大腹园蛛大壶状腺丝蛋白-1基因部分cDNA的克隆和序列分析

大腹园蛛大壶状腺表达拖丝蛋白新基因的克隆, 为进一步研究蛛丝蛋白基因以及人工表达蛛丝蛋白提供参考依据。文章利用“通用方法”即反转录—置换法构建大腹园蛛(Araneus ventricosus)大壶状腺(Major ampullate gland) cDNA文库, 并筛选出具有典型重复结构的大腹园蛛大壶状腺丝蛋白-1部分cDNA序列AvMaSp1 (GenBank登录号: AY177203)。该部分序列大小为1 408 bp, 编码区为1 288 bp, 编码氨基酸429个, 预测分子量为34.07 kDa, 典型的重复结构为 (GA)nAm(GA)N, 与十字园蛛(Araneus diadematus)丝蛋白基因ADF-1 (GenBank登录号: ADU47853)同源关系最近, 一致性为75.0%。     

三种类型蜘蛛丝的结构及生物学功能

利用付里叶变换红外光谱仪(FFIR)对棒络新妇(Nephila clavata)、悦目金蛛(Argiope amoena)的大壶状腺丝(拖丝)、悦目金蛛的捕丝(粘性螺旋丝)和卵袋丝这3种不同类型蜘蛛丝的二级结构进行了测试研究。结果表明：蜘蛛丝同时包含无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠构象;对这3种蛛丝的红外光谱进行比较表明同一蜘蛛的不同类型蛛丝所含的这3种二级结构的比例不同,这种不同组成的二级结构就赋予了蜘蛛丝不同的特性,这种特性又与其不同的功能相适应。此外,还用扫描电镜(SEM)和光学显微镜对悦目金蛛和小悦目金蛛(A．minuta)的拖丝和捕丝做了形态结构观察。蜘蛛丝这种天然动物蛋白纤维所具有的特殊的形态结构、蛋白质二级结构与其特殊的性能和生物学功能是高度一致的。     

大腹圆蛛主壶腹腺cDNA文库构建和丝蛋白基因筛选

首次通过反转录-置换法和使用pUC18质粒成功构建大腹圆蛛（Araneus ventricosus)主壶腹腺（major ampullate gland)cDNA基因文库,并以鸟枪法从中筛选出具有典型重复结构的大腹圆蛛主壶腹丝蛋白cDNA基因AvF1,大小为1744bp,编码区为1572bp,编码氨基酸524个,分子量为42489.55Da,典型的重复结构为（GGP）nGGX。与现有已知的蛛丝蛋白基因中三带金蛛（Argiope trifas-ciata)鞭毛样丝基因（AtfF)有最高的同源性69.3%。大腹圆蛛主壶腹腺cDNA文库的构建和蛛丝蛋白新基因的克隆,为提供大腹圆蛛蛛丝蛋白基因背景和进一步研究蛛丝蛋白奠定了基础。     

拟蜘蛛拖丝蛋白基因人工合成及其原核表达

根据GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)、拖丝蛋白基因的结构特点和密码子的简并性,设计378 bp的拖丝蛋白基因单体,并对其人工聚合成二聚体.Primer5.0分析结果表明,决定拖丝弹性和抗拉力的氨基酸(Gla和Ala)含量(41.43和18.22)接近天然丝蛋白氨基酸含量(42.81和26.32);利用Antheprot软件对二聚体编码氨基酸的二级结构预测结果显示,与丝蛋白的氨基酸链相近,由2个相同的部分排列而成,即β-片层(占48%)、6个α-螺旋间隔(占15%)、散在的转角(占12%)和若干不规则卷曲(占25%).将二聚体与pET-28a( + )连接构建原核表达载体,IPTG诱导重组菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为26.6×103 kD的重组蛋白.上述结果为进一步开展有关转蜘蛛拖丝蛋白基因在绵羊被毛中表达的研究奠定了基础.     

横纹金蛛捕食经验对其丝纤维力学行为与性能的影响

蛛网是蜘蛛的捕食工具,蛛网网丝的结构与性能不仅影响蜘蛛的捕食效率,也关系着蜘蛛的捕食投入。本文利用单纤维电子强力仪研究横纹金蛛(Argiope bruennichi)室内捕食面包虫(Tenebrio molitor)时上前与返回捕食拖丝的力学性能以及捕食经验对圆网半径丝修补前后的力学性能的影响。结果表明,与上前捕食拖丝相比,返回捕食拖丝减小了弹性区的投入,增加了屈服区和加强区的投入,且返回时捕食拖丝更具柔韧性。整体而言,与初始半径丝相比,在未喂食面包虫的条件下,网的半径修补丝增加了力学性能的投入;而在喂食面包虫的条件下,网的半径修补丝减少了力学性能的投入。所测试丝样中出现了两种类型的蛛丝力学行为:一种为典型的蛛丝力学行为;另外一种为似黏流性材料的力学行为,其反映的是满足蛛丝耗散猎物或自身下降时动能的另外一种力学性能的策略。本研究表明蜘蛛能根据其捕食经验遵循Cost-Benefit原则对蜘蛛丝的力学性能进行调节,从而调整捕食投入。     

悦目金蛛拖牵丝力学性能的变异

蜘蛛丝作为一种具有优良机械性能的天然动物蛋白纤维,其特有的结构和机械性能与其生物学功能密切相关。由大壶状腺纺出的拖牵丝在蜘蛛的行走、建网、捕食、逃生、繁殖等多种生命活动中均发挥了重要的功能,其机械性能会受到多种内外因素相互作用的影响。本文对在不同体重、不同猎物饲养和不同营养状态3种条件下人工抽出的悦目金蛛(Argiope amoena)拖牵丝与其不同单丝间的力学性能进行了比较研究。结果表明,悦目金蛛拖牵丝的力学性能在组间、组内不同个体,以及同一个体不同丝纤维间变异都较大。随着蜘蛛个体的增大,蛛丝横截面直径逐渐增大,这会使得蛛丝的力学性能更好,便于作为救命索的拖牵丝在遇到危险时承受蜘蛛体重;蜘蛛在经过1个月的饥饿后,蛛丝在屈服点附近的力学性能并未发生显著变化,而断裂点应变和断裂能均显著减小,同时也表明无论对于作为救命索还是网丝,拖牵丝的弹性形变性能在与蛛丝相关的微观进化中要优先于塑性形变。这是蜘蛛在能量摄入受到限制时对拖牵丝的投入权衡的结果。     

4种常见蜘蛛蛛丝光学显微镜观察及机械性能的测定

对4种常见蜘蛛大腹园蛛Araneus ventricosus、迷宫漏斗蛛Agelena labyrinthica、草间钻头蛛Hylyphantes graminicola和棒络新妇Nephila clavata蛛丝的物理特性和机械性能进行了初步研究.结果 表明:捕丝是由2根核心丝构成,4种蛛丝呈现不同的颜色;4种蜘蛛蛛丝的密度略有不同,棒络新妇的蛛丝密度最大,草间钻头蛛的蛛丝密度最小;蛛丝中棒络新妇的断裂伸长率和断裂强度都最大,分别为47.3%和852.6 Nmm-2,草间钻头蛛蛛丝的断裂伸长率和断裂强度都最小,分别为32.1%和652.3 Nmm-2.与其它物理化学材料相比,蛛丝具有优异的综合力学性能,生物学特性与生物学功能具有高度一致性.     

蛛丝蛋白的研究进展及应用前景

蛛丝蛋白是一种很特殊的纤维蛋白。由丙氨酸组成的β-折叠和富含脯氨酸的α-螺旋,及其紧密堆砌的二级结构使之成为一种半结晶状态的分子弹簧结构,决定了蛛丝具有强度高,韧性大等一些重要特点。对其蛋白质序列的组成与结构人们已基本研究清楚;蛛丝蛋白基因部分序列的克隆已取得成功,在基因表达方面也取得了一些进展。虽然由于蛛丝蛋白基因序列的高重复性、不稳定性和较长的基因序列,使得对蛛丝蛋白的全基因克隆变得困难重重,但是蛛丝蛋白独特的结构和性质,使其在医学领域尤其是组织工程方面有着诱人的前景 。     

蜘蛛拖丝蛋白基因的构建及在大肠杆菌中的表达

蜘蛛大壶腹线产生的拖丝是非常优良的纤维蛋白, 具有独特的强度和弹性。基于拖丝蛋白高度重复序列和部分cDNA序列, 合成蜘蛛拖丝蛋白基因单体, 通过头尾相连的构建策略, 得到拖丝蛋白多聚体, 与原核高效表达载体pET30a(+)连接, 转化大肠杆菌BLR(DE3), 用IPTG诱导表达。 表达产物经His.Bind树脂金属螯合亲和层析一步纯化, 纯度达90%以上, 表达量为20mg/L。SDS-PAGE和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为37kD, 其值与氨基酸组分分析结果与理论推算值基本符合。      

蛛丝蛋白的研究进展及应用前景

蛛丝蛋白是一种很特殊的纤维蛋白。由丙氨酸组成的β－折叠和富含脯氨酸的α－螺旋,及其紧密堆砌的二级结构使之成为一种半结晶状态的分子弹簧结构,决定了蛛丝具有强度高,韧性大等一些重要特点。对其蛋白质序列的组成与结构人们已基本研究清楚;蛛丝蛋白基因部分序列的克隆已取得成功,在基因表达方面也取得了一些进展。虽然由于蛛丝蛋白基因序列的高重复性、不稳定性和较长的基因序列,使得对蛛丝蛋白的全基因克隆变得困难重重,但是蛛丝蛋白独特的结构和性质,使其在医学领域尤其是组织工程方面有着诱人的前景。