相容溶质四氢嘧啶与羟基四氢嘧啶的代谢调控研究进展

四氢嘧啶(Ectoine)及其衍生物羟基四氢嘧啶(5-hydroxyectoine,5-HE)是嗜盐微生物胞内合成的一类能够抵抗外界高盐胁迫的相容溶质,具有细胞、细胞膜、蛋白质和核酸的保护作用,可抵抗高盐、高温、冷冻和干燥等极端环境因素的刺激,从而倍受关注。本文对不同类型微生物Ectoine/5-HE(Ects)生物合成代谢、分解代谢以及吸收/转运系统涉及的调控机制进行综述,以期为Ects合成产量的提升与高效积聚策略的优化,提供一定的理论参考依据。     

相容溶质四氢嘧啶的微生物合成研究进展北大核心CSCD

四氢嘧啶(ectoine)作为一种氨基酸的衍生物,是嗜盐微生物胞内重要的天然次级代谢物,具有保护细胞和稳定生物大分子的功能,可广泛应用于药物制备佐剂、器官移植与保存、皮肤创伤修复与新型化妆品研发等生物医学领域。由于四氢嘧啶的医用价值和商业市场需求,文中从野生菌株的筛选与诱变育种、构建基因工程菌株与系统代谢整合工程菌株、四氢嘧啶的优化发酵与生产工艺以及抽提纯化工艺等方面,系统论述了四氢嘧啶高效积聚和过量化生产研究策略,并展望多组学、计算生物学及“细胞工厂”等技术在后续四氢嘧啶高效生产上的应用前景。     

相容性溶质四氢嘧啶及其羟基化衍生物的研究进展

四氢嘧啶类化合物是嗜盐以及耐盐菌胞内合成的一类能够抵御外界高盐胁迫的相容性溶质,概述了四氢嘧啶及其衍生物的理化特征以及在嗜盐微生物中抵御外界高渗透压的作用机理,主要阐述了四氢嘧啶类相容性溶质的生物合成途径、膜运输机理、分泌释放机制、高密度发酵生产等方面在细胞、分子水平上的最新研究进展以及前景展望。并且综述了四氢嘧啶类在精细化工、生物医药及生物制造等行业的应用研究以及发展前景,探讨了未来的研究方向。     

一株可用于四氢嘧啶制备的中度嗜盐菌

<正>四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸)是中度嗜盐细菌的一种渗透压补偿性溶质[1],可以平衡细胞的渗透压,并且在高温、冷冻和干燥等逆境下,对酶、DNA、细胞膜和整个细胞提供保护作用,因此四氢嘧     

嗜盐细菌中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生物合成及其生物学功能

在嗜盐细菌盐适应中,四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸)和羟基四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸)发挥着十分重要的作用.四氢嘧啶的生物合成以L-天冬氨酸-β-半醛(ASA)为底物,依次由2,4.二氨基丁酸转氨酶(EctB),2,4--氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)和四...     

四氢嘧啶羟化酶的研究进展

作为相容性物质,5-羟化四氢嘧啶不仅可以调节渗透压,还可以稳定蛋白结构,在医药、生物制造和化工行业具有广阔的发展前景。四氢嘧啶羟化酶属于Fe2+与2-酮戊二酸依赖型双加氧酶超家族,主要催化四氢嘧啶生成5-羟化四氢嘧啶。我们简要介绍了四氢嘧啶羟化酶的基因来源、活性检测、蛋白结构、催化机理及活性中心等方面的研究进展。     

中度嗜盐菌四氢嘧啶合成基因的克隆与功能分析

中度嗜盐菌Bacillus alcalophilus DTY1分离自晋西北黄土高原盐碱土壤, 能够产生耐盐相关的相容性溶质四氢嘧啶。为了研究四氢嘧啶的功能, 克隆了DTY1菌株四氢嘧啶合成基因簇ectABC。ectA、ectB和ectC分别编码169、428和132个氨基酸的肽链, 分别与B. halodurans C-125中的二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC)同源性达59%、81%和81%。将携带该基因簇的4.0 kb片段转入蜡质芽孢杆菌B. cereus Z后, 芽孢杆菌的耐盐度显著提高。HPLC检测发现, 在1.0% NaCl浓度下, 转化菌B. cereus Z-E菌株生成70.1 mg/g四氢嘧啶, 而在5.0%的NaCl浓度下四氢嘧啶的产量高达118.6 mg/g, 显著高于B. alcalophilus DTY1的四氢嘧啶产量。而且随着盐浓度的提高, 四氢嘧啶的合成量也随之提高。由此证明四氢嘧啶参与中度嗜盐菌重要的渗透调节, ectABC的表达受盐诱导。     

中度嗜盐菌四氢嘧啶合成基因的克隆与功能分析

中度嗜盐菌Bacillus alcalophilus DTY1分离自晋西北黄土高原盐碱土壤, 能够产生耐盐相关的相容性溶质四氢嘧啶。为了研究四氢嘧啶的功能, 克隆了DTY1菌株四氢嘧啶合成基因簇ectABC。ectA、ectB和ectC分别编码169、428和132个氨基酸的肽链, 分别与B. halodurans C-125中的二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC)同源性达59%、81%和81%。将携带该基因簇的4.0 kb片段转入蜡质芽孢杆菌B. cereus Z后, 芽孢杆菌的耐盐度显著提高。HPLC检测发现, 在1.0% NaCl浓度下, 转化菌B. cereus Z-E菌株生成70.1 mg/g四氢嘧啶, 而在5.0%的NaCl浓度下四氢嘧啶的产量高达118.6 mg/g, 显著高于B. alcalophilus DTY1的四氢嘧啶产量。而且随着盐浓度的提高, 四氢嘧啶的合成量也随之提高。由此证明四氢嘧啶参与中度嗜盐菌重要的渗透调节, ectABC的表达受盐诱导。     

渗透压冲击下中度嗜盐菌Halomonas sp. Y四氢嘧啶类相容性溶质的合成与释放

【背景】四氢嘧啶类物质在高温、冷冻和干燥等逆境条件下,对酶、蛋白质、核酸及整个细胞具有良好的保护作用,已经应用于酶制剂、生物医药及护肤品等相关领域。目前此类物质只能依赖中度嗜盐菌采用细菌泌乳工艺进行商业化生产,因此四氢嘧啶类高产菌株及其发酵技术的研究日益受到国内外研究者关注。【目的】分离获得高产合成四氢嘧啶类相容性溶质的中度嗜盐细菌,研究渗透压冲击对其胞内四氢嘧啶合成与释放的影响,探索细菌泌乳法制备四氢嘧啶的可行性。【方法】采用涂布平板法分离中度嗜盐菌,对分离菌株进行形态、生理生化和16S rRNA基因序列分析,鉴定其种属;采用高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)分析四氢嘧啶类物质,细菌泌乳法制备四氢嘧啶类物质。【结果】从盐池土样中分离到一株以四氢嘧啶类物质为主要相容性溶质的中度嗜盐菌Y,鉴定为盐单胞菌(Halomonas sp.)Y。盐单胞菌Y能在NaCl质量浓度为10-250 g/L的培养基中生长,最适生长的NaCl浓度为100 g/L;HPLC-MS测试结果证明盐单胞菌Y可同时合成四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶2种相容性溶质,在最适生长的盐浓度下其合成量分别达175.5 mg/g和47.9 mg/g;在NaCl质量浓度为0-30 g/L的低渗溶液中胞内四氢嘧啶类物质经5 min即可达到最大释放率,而细菌泌乳工艺中最适合诱导四氢嘧啶释放的低渗溶液为质量浓度为10 g/L的NaCl溶液;采用细菌泌乳工艺制备四氢嘧啶,经连续11轮的高渗/低渗冲击,四氢嘧啶总合成量为6.0 g/L,总释放量为5.7 g/L,平均释放率为64.5%,底物转化率为128.9 mg/g。【结论】盐单胞菌Y是一株较高产合成四氢嘧啶类的中度嗜盐菌,能够耐受反复的渗透压冲击,采用细菌泌乳工艺显著提高了四氢嘧啶的制备效率。     

四氢嘧啶微生物合成与应用研究进展

极端环境微生物定义了生命的边界。为了适应各种极端环境,极端环境微生物通过合成许多独特的活性化合物来保护自己。四氢嘧啶就是其中一种代表性的保护性物质。它最早是从极端嗜盐菌中发现的,作为调节细胞渗透压的一类相容性溶质,可以帮助微生物适应高盐等恶劣环境。研究发现四氢嘧啶不仅是一种重要的渗透压调节剂,还是一种高效的生物保护剂,可以帮助蛋白、核酸、生物膜乃至整个细胞对抗高温、干燥、冷冻和辐射等多种逆境。因此,四氢嘧啶在生物保护、生物医药和生物科技等众多领域展现出广阔的商业化应用前景。随着合成生物学和代谢工程技术的快速发展,传统的嗜盐菌四氢嘧啶生产方法已逐步被产率更高、环境更友好的生物工程菌及技术所取代。本文围绕四氢嘧啶的微生物合成及其应用研究进行综述,为后续四氢嘧啶的开发和应用提供重要参考。     

四氢嘧啶羟化酶的克隆表达、酶学性质及其在羟基四氢嘧啶合成中的研究

四氢嘧啶羟化酶(EctD)是双加氧酶超家族的重要成员,其底物四氢嘧啶和产物羟基四氢嘧啶的应用广泛,因此EctD在生物制造领域具有重要的应用价值。从来源于新疆盐湖的需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens)中获得四氢嘧啶羟化酶基因(ectD),并在E.coli BL21(DE3)中进行表达,对异源表达的EctD酶学性质进行研究。结果表明：EctD的最适温度是30℃、最适pH是7.5,在30℃、pH 6.5～8.0条件下具有较好的稳定性;Fe²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺和Ca²⁺离子可增强EctD的酶活,而Co²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺离子明显抑制EctD的酶活;动力学参数为K_m=7.63 mmol/L、k_cat/K_m =1.01 1 L/(mmol·s)、V_max ...     

盐单胞菌属BYS1四氢嘧啶合成基因ectABC克隆及其盐激表达

利用SEFA-PCR技术从中度嗜盐菌Halomonassp.BYS-1总DNA中克隆了四氢嘧啶合成基因ectABC及其上游序列(GenBank accession number DQ017757);OMIGA软件分析结果显示ectA、ectB、ectC位于同一个操纵子上,大小分别为573bp1、251bp和387bp,预测编码的DAT(L-二氨基丁酸转氨酶)、DAA(L-二氨基丁酸乙酰转移酶)和ES(四氢嘧啶合酶)大小分别为21.1kDa(191 amino acid)、45.7kDa(417 amino acid)和14.5kDa(129 amino acid);将包含ectABC基因及其上游1000bp序列的片段克隆到pUC19中并转化E.coliDH5α,转化子E.coli(pUC19ECT)能够在盐激条件下合成四氢嘧啶,但其耐盐能力没有得到显著改善。     

以四氢嘧啶为主要相容性溶质的中度嗜盐菌I15的分离和特性研究

从草地土壤中分离到一株中度嗜盐菌I15,经过16S rDNA(GenBank登录号为DQ010162)序列分析、形态学和生理生化特征分析,该菌株初步鉴定为Virgibacillus marismortui。I15能在0%～25%NaCl的培养基中生长,最适生长NaCl浓度为10%,最适生长温度为30℃,最适pH为7.5～8.0。在高盐条件下,I15细胞内主要的相容性溶质为四氢嘧啶,在15%NaCl培养基中其含量达到1.608mmol/(g\5cdw),占到相容性溶质总摩尔含量的89.6%。渗透冲击试验表明I15细胞内四氢嘧啶在低渗冲击时能够快速分泌到细胞外,在高渗冲击冲剂时能够较快地重新合成。     

高盐盐湖可分离嗜盐耐盐菌的种群多样性及四氢嘧啶产量评价

为了解柴达木盆地茶卡盐湖、柯柯盐湖和小柴旦盐湖等三大硫酸镁亚型高盐盐湖可分离嗜盐耐盐菌的种群多样性,采用RM中、高盐培养基筛选分离可培养的嗜盐菌和耐盐菌,扩增16S rRNA基因序列进行种属鉴定和环境因子典范对应分析(CCA),选取优势菌属构建系统发育树,并采用高效液相色谱法(HPLC)检测次级代谢产物四氢嘧啶(Ect...     

四氢嘧啶类物质的生物合成与转运途径及其生物学功能

四氢嘧啶类物质是目前发现的在细菌界分布最广泛的相容性溶质,它不仅是一种重要的渗透压调节剂而且也对遭受热变性、干燥、冷冻等不良环境胁迫的嗜盐菌和非嗜盐菌具有很好的保护作用.该文简述四氢嘧啶类物质在生物体内的积累途径及生物学功能方面的研究进展,并对其在农业和生物医学的应用前景进行展望.     

LATS1在食管鳞癌中的表达及启动子甲基化状态研究

在我们以前的研究中,在食管鳞癌细胞株中过表达大肿瘤抑制基因-1(large tumor suppressor kinase 1,LATS1)能够明显抑制细胞增殖、细胞迁移和侵袭,同时能够促进细胞凋亡。为了进一步研究LATS1基因在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用以及可能的机制,我们在食管鳞癌组织与配对癌旁组织中,应用免疫组化检测LATS1基因蛋白质表达情况,应用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测配对组织LATS1基因mRNA表达差异。甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐测序法(BGS)检测食管鳞癌组织及细胞中LATS1基因的CpG岛甲基化状态。我们发现LATS1基因在癌旁组织中广泛表达,而癌组织中LATS1基因表达明显下调。结果表明LATS1在食管鳞癌中起到抑癌基因的作用,并且与肿瘤的临床分期相关,而其下调与CpG岛的高甲基化无关。在食管鳞癌细胞中过表达LATS1抑制细胞增殖、细胞迁移和侵袭,同时能够促进细胞凋亡。因此,LATS1基因值得进一步探索作为食管鳞癌生物标志物的可能用途和未来分子诊断和治疗的目标。     

铃蟾肽对四氧嘧啶引起的大鼠糖尿病的预防作用

本工作从三个不同的层次对铃蟾肽防止胰岛 B 细胞损伤的作用进行了研究:(1)在整体水平,预先注射铃蟾肽(50μg/kg,iv)可明显抑制单独给予四氧嘧啶(200mg/kg,s.c.)引起的大鼠血糖升高和血浆胰岛素水平下降的趋势。(2)在离体胰腺灌流实验发现,在四氧嘧啶之前预灌流铃蟾肽(10~(-2)mmol/L)可使胰腺对高糖刺激产生反应性分泌;而仅以四氧嘧啶灌流时,胰腺对高糖刺激无反应。(3)在离体胰岛水平,初步研究了在四氧嘧啶引起胰岛 B 细胞功能改变时,铃蟾肽对胰岛内胰岛素、胰高血糖素和生长抑素分泌的影响。结果表明,铃蟾肽可防止四氧嘧啶引起的胰岛素和生长抑素分泌的抑制及胰高血糖素分泌的增加趋势。     

古盐井中嗜盐菌的分离及四氢嘧啶的制备

[目的]分离鉴定古盐井中的嗜盐菌,确定相容性溶质,增加相容性溶质的合成。[方法]从盐井卤水中分离嗜盐菌,对菌株进行形态、生理生化和16S rRNA分析,用高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)确定相容性溶质,以谷氨酸钠为唯一碳氮源来制备四氢嘧啶。[结果]菌株S2为色盐杆菌属;相容性溶质为四氢嘧啶; 1. 5 mol/L Na Cl时四氢嘧啶达到最适合成浓度,为0. 168 3 mg/mL,单位质量合成量为238. 201 mg/g;以谷氨酸钠为唯一碳氮源时,相同体积发酵液中四氢嘧啶的总合成量与单位质量合成量均增加,四氢嘧啶合成量为0. 184 8 mg/mL,单位质量合成量为390. 389 mg/g。[结论]成功分离出了产四氢嘧啶的嗜盐菌,并且以谷氨酸钠为唯一碳氮源时四氢嘧啶合成量大大增加。     

四氢嘧啶吸收缺陷突变株高效制备四氢嘧啶

【目的】为进一步提高四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸;1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid;ectoine)合成效率,【方法】利用步移PCR方法克隆了Halomonas salina DSM 5928T四氢嘧啶特异性转运蛋白(ectoine-specific transporter;TeaABC)编码基因teaABC,Red重组技术构建了四氢嘧啶吸收缺陷突变株H.salina DSM 5928T(teaABC-)。【结果】H.salina DSM 5928T(teaABC-)10 L发酵罐的四氢嘧啶发酵,四氢嘧啶总浓度9.10(±0.08)g/L,合成效率为9.93(±0.09)g/L.d。【结论】四氢嘧啶吸收缺陷突变株H.salina DSM 5928T(teaABC-),解除了四氢嘧啶吸收对其合成的负反馈调节,从而显著提高了四氢嘧啶合成效率。     

Halomonas venusta DSM4743渗透压冲击下四氢嘧啶合成与释放

选择耐受较高NaCl浓度,而且四氢嘧啶胞内浓度阈值较高的菌株,研究其四氢嘧啶发酵条件和工艺,对于提高四氢嘧啶的制备效率具有实际意义。考察了碳源、NaCl浓度、酵母膏添加量对Halomonas venustaDSM4743四氢嘧啶合成的影响,考察了优化条件下的四氢嘧啶分批发酵进程,并利用"细菌挤奶"工艺制备四氢嘧啶。结果表明:谷氨酸单钠为唯一碳氮源、NaCl浓度为1.5mol/L、酵母膏添加量为0.5%的条件有利于四氢嘧啶合成。在优化条件下10L发酵罐分批发酵,四氢嘧啶最大合成量为3.2g/L,合成效率为2.7g/(L.d)。通过"细菌挤奶"工艺制备四氢嘧啶,6个渗透压冲击循环后,四氢嘧啶总合成量为14.7g/L,总释放量为14.3g/L,平均释放率为97%,合成效率2.1g/(L.d)。中度嗜盐菌Halomonas venusta DSM4743耐受较高浓度的NaCl,而且四氢嘧啶胞内浓度阈值较高,优化的发酵条件及"细菌挤奶"工艺,获得了较高的四氢嘧啶制备效率。