磁珠固定化结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶及其表征

比较Ni~(2+)-NTA磁珠和羧基磁珠固定结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mycobacteriumtuberculosis dihydrofolate reductase,Mt DHFR),探索适合小分子配体混合物库筛选的Mt DHFR固定化方法。重组表达带6×His标签Mt DHFR,纯化后表征酶学性质,比较用Ni~(2+)-NTA磁珠和羧基磁珠固定化时相应固定化容量、保留活性、稳定性及对抑制剂响应。结果表明,Ni~(2+)-NTA磁珠对Mt DHFR固定化容量为(93±12)mg/g磁珠(n=3),但酶比活保留不超过32%,Ni~(2+)明显抑制酶活性,EDTA与Ni~(2+)呈协同抑制效应,Fe~(3+)无显著干扰。羧基磁珠活化固定Mt DHFR的容量(8.6±0.6) mg/g磁珠(n=3),固定化酶比活保留(87±4)%(n=3)。在含50 mmol/L KCl的100 mmol/L HEPES (pH 7.0)中,游离和固定化Mt DHFR在0℃保存16 h活性都无显著改变,但在25℃保存16 h,游离酶活性下降近60%而羧基磁珠固定化Mt DHFR活性下降仅35%。甲氨喋呤对游离Mt DHFR和固定化Mt DHFR的IC50无显著差异(P0.05)。综上,Ni~(2+)-NTA磁珠不适合固定化Mt DHFR;羧基磁珠固定化Mt DHFR能保留活性、热稳定性及对抑制剂的响应,该固定化方法有望用于快速筛选其配体混合物库。     

磁珠固定化凝血酶的制备及其在槐米活性化合物筛选中的应用

槐米是药食两用植物,有清肝明目和凉血止血之功效;其主要化学成分为黄酮类物质,具有抗氧化、抗凝血、降血压等多种生物活性。本文将凝血酶(THR)固定于氨基修饰的磁珠表面,以其为亲和固相萃取吸附剂,开发出一种快速筛选中药中凝血酶抑制剂的方法。首先合成了表面修饰氨基的磁珠,然后以戊二醛作为交联剂将凝血酶共价固定于磁珠表面得到磁珠固定化的凝血酶(MNP@THR)。利用TEM,VSM,FT-IR等对合成的固定化酶进行了表征,同时获得了优化的合成条件为:THR浓度200μg/mg,pH值7. 0,时间60 min,温度37℃为最佳合成条件,此时酶的固定化量为65μg/mg。利用MNP@THR从槐米提取物中特异性地吸附得到两个活性化合物,并通过磁分离进行前处理后,由HPLC-ESI-MS鉴定其分别为槲皮素和芦丁。通过体外酶活抑制实验测出,槲皮素具有较好的抑制活性,其半数抑制浓度IC_(50)为16. 6±0. 68μM;芦丁的凝血酶抑制活性较弱,IC_(50)值为1. 5±0. 14 m M。     

虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇甙及大黄素的综合提取工艺研究

采用HPLC法,以白藜芦醇、白藜芦醇甙及大黄素的含量为指标,对虎杖中的有效成分进行了综合提取,通过正交实验,确定出乙醇溶剂提取的最佳工艺为：以80％的乙醇水溶液为提取剂,液固比为12：1,在70℃下提取2次,每次提取2h,HPLC法测定结果表明,从虎杖中提取的有效成分的含量分别可达：白藜芦醇为2．40mg／g,白藜芦醇甙为18．12mg／g,大黄素为16．82m/g。     

螺旋藻源血管紧张素转化酶抑制肽的纯化和鉴定

血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂通过影响肾素-血管紧张素系统,对减缓和抑制高血压具有重要的作用.该研究通过超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱等方法,从钝顶螺旋藻的木瓜蛋白酶水解液中分离、纯化得到一种血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,并利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和氨基酸测序对纯化肽进行鉴定.此外,对其抑制类型和体外模拟消化环境稳定性也进行了研究.结果表明,分子质量范围为0～3000ku的酶解液ACE抑制活性最高,IC50值为(1.03±0.04)g/L.该部分酶解液通过纯化获得ACE抑制肽,IC50值为(0.0094±0.0002)g/L,相当于(27.36±0.14)μmol/L,序列经鉴定为Val-Glu-Pro.Lineweaver-Burk图和Dixon图表明该ACE抑制肽为非竞争性抑制剂,Ki值为(23.59±0.54)μmol/L.体外稳定性实验显示,该抑制肽在胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶等胃肠蛋白酶的消化下能够保持良好的抑制活性,表明螺旋藻源ACE抑制肽可以用于降血压功能食品和药剂方面,具有很好的发展前景.     

植物来源的脂肪酶抑制剂的筛选

目的：随着人们生活水平的不断提高,肥胖问题日趋严重。胰脂肪酶抑制剂是药物治疗肥胖的有效途径之一,本文主要通过筛选一些植物来源的化合物来寻找具有胰脂肪酶抑制作用的天然活性物。方法：以4-甲基伞形酮油酸酯作为底物,用荧光检测的方法测定对胰脂肪酶（triacylglycerol lipase,EC 3.1.1.3）的抑制活性。结果：皂苷类化合物可有效地抑制胰脂肪酶的活性,其中薯蓣皂苷,毛地黄皂苷和皂树皂苷的活性较强,IC50值分别为3.5μM、2.7μM和3.0μg/mL。黄酮类化合物也有抑制脂肪酶活性的作用,在浓度为100μM时,对胰脂肪酶活性的抑制率在35.7%到68.2%之间。相比之下,相同浓度的苷元类化合物和咖啡酸衍生物对胰脂肪酶活性的抑制作用低于50%,而氨基糖类化合物的抑制率则低于15%。结论：皂苷这类植物的次级代谢产物具有良好的抑制脂肪酶活力的作用,黄酮次之,并且这两类化合物是从植物中提取的,毒性小,安全性高,可以为进一步研发治疗肥胖药物提供理论依据。     

黑木耳中抑制胰脂肪酶活性物质的提取工艺及体外抑制效果

本文以黑木耳醇提物和水提物为研究对象,以对胰脂肪酶活性的抑制率为指标,分别对其提取工艺进行了单因素和正交试验,选取优化后抑制率高的提取物进行抑制类型和3T3-L1前脂肪细胞方面的研究。结果表明醇提物的最佳提取工艺为提取温度70℃、提取时间1h、乙醇浓度90%、料液比1:20,抑制胰脂肪酶的IC₅₀=681.56μg/mL。水提物的最佳提取工艺为提取温度70℃、提取时间2h、料液比1:40,抑制胰脂肪酶的IC₅₀=850.59μg/mL,醇提物的抑制效果优于水提物。醇提物对胰脂肪酶的抑制类型为非竞争性抑制,抑制常数为4.69mg/mL;醇提物浓度低于1mg/mL时,对3T3-L1前脂肪细胞的活性无影响;浓度高于400μg/mL时即可显著抑制前脂肪细胞的分化。     

波叶大黄多糖对胰腺五种酶的抑制作用

 本文报道波叶大黄多糖(Rheum hotaoense polysaccharide,RHP)对胰腺五种酶的抑制作用。结果表明。(1)RHP对胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰弹性蛋白酶和胰激肽释放酶均有很明显的抑制作用。IC_(50)分别为250μg/mL、21μg/mL、18μg/mL,189μg/mL和300μg/mL。(2)动力学研究表明,RHP对胰蛋白酶和胰脂肪酶的抑制均是非竞争性的,Km值分别为1.2×10~(-4)μmol/mL和1.2mg/mL,Ki值分别为355.0μg/mL和63.85μg/mL。(3)牛血清白蛋白(BSA)对RHP抑制胰蛋白晦和胰脂肪酶具有拮抗作用。当BSA浓度达72.0mg/mL时,对胰蛋白酶活性的恢复率为71.54％。当BSA浓度达20.0mg/mL时,对胰脂肪酶活性的恢复率为63.64％。上述结果表明,RHP对胰腺五种酶的抑制作用,可能是大黄治疗急性胰腺炎作用的生化机制之一,预示RHP在临床上将有重要应用前景。     

颗粒状固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium)胞外青霉素酰化酶通过共价键结合到聚合物载体EupergitC颗粒环氧基团上 ,制成的颗粒状固定化青霉素酰化酶表现活力达 1 40 0 μ/g左右。固定化酶水解青霉素的最适 pH8 0 ,最适温度为 55℃。在pH6 0～ 8 5、温度低于 40℃时固定化酶活力稳定。在 pH8 0、温度 37℃时 ,固定化酶对青霉素的表现米氏常数Ka为 2×1 0 - 2 mol/L ;苯乙酸为竞争性抑制剂 ,抑制常数Kip为 2 8× 1 0 - 2 mol/L ;6 APA为非竞争性抑制剂 ,抑制常数Kia为 0 1 2 5mol/L。固定化酶水解青霉素 ,投料浓度为 8% ,在使用 2 0 0批后 ,保留活力 80 %左右 ,6 APA收率平均达 89 48%。     

制何首乌提取物及主要单体成分体外对酪氨酸酶活性的影响

采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法,体外评价制何首乌水提取物、乙醇提取物各分离组分及大黄素,大黄素甲醚,大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷,2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷等制何首乌主要单体成分对体外酪氨酸酶活性的影响。结果未在制何首乌中发现能够体外有效激活酪氨酸酶活性的成分,制何首乌水提物,制何首乌乙醇提取物的50%乙醇洗脱物及95%乙醇洗脱物,2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷皆有浓度依赖的酪氨酸酶抑制活性,其中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在48μg/mL的浓度下即可达到46.72%的抑制率,具有美白产品研发价值。     

胰脂肪酶抑制剂产生菌的筛选

本研究采用胰脂肪酶抑制剂筛选模型结合淀粉酶、蛋白酶抑制活性的测定,对来源于土壤的微生物进行高通量筛选,得到三株胰脂肪酶抑制剂产生菌FIM\|1013、FIL\|19和FIMe\|3,其发酵产物对胰脂肪酶活性的抑制率分别为61%、53%和42%,对淀粉酶活性的抑制率分别为0、7%和3%,对蛋白酶活性的抑制率分别为6%、4%和0。结果显示,筛选所得的三个菌株均能产生具有选择性的胰脂肪酶抑制剂,值得进一步的研究。     

补肾活血方中单体成分的体外炎性抑制作用研究

本文采用LC-MS技术进行定性分析,确定补肾活血方水提液中存在芍药苷、阿魏酸、白藜芦醇、蛇床子素及补骨脂素等单体化合物。利用酶联免疫法(ELISA)测定试药对模型细胞释放TNF-α、IL-6及NO的抑制作用。与空白组比较,模型组TNF-α、IL-6、NO含量明显升高(P0.0);与模型组比较,阿魏酸、白藜芦醇、补骨脂素及复方水提部位在100μg/m L,以及蛇床子素在20、100μg/m L均对TNF-α的释放具有显著的抑制(P0.01);阿魏酸及补骨脂素在100μg/m L,白藜芦醇及蛇床子素在20、100μg/m L均对IL-6水平具有显著的抑制(P0.01);芍药苷及复方水提部位在100μg/m L,阿魏酸、白藜芦醇、蛇床子素及补骨脂素在20、100μg/m L均对NO的释放具有显著抑制(P0.01)。结果表明单体对炎性因子的释放抑制作用总体上强于复方水提部位,提示补肾活血方的治疗骨关节炎活性可能是通过抑制炎症介质释放,降低TNF-α、IL-6、NO等含量发挥作用,这对验证复方药效活性,探究效应物质基础具有重要意义。     

齐墩果酸衍生物的合成及其对胰脂肪酶的抑制作用

本文首先以天然胰脂肪酶抑制剂齐墩果酸作为原料,设计合成新型齐墩果酸衍生物,并对其结构进行1H NMR、13C NMR及MS表征,然后采用对硝基苯酚法对其抑制胰脂肪酶作用进行研究,最后通过分子对接分析其相互作用机制。结果表明,2个全新合成的衍生物,齐墩果烷-28-β-内酯和齐墩果烷-28-α,β-不饱和酯,其抑制胰脂肪酶活性(IC_(50):16.4和18.5μmol/L)均显著高于齐墩果酸(IC50:87.7μmol/L),分别为齐墩果酸的5.35倍和4.74倍。齐墩果酸和齐墩果烷-28-α,β-不饱和酯属于混合型抑制,特别地,齐墩果烷-28-β-内酯转变为竞争型抑制。抑酶活性提高主要与胰脂肪酶形成的氢键数目及衍生物的疏水性有关。     

D301树脂固定化假丝酵母脂肪酶

本研究选择7种吸附和离子交换树脂进行了假丝酵母脂肪酶(Candida sp.lipase)的固定化试验,通过测定固定化后各脂肪酶的酶活,筛选出固定化效果较好的弱碱性阴离子交换树脂D301;并通过扫描电镜将D301与脂肪酶Novozym 435的表面形貌做比较,进一步选定D301树脂作为载体,并对其采用戊二醛交联固定化,研究并优化了其固定化条件。结果表明,5%戊二醛溶液的加入量为8mL,处理时间为5h,酶液浓度为1.0g/L,磷酸缓冲盐溶液pH6.0,固定化处理10h效果最好,获得的固定化酶活力可达35U/mg,酶的固定化效率约为3.5U/(mg·h)。     

柚皮素-7-O-乙酸酯和柚皮素-7-O-丙酸酯的制备及抗血小板聚集活性

为改善柚皮素的水溶性而不降低其抗血小板聚集活性,本文以柚皮苷为原料,经"4'位羟基苄基化-酸水解苷键-酰化-加氢脱苄基"四步反应,合成出柚皮素-7-O-乙酸酯和柚皮素-7-O-丙酸酯。两种衍生物在水中的溶解度分别为637.34±53.23μg/m L和59.74±4.81μg/m L,均高于柚皮素的溶解度。两种衍生物均对二磷酸腺苷诱导的兔体外和大鼠体内血小板聚集有显著的抑制活性,且抑聚率均高于柚皮素。实验结果表明,通过选择酰化柚皮素的7位羟基,引入含1~2个碳的短脂肪烃基链,能显著改善水溶性,提高抗血小板聚集活性。     

补肾活血方中单体成分的体外炎性抑制作用研究北大核心CSCD

本文采用LC-MS技术进行定性分析,确定补肾活血方水提液中存在芍药苷、阿魏酸、白藜芦醇、蛇床子素及补骨脂素等单体化合物。利用酶联免疫法(ELISA)测定试药对模型细胞释放TNF-α、IL-6及NO的抑制作用。与空白组比较,模型组TNF-α、IL-6、NO含量明显升高(P<0.0);与模型组比较,阿魏酸、白藜芦醇、补骨脂素及复方水提部位在100μg/m L,以及蛇床子素在20、100μg/m L均对TNF-α的释放具有显著的抑制(P<0.01);阿魏酸及补骨脂素在100μg/m L,白藜芦醇及蛇床子素在20、100μg/m L均对IL-6水平具有显著的抑制(P<0.01);芍药苷及复方水提部位在100μg/m L,阿魏酸、白藜芦醇、蛇床子素及补骨脂素在20、100μg/m L均对NO的释放具有显著抑制(P<0.01)。结果表明单体对炎性因子的释放抑制作用总体上强于复方水提部位,提示补肾活血方的治疗骨关节炎活性可能是通过抑制炎症介质释放,降低TNF-α、IL-6、NO等含量发挥作用,这对验证复方药效活性,探究效应物质基础具有重要意义。     

以MIF为靶标的抑制剂药物高通量筛选模型的建立和应用

旨在以巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)为靶标,采用紫外-分光光度法建立高通量药物筛选体系。对目的基因进行分子克隆,利用大肠杆菌原核表达系统进行纯化得到高纯度的目的蛋白,利用紫外-分光光度法构建酶活体系,并优化体系条件,建立合适的高通量药物筛选模型,最终从384种小分子中筛选出潜在的酶抑制剂。筛选模型构建成功,并筛选出酶活抑制率较高的小分子2种,测得半数抑制浓度IC50分别为59.07μmol/L、44.12μmol/L。针对MIF蛋白,建立了较理想的高通量药物筛选模型,适用于MIF蛋白酶活抑制剂的筛选,有利于后期的药物研发。     

条斑紫菜蛋白酶解产物中α-葡萄糖苷酶抑制剂纯化及特性

以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标,优选出1398中性蛋白酶、碱性蛋白酶和氨肽酶在一定条件下复配酶解条斑紫菜蛋白制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。酶解液加入乙醇至终浓度为60%以沉淀去除多糖,上清液为α-葡萄糖苷酶抑制剂粗品。该粗品利用SP Sepharose High Performance阳离子交换层析、Sephadex G-10凝胶层析和Mono Q阴离子交换层析进行分离纯化,获得一种肽类α-葡萄糖苷酶抑制剂(LGI)。LGI经反向高效液相层析测定纯度为62.4%,基本特性分析显示其具较好的温度和pH稳定性,对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50值为97.36μg/mL,属于一种非竞争性抑制剂。     

米胚芽中胰脂肪酶抑制剂的提取工艺

以米胚芽为原料,提取具有抑制胰脂肪酶活力的胚芽蛋白。经工艺优化得到提取条件为:原料颗粒60目,料液比1∶6,pH 10.18,温度55℃,提取时间4h,水提后离心速度4 456r.min-1,等电点沉降pH 5.1,等电点沉降后离心速度3 692r.min-1。在此条件下提取得到的胰脂肪酶抑制剂的蛋白质纯度为60.7%。15.18g/L的胚芽蛋白对30.1U/mg的猪胰脂肪酶的平均抑制率达71.17%。     

Extraction of Pancreatic Lipase Inhibitor from Rice Germ

以米胚芽为原料,提取具有抑制胰脂肪酶活力的胚芽蛋白.经工艺优化得到提取条件为:原料颗粒60目,料液比1:6,pH 10.18,温度55℃,提取时间4h,水提后离心速度4 456 r·min-1,等电点沉降pH5.1,等电点沉降后离心速度3 692r·min-1.在此条件下提取得到的胰脂肪酶抑制剂的蛋白质纯度为60.7％.15.18 g/L的胚芽蛋白对30.1 U/mg的猪胰脂肪酶的平均抑制率达71.17％.     

荷叶黄酮化合物对胰脂肪酶抑制作用的研究

荷叶粗粉用60%乙醇回流提取,经石油醚脱脂,再用聚酰胺柱色谱分离得到不同部位的黄酮提取物.通过比较50%乙醇洗脱部位的黄酮提取物和市售减肥药奥利司他(Orlistat)对胰脂肪酶的抑制作用,得到它们的半抑制率IC50分别为0.0076,0.0048 mg/mL.通过Lineweaver-Burk图和Dixon图的特征,表明该抑制剂对胰脂肪酶的抑制呈非竞争性抑制,抑制常数Ki=0.0147 mg/mL,米氏常数Km=42.2 ms/mL.