7基因的克隆及其原核表达研究

为了研究花生小G蛋白AhRab7基因在大肠杆菌中的表达模式及与高盐胁迫的关联性,采用 RT-PCR技术从花生（Arachis hypogaea L .）品种花育20中克隆了AhRab7(7-1、7-2)的cDNA全长序列,通过核苷酸序列和氨基酸序列分析结果表明AhRab7的cDNA全长分别为872 bp、816 bp,分别含一个621 bp、618 bp大小的开放阅读框（ORF）,拟编码氨基酸数分别为206 aa、205 aa。将携带完整的ORF序列连入表达载体 pET-28a(+)中,经IPTG诱导后进行耐盐性测定,结果表明两种全长重组酶（分别含pET-Rab 7-1 和pET-Rab 7-2的重组质粒）均具有正常酶活性,明显缓解了高盐环境(5.5%～10% NaCl溶液)对大肠杆菌的生长胁迫,而对照组（含空载体pET-28a）未能检测出相同的酶活性,结果表明该基因表达可以缓解高盐胁迫影响。目的基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小为23KDa,与预测结果一致。这为后期探讨花生对盐胁迫及其他非生物胁迫的研究奠定了一定的基础。     

海洋创伤弧菌反式翻译系统关键因子SmpB基因的克隆及原核表达

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种重要的"人鱼共患病"病原菌。通过克隆创伤弧菌反式翻译系统核心因子小蛋白B(Small molecular protein B,SmpB)基因,构建携带目的基因的原核表达质粒,为后续研究SmpB蛋白的互作网络、SmpB蛋白与创伤弧菌致病性之间的关系并以此开发新型的抑菌靶标奠定基础。使用LiCl沉淀法提取创伤弧菌基因组DNA,以它为模板,PCR扩增目的基因,并构建到pET-28a原核表达载体上测序鉴定后对SmpB序列进行生物信息学分析,将正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果表明使用LiCl沉淀法成功提取到高质量创伤弧菌基因组DNA,以其为模板,扩增到smpB基因,并成功构建pET-28a原核表达重组质粒,测序鉴定正确;smpB基因全长为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.41 kD,理论等电点为10.28,不稳定系数为35.02,总平均亲水性为-0.635,SmpB蛋白整体表现为稳定亲水性蛋白。生物信息学分析显示其高级结构核心部分为5个β折叠组成的桶状结构,外围由3个α螺旋组成,SmpB C-端亦为α螺旋。诱导表达的重组融合蛋白相对分子质量大小在25.0 kD附近,显示在E.coli中成功表达了SmpB蛋白。     

A型口蹄疫病毒VP0基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA.并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP0基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP0并亚克隆入pMD18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体pET32a用BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pET32-VP0.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP0并用SDS-PAGE进行检测.表达产物用镍亲和树脂进行了纯化.结果证明,口蹄疫病毒VP0蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料.     

牦牛OB基因的克隆及原核表达

肥胖基因(obese gene,OB gene)表达产物瘦蛋白(leption)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物学功能。通过牦牛脂肪组织总RNA的提取,利用RT-PCR克隆出牦牛OB基因的成熟肽cDNA,构建OB基因的原核表达载体OB-pET32a(+),在大肠杆菌表达系统使融合蛋白表达,通过SDS-PAGE检测所表达的融合蛋白。结果表明,克隆的OB基因成熟肽片段为456 bp包含EcoR I和BamH I两个酶切位点,与普通牛、瘤牛该基因的相似性达98.6%。原核表达产物为包涵体形态,大小为31 kD,符合预期结果,为OB基因的高效表达系统的构建奠定基础。     

大肠杆菌glgC基因的克隆及原核表达

以大肠杆菌BL21染色体DNA为模板,根据glgC基因的全序列设计了1对引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了glgC基因片段,测序结果显示该片段大小为1296 bp,编码432个氨基酸残基。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a-c( )中,重组载体pET-glgC转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到了与理论推算的glgC基因表达产物分子质量(约53 kD)相符的特异蛋白条带。     

小鼠Klf4基因的克隆及原核表达分析

目的克隆Klf4基因并对其重组蛋白进行原核表达及分析。方法提取胎鼠皮肤mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点引物,从该cDNA中扩增出Klf4基因编码区序列,将其克隆到pEasy-T3载体上。对质粒双酶切并回收其中Klf4基因片段后,克隆入pET-52b（＋）载体后转化Origmai B（DE3）型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析。结果对所克隆的Klf4mRNA蛋白编码区的DNA序列分析表明,klf4CDS区包括终止密码子在内为1452 bp,与参照序列对比仅有四处存在差异,不仅其同源性达到99.72%,且其氨基酸序列同源性为100%;在IPTG诱导下pET-52b（＋）-Klf4重组质粒可表达与预期相符的约为57×103的蛋白质;经IPTG刺激后重组蛋白表达明显上调,其中IPTG为0.4 mol/L时效果最佳。结论从胎鼠皮肤中克隆的Klf4基因可在原核中表达。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.     

益母草糖基转移酶基因的克隆及原核表达分析(英文稿)

通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从益母草(Leonurus heterophyllus Sweet)叶片中克隆获得了一个编码糖基转移酶的基因(LhsUGT)。该基因cDNA全长为1562bp,开放阅读框(openreading frame,ORF)为1368bp,编码455个氨基酸残基,其分子量和等电点分别为50.47kD和5.52。生物信息学分析结果显示:LhsUGT编码的酶蛋白含有3种二级结构,其中α螺旋占43.1%,β折叠片占17.5%,无规卷曲占39.4%,其C端还发现了一段高度保守的PSPG结构域,说明LhsUGT编码的酶蛋白属于植物糖基转移酶超家族;对LhsUGT的氨基酸序列进行BLAST同源比对,发现益母草与其它植物的糖基转移酶序列相似性为26.4%~68.0%;系统进化树分析表明,LhsUGT蛋白属于拟南芥糖基转移酶超家族的L组,故推测它可能具有催化简单酚类发生糖基化的功能;SDS-PAGE电泳显示,原核表达系统成功表达出分子量约为69kD的LhsUGT重组蛋白,其N端含有一段17.9kD的His标签,且在IPTG诱导5h后达到最高表达量。本研究结果为进一步开展体外酶促反应、阐明益母草糖基转移酶的生物学功能奠定了基础。     

小麦蛋白翻译起始因子5A基因（eIF5A）的克隆与分析

真核生物的翻译起始因子5A （eIF5A）是调控生物生长发育、衰老及环境适应等的重要因子。利用设计的小麦蛋白翻译起始因子5A基因的引物对小麦“中国春”基因组DNA和cDNA进行PCR扩增,并将扩增的特异片段回收、克隆和测序,从基因组DNA中得到长度分别为1 679 bp、1 910 bp两条带,从cDNA扩增得到1条636 bp带,分别命名为eIF5a1（基因登录号：DQ167202）、eIF5a2（基因登录号：DQ167201）和eIF5a3。利用GeneRace方法得到eIF5a3（基因登录号：DQ167203）的全长为768 bp。序列分析表明,eIF5a1、eIF5a2具82.3%相似性,都形成636 bp的转录产物,转录产物仅6个核苷酸差异。将eIF5a1、eIF5a2和 eIF5a3这3个序列的预测氨基酸序列进行比对,发现仅有1～2个氨基酸的差异,证实它们为eIF5A基因家族的成员。进化分析表明它们与报道的玉米、水稻、西红柿、烟草的eIF5A基因序列的遗传关系最近。进一步研究表明eIF5a2位于2B染色体上,并用半定量RT-PCR 研究了小麦eIF5A基因的表达情况。     

eIF-5A与DHS功能研究及应用进展

脱氧羟腐胺赖氨酸合酶(deoxyhypusine synthase,DHS)在植物、哺乳动物和酵母细胞中普遍存在,参与真核翻译起始因子eIF-5A(eukaryotic initiation factor-5A)的翻译后活化.目前研究表明eIF-5A具有多重生物学功能,如参与细胞增殖、蛋白质翻译、mRNA降解、细胞周期的转化及细胞衰老与凋亡等.eIF-5A是目前已知的DHS的惟一底物,因此研究DHS的功能与作用机理离不开对eIF-5A的功能研究.     

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

用木麻黄(Casuarina glauca)的金属硫蛋白基因(metallothionein 1)氨基酸序列对柽柳ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了柽柳金属硫蛋白基因全长cDNA序列,去除polyA后该基因全长366 bp,其中5′非翻译区97 bp,3′非翻译区59 bp,开放读码框(ORF)长210 bp,编码70 个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为6.793 kD,理论等电点为4.99,含10个Cys,集中分布在肽链的N端和C端。BlastP同源性分析表明该基因与花生同源性最高,与小豆同源性最低。该基因的EST序列在GenBank登录(登录号：CV792539)。     

大黄鱼CYP1A基因cDNA的克隆与表达分析

由于外源化合物能诱导鱼类CYPIA(P4501A)的表达,因而它广泛被用作评价水环境污染生物标记物.利用RT-PCR结合RACE技术从大黄鱼(Larimichthys crocea)肝脏克隆了CYP1A基因全长cDNA序列.经分析,该cDNA的5'末端有175 bp的非翻译区.开放阅读框为1 566 bp,编码521个氨基酸和一个终止密码子,3'末端有857 bp的非翻译区,3'非翻译区有一个多聚腺苷酸信号及两个与mRNA的快速降解有关的AUUUA序列.推测大黄鱼CYP1A的氨基酸序列和欧洲鲈鱼的相似度最高迭89.6%.用RT-PCR检测大黄鱼CYP1A的表达特征发现,在所检测的9个组织中均有表达,以肝脏、消化道、脾脏和肾脏的表达量较高.     

Deoxyhypusine Modification of Eukaryotic Translation Initiation Factor 5A (eIF5A) Is Essential for Trypanosoma brucei Growth and for Expression of Polyprolyl-containing Proteins

The eukaryotic protozoan parasite Trypanosoma brucei is the causative agent of human African trypanosomiasis. Polyamine biosynthesis is essential in T. brucei, and the polyamine spermidine is required for synthesis of a novel cofactor called trypanothione and for deoxyhypusine modification of eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A). eIF5A promotes translation of proteins containing polyprolyl tracts in mammals and yeast. To evaluate the function of eIF5A in T. brucei, we used RNA interference (RNAi) to knock down eIF5A levels and found that it is essential for T. brucei growth. The RNAi-induced growth defect was complemented by expression of wild-type human eIF5A but not by a Lys-50 mutant that blocks modification by deoxyhypusine. Bioinformatics analysis showed that 15% of the T. brucei proteome contains 3 or more consecutive prolines and that actin-related proteins and cysteine proteases were highly enriched in the group. Steady-state protein levels of representative proteins containing 9 consecutive prolines that are involved in actin assembly (formin and CAP/Srv2p) were significantly reduced by knockdown of eIF5A. Several T. brucei polyprolyl proteins are involved in flagellar assembly. Knockdown of TbeIF5A led to abnormal cell morphologies and detached flagella, suggesting that eIF5A is important for translation of proteins needed for these processes. Potential specialized functions for eIF5A in T. brucei in translation of variable surface glycoproteins were also uncovered. Inhibitors of deoxyhypusination would be expected to cause a pleomorphic effect on multiple cell processes, suggesting that deoxyhypusine/hypusine biosynthesis could be a promising drug target in not just T. brucei but in other eukaryotic pathogens.     

柽柳(Tamarix androssowii)Tadir基因的克隆及分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了Tadir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长724bp。其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸。基因编码蛋白的分子量为19.69kD,理论等电点为6.96。疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的。该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因),ABE73781(蛋白)。实时荧光定量PCR分析结果表明,0.4mol·L-1NaCl和NaHCO3胁迫后该基因表达量发生变化,其可能与柽柳的耐盐性有关。     

食蟹猴疟原虫 (Plasmodium cynomolgi)中一个真核翻译起始因子4A(eIF-4A)同源蛋白的cDNA克隆、表达和ATP酶活性测定(英文)

真核翻译起始因子 4A(eukaryoticinitiationfactor 4A ,eIF 4A)是DEAD盒蛋白家族的ATP依赖性的RNA解旋酶类中的一个原型成员 .它在真核细胞的蛋白质合成的起始过程中起着关键性作用 .通过PCR扩增和放射探针杂交相结合的方法筛选食蟹猴疟原虫 (Plasmodiumcynomolgi)的cDNA文库 ,克隆了一个eIF 4A同源蛋白的完整cDNA序列 ,命名为CH1F .CH1F全长 1 75 3bp ,包含一个1 1 97bp的完整阅读框 ,推测编码一个由 398个氨基酸组成的蛋白 .对CH1F的蛋白序列用BlastP进行搜索和分析 ,提示它应该是DEAD盒家族的一个eIF 4A同源蛋白 ;用DNAStar将其与许多典型的DEAD盒蛋白序列进行比对分析 ,结果显示 :比起其它的DEAD盒蛋白 ,它与eIF 4A或eIF 4A的同源蛋白具有更高的同源性和更多序列上的相似结构域 .将包含完整阅读框的片段亚克隆进表达载体pET 2 8a (+) ,在大肠杆菌DH5α中表达 ,产生的融合蛋白大小在 4 5kD左右 .对该融合蛋白进行纯化、重新折叠和初步鉴定 .ATP酶活性检测显示 ,该融合蛋白只有很低的ATP酶活性 ,而且它的ATP酶活性似乎不依赖于核酸底物 .对这一检测结果给出 3种可能的原因 .这一检测结果与根据序列分析得到的推论———CH1F蛋白可能是一个eIF 4A并不矛盾     

月季eIF－5A基因的表达增强宿主大肠杆菌对高温和低温的耐性

真核生物翻译起始因子（eIF－5A）是在调控生物生长发育、衰老与环境响应中起重要作用的蛋白质。设计eIF－5A基因的兼并引物,对月季受高温诱导的叶片cDNA进行PCR扩增,获得特异性片段回收、克隆和测序,确定该cDNA为月季eIF-5A(命名为RceIF5A),含有480bp的核苷酸,编码159个氨基酸。将该cDNA序列克隆到原核表达载体PET32a中,获得重组子pET32a－eIF5A。高温（50℃）和低温（4℃）胁迫下含有该基因的大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (pET32a-eIF5A)比E. coli BL21 (pET32a)有明显的抗性提高,据此认为含有重组子的E. coli BL21 (pET32a-eIF5A)对高低温的抗性可能与eIF-5A基因的表达相关。该基因的GeneBank登录号为 EF177192。     

紫杆柽柳与其它物种脂质转运蛋白基因编码蛋白的同源性比较

根据从柽柳cDNA文库克隆获得的脂质转运蛋白(LTP)的部分序列,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列.基因的5'非翻译区96bp,3'非翻译区222bp,开放阅读框285bp,编码94个氨基酸,预计蛋白的分子量为9.9 kD,等电点为8.02.此基因有8个位置保守的Cys残基及26个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY574218(基因)和AAS79106(蛋白).