人促红细胞生成素基因组基因的克隆及全序列分析

为了克隆到全长的人促红细胞生成素基因,从而在真核系统中及转基因动物乳腺中进行表达,从一个中国人的血细胞中提取基因组ＤＮＡ,构建了不完全基因组噬菌体文库,文库效价为５×１０４．这种文库的构建方法是用ＢａｍＨⅠ对基因组ＤＮＡ进行完全酶切,回收１０．５ｋｂ左右的酶切片段,插入到λ－噬菌体ＥＭＢＬ３载体中．筛选文库所使用的探针是用ＰＣＲ方法从基因组ＤＮＡ模板中扩增的５５６ｂｐ的ＥＰＯ基因片段．从该文库中筛选到了一个含有完整ＥＰＯ基因的插入片段长度为１２．５ｋｂ的阳性克隆．经全序列分析证实,所克隆的ＥＰＯ基因编码正确,但在５′－侧翼及第一内含子处与国外发表的序列相比较,发现两处核苷酸差异,这两个核苷酸的差异改变了５′－调控区的两个小的开放阅读框——ＯＲＦ１和ＯＲＦ３,其在基因表达调探方面的作用值得进一步探讨．     

红细胞生成素受体功能域的研究及其意义

红细胞生成素受体是细胞因子受体超家族成员之一,它在红细胞生成素诱导的红系祖细胞的存活,增殖,分化的过程中起着重要的调节作用,本文概述了红细胞生成素受体３个功能域的结构,主要功能及其在医药研究中的重要意义。     

人血小板生成素 cDNA 合成、克隆及序列测定

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从中国人胎肝总ＲＮＡ中扩增出人血小板生成素（ｈＴＰＯ）的ｃＤＮＡ。序列分析结果表明,我们所获得的ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ与献报道中的基因序列高度同源,其中第４９７ｂｐ、５９５ｂｐ、７６７ｂｐ和７９５ｂｐ位碱基分别由Ｔ、Ｇ、Ｔ和Ｔ代替了献中的Ｇ、Ａ、Ｇ和Ｃ,从而导致了１６６、１６９和２５６位氨基酸由报道中的Ｓｅｒ、Ｌｙｓ和Ｇｌｙ变为Ｐｈｅ、Ｇｌｕ和Ｖａｌ。     

人红细胞生成素受体的研究进展

人红细胞生成素受体(hEPOR)是位于相对成熟阶段人体红系祖细胞表面的跨膜蛋白,它能专一性结合人红细胞生成素(hEPO),将促进细胞生长、增殖和分化的信号传导到膜内,该过程涉及了hEPOR自身及部分相关蛋白的磷酸化.hEPOR具有一些与其功能相关的保守结构,它的氨基酸序列与鼠EPOR(mEPOP)高度同源.EPOR因为膜外R129C突变或结合特定蛋白质而具有组成型活性.EPOR还与红白血病等多种血液病密切相关.     

红细胞生成素受体研究进展

红细胞生成素受体是促红细胞生成素的作用受体 ,属于细胞因子超家族的成员。近年来 ,由于其克隆表达技术的应用使人们在对造血机制、EPO的信号转导机制 ,及利用其受体筛选 EPO类似物方面的研究有了新的进展。本文综合近年来有关文献对 EPO受体的研究作一概括性介绍。     

人血小板生成素 cDNA 合成、克隆及序列测定

利用ＲＴ-ＰＣＲ方法从中国人胎肝总ＲＮＡ中扩增出人血小板生成素（ｈＴＰＯ）的ｃＤＮＡ。序列分析结果表明,我们所获得的ｈＴＰＯｃＤＮＡ与文献报道中的基因序列高度同源,其中第４９７ｂｐ、５９５ｂｐ、７６７ｂｐ和７９５ｂｐ位碱基分别由Ｔ、Ｇ、Ｔ和Ｔ代替了文献中的Ｇ、Ａ、Ｇ和Ｃ,从而导致了１６６、１９９和２５６位氨基酸由报道中的Ｓｅｒ、Ｌｙｓ和Ｇｌｙ变为Ｐｈｅ、Ｇｌｕ和Ｖａｌ。     

红细胞生成素

红细胞生成素是一种调节红系祖细胞生长的细胞因子,近年来,尤其是大量重组Ｅｐｏ的生产,使Ｅｐｏ的基础及应用研究进入崭新时代,本文详述了Ｅｐｏ基因结构、蛋白质结构及生化特性,产生Ｅｐｏ的器官及其细胞定位的研究进展,体内Ｅｐｏ含量的细胞及分子水平调控的可能机制,Ｅｐｏ受体的种类,分子结构和蛋白质结构以及Ｅｐｏ与受体结合后信号传递的可能途径。     

红细胞生成素受体介导的细胞信息通路

红细胞生成素（Ｅｐｏ）是调节红系晚期祖细胞存活、增于和分化的主要生长因子。Ｅｐｏ通过结合细胞表面特异的红细胞生成素受体（Ｅｐｏ－Ｒ）而发挥功能。Ｅｐｏ可激活多条信息通路,且多条信息通路之间又有信息交谈（ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）,体现了Ｅｐｏ－Ｒ介导的信号转导的复杂性和特异性。     

促红细胞生成素与肿瘤

长期以来,促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)仅仅被认为对造血系统有着自己独特的作用。近年来,越来越多的研究表明,EPO及其受体在非造血系统,特别是对肿瘤的发生发展也起着作用。在肿瘤细胞的侵袭、转移、肿瘤血管形成过程中,EPO及其受体都有促进作用,而缺氧环境是肿瘤的一个重要的特征,缺氧诱导因子也可以促使EPO的释放。本文就EPO及其受体对肿瘤发展的影响作综述,为临床更好的利用EPO提供一定的理论基础。     

人促红细胞生成素受体胞外区基因的克隆及其在大肠肝菌中的表达

以人胎肝为材料,通过ＰＴ－ＰＣＲ的方法扩增出人促红细胞生成素受体（ｈＰｅｏＲ）的胞外区基因。将获得的或熟体胞外区基因起始密码子改构后克隆原核表达载体ｐＢＶ２２０中,进行原核温控诱导表达。表达产物经蛋白Ｎ端测序及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ实验证实表达产物是ｈＥｐｏＲ胞外区蛋白。利用上罐发酵培养获得的包涵体蛋白经复性纯化后,体外生物学活性检测表明表达产物可特 抑制ＴＦ－１细胞在Ｅｐｏ刺激下的生长,证实了     

LDL受体基因cDNA的RT－PCR分离、克隆及其在RFLP中的应用

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离低密度脂蛋白受体基因ｃＤＮＡ,将长为２６０５ｂｐ的ｃＤＮＡ插入质粒ｐＪＮ６,并经全序列测定证实,该序列与已报道序列相比,存在两个变异碱基,即第７５４位Ｃ→Ｔ,和１６５４位的Ｇ→Ａ,这两个变异碱基并不改变编码的氨基酸,利用ＬＤＬ受体基因ｃＤＮＡ中的ＣｌａⅠ片段作为探针,检测到ＬＤＬ受体基因上外显子８的ＳｔｕⅠ位点是个限制性片段长度多态性位点。所克隆的ｃＤＮＡ含有可译框架的全部密码,因此可作为基因表达材料。     

三种猕猴属动物Fas基因的克隆

从腹股沟淋巴结或血液中提取总RNA,根据人的Fas基因的cDNA序列设计上、下游引物,通过RT-PCR扩增出三种猕猴属动物Fas基因的cDNA片段,将片段克隆到pGEM-TEasy载体中,筛选阳性克隆并进行序列测定。恒河猴Fas基因编码序列为1005bp,GenBank收录号为AY007572;熊猴的编码序列为996bp,GenBank收录号为AF326208;短尾猴的编码序列为933bp,GenBank收录号为AF332357。对五种已知的灵长类动物的Fas基因进行序列比较,结果表明Fas基因的保守区域具有高度保守性,而处于编码序列中间的一段低复杂度序列在不同的物种间具有很高的变异性。Abstract：Total RNA were extracted from inguinal lymph nodes o r blood.The Fas cDNA fragments of three macaca species were obtained by RT-P CR using the upper and low primers according to the Fas gene of human,and th en cloned into pGEM-T Easy vector.The positive clones were sequenced.For the fir st time we cloned the Fas genes of Macaca mulatta,Macaca assamensis and Macaca arctoides,the encoding sequences are 1005bp, 996bp and 933bp, respect ively.Finally we compared the sequences of Fas genes among five primate spec ies that have already been submitted to GenBank.The results confirmed the conser vation of regions in two ends of Fas genes,and the high variability of a low complexity region in middle of every Fas gene.     

赤链蛇不同组织Sox基因表达的RT-PCR分析

采用RT-PCR技术,研究了赤链蛇不同组织Sox基因的表达。通过PCR产物直接克隆法和SSCP技术筛选阳性克隆,分析了雄性睾丸和雌性卵巢组织中的Sox基因序列。结果显示,在赤链蛇雌雄成体组织中,Sox基因在睾丸、卵巢、脑和脾组织中均有不同程度的表达,而在雌雄成体肌肉组织中均无表达,显示该基因表达有一定的组织特异性。序列分析显示睾丸组织中表达的是DRSox3,卵巢组织中表达的是DRSox22。在Sox家族中,Sox3表达于中枢神经系统和尿生殖嵴的发育过程中;Sox22则表达于多种组织和神经系统中,可横跨CNS和PNS的整个过程。此结果表明Sox基因不仅在性别决定中起作用,还可能在胚胎发育过程中担负重要功能。     

Receptor binding of asialoerythropoietin.

The interaction of 125I-asialoerythropoietin (asialoepo) with receptors has been characterized both by binding assay and affinity cross-linking. Purified spleen cells from mice infected with the anemia strain of Friend virus (FVA cells) have receptors for 125I-asialoepo with two classes of affinity constant: one with Kd = 0.02-0.03 nM and 300-400 per cell, the other with lower affinity (Kd = 0.9-1.2 nM) and 1,000-1,200 per cell. The Kd value for the high affinity site is one-third of that for the binding of native 125I-erythropoietin (125I-epo) to the same FVA cells (Kd = 0.08-0.1 nM). Using 125I-asialoepo or 125I-epo affinity cross-linking methods, we find two components with apparent molecular weights of 88 kDa and 105 kDa in FVA cells, and in the transformed mouse cell lines, 201, IW32, and NN10, in agreement with earlier studies using 125I-epo. These results indicate that 125I-asialoepo binds to the same receptors as 125I-epo, but with greater affinity for the high affinity site. Since 201 cells contain only a single class of lower affinity receptors for erythropoietin (epo), finding the same two components as found for FVA cells by cross-linking experiment indicates that the two components do not represent the two classes of receptor.     

C57BL/6J小鼠脂肪组织总RNA提取及周脂素基因的克隆

目的用改进后的方法提取高质量的RNA,以此为模板,应用T-A克隆法克隆C57BL/6J小鼠周脂素基因编码区,对其进行测序验证,并与GenBank比对。方法在试剂说明书基础上,改进提取脂肪组织RNA的方法,从C57BL/6J附睾脂肪组织提取高质量的总RNA,用RT-PCR扩增出周脂素编码区基因,并将目的基因编码区克隆入pMD18-T载体中,转化E.coli JM109后,筛选阳性克隆,通过限制性内切酶酶切鉴定后,对其进行测序验证,并与GenBank比对。结果用改进后的方法成功提取出了高质量的总RNA,并且成功提取构建的重组载体中含有周脂素基因的全长序列,与GenBank公布的序列一致。结论改进的后的脂肪组织RNA提取方法是可行的,并获得周脂素基因的cDNA,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

Sterol Composition in the Pollens of Citrus unshiu Marcov. and Citrus sinensis Osbeck

Bacillus brevis secretes a large amount of cell wall proteins into the culture medium. For construction of Bacillus brevis expression-secretion vectors of human erythropoietin (EPO) and the extracellular domain of mouse erythropoietin receptor (sEPOR), cDNA for each mature form was inserted into a plasmid containing the promoter region and the signal-peptide encoding region of a cell wall protein. Culture supernatants of transformants were affinity purified using a monoclonal antibody-fixed gel for EPO and an EPO-fixed gel for sEPOR. The affinity purification efficiently removed unwanted proteins, giving samples with sufficiently high purity to analyze amino acid sequences of N-terminal regions and biological activities. Combination of this secretory production and affinity purification may facilitate isolation of a large amount of pure EPO and sEPOR, and is useful for further understanding the molecular mechanism of interaction between EPO and EPOR.