大肠杆菌L-酒石酸脱氢酶b亚基体外分子交联

通过PCR技术扩增大肠杆菌L-酒石酸脱氢酶b亚基(L-tartrate dehydratase beta subunit, TtdB)野生型与Cys/Ser突变型目的基因, 构建带6×His标签的诱导型表达载体pTrcHisC-TtdB。重组蛋白以包含体形式存在, 应用TALON固定化金属亲和树脂(Immobilized metal affinity chromatography, IMAC)以变性的方法纯化, 通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性, 复性率可达70%。将复性后的两种蛋白通过热诱导去折叠和氧化重折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验。SDS-PAGE分析表明: 野生型TtdB在其变性的临界温度反应时, 出现交联二聚体和多聚体; 在氧化重折叠后SDS-PAGE前加入100 mmol/L DTT时, 交联强度明显减弱。这种DTT打不开的交联即为异肽键交联; 若在其氧化重折叠反应液中加入DTT则没有任何交联。突变型TtdB在与野生型TtdB相同的热诱导去折叠条件下, 完全没有二聚体和多聚体的形成。     

白菜型油菜种子胰蛋白酶抑制剂纯化及部分性质研究

采用热变性、硫酸铵分步盐析及离子交换层析和分子筛层析等方法,从白菜型油菜种子中得到胰蛋白酶抑制剂(BNTI)。SDS-PAGE检测为单一条带,表明纯化的胰蛋白酶抑制剂电泳均一。SDS-PAGE测定其分子量约为14．4kD,等电聚焦测定其等电点约为4．7。BNTI具有较高的热稳定性。本文还考察了温度对溶液中BCH蛋白构象的影响,荧光光谱和测定抑制活力结果表明BNTI中的色氨酸和酪氨酸残基位于疏水部位。     

压强温度耦合作用下小蛋白去折叠过程的分子动力学模拟

在不同温度(280~540K)和压强(1×102~8×105 kPa)的耦合作用下,对GB1(the B1 domain of protein G)进行了56次独立分子动力学模拟,模拟时间达88.8 ns。在此基础上,研究了压强和温度对GB1去折叠过程的耦合效应。结果表明,压强对温度去折叠过程有明显影响,改变了蛋白质二级结构去折叠速度和蛋白质去折叠过程发生事件的先后次序。相同温度下,GB1的α-螺旋和β-折叠的稳定性随压强增大而提高;可及性表面积和其它结构特性参数随压强增大而减小。适度的压强(如2×105 kPa)会抑制温度导致的GB1二级结构去折叠速度,而更大的压强(如8×105 kPa)又加速了GB1的去折叠速度。在模拟的温度范围,当压强为100和2×105 kPa时,GB1疏水核协同暴露于水,而5×105和8×105 kPa时没出现此现象,这与最近的高压变性实验结果一致。     

大鼠前列腺前叶细胞两种受雄激素调节的mRNA核前体

在大鼠前列腺前叶细胞,雄激素在转录水平调节六种已知多肽的合成:前列腺结合蛋白(PBP)的三个亚肽、一种22KDa糖蛋白、亚精胺结合蛋白(SBP)和29KDa蛋白质。此外,尚有9.3KDa和13.5KDa的多肽,其相应的mRNA已由克隆的cDNA(~*119和~*92)杂交以及体外翻译系统证实。     

蚕氨基酸代谢之研究 Ⅱ.比较家蚕和野蚕谷氨酰胺酶及天门冬酰胺酶,蓖麻蚕丝腺体中天门冬酰胺酶之提取及其性质之研究

(1)比較家蚕(华九-云瀚)和野蚕(萞麻蚕、柞蚕和樗蚕)之谷氨酰胺酶及天門冬酰胺酶之活力,发現在萞麻蚕絲腺体后部之細胞顆粒部分中,存在有活力甚強之天門冬酰胺酶。(2)自萞麻蚕絲腺体后部提取之天門冬酰胺酶制品中,不含有谷丙轉氨酶、谷天轉氨酶及谷氨酰胺酶。(3)L-天門冬酰胺之酶促水解作用在1小时过程中,活力和作用时間基本土表現直线关系。(4)萞麻蚕絲腺体后部之天門冬酰胺酶和哺乳类动物、植物及微生物之pH影响相同;在pH5以下不稳定,最适pH为8。(5)天門冬酰胺酶对热不稳定,先以不同温度和酶溶液作用10分钟,60℃时,活力丧失80%左右。(6)对氯汞苯甲酸(10~(-4)M)抑制天門冬酰胺酶20%,溴化乙酰胺(10~(-3)M)及DL-环絲氨酸(10~(-3)M)抑制15%。     

石油降解菌的分子鉴定及降解能力研究

以六株具有石油降解功能的细菌(编号为GW40、GW101、GW109、GW117、GW157、GW159)为材料, 通过全细胞蛋白电泳聚类, 16S rRNA 基因系统发育分析和生理生化特性初步鉴定, 鉴定结果为不动杆菌属(Pseudomonas sp.)。并研究了不同pH, 温度和石油浓度对菌株降解石油能力的影响。SDS-PAGE 图谱分析结果表明, 在14.4-96.4KDa 范围内, 它们有92.3%以上相似性蛋白图谱, 证明它们属于同一类群; 16S rRNA 基因系统发育分析表明六株菌与不动杆菌属的亲缘关系较近, 因此把它们归到不动杆菌属。六菌株在pH 6.0-7.0, 温度为 30 ℃和石油浓度为2 g·L−1时, 对石油的降解率最大。     

粟酒裂殖酵母N-糖酰胺酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

根据GenBank中公布的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)N-糖酰胺酶(Png1p)cDNA序列, 设计并合成一对特异性引物, 利用RT-PCR技术从粟酒裂殖酵母中克隆出糖酰胺酶cDNA。将得到的基因克隆到表达载体pET-15b中。重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中, 经诱导表达和纯化提取后, 进行酶活测定。实验结果表明, 该酶的分子量约为39 kD, 纯化后的重组N-糖酰胺酶可以对变性处理的糖蛋白进行糖链的切除, 且这种作用需要还原剂DTT的辅助作用; N-糖酰胺酶只对错误折叠的糖蛋白有作用, 对天然的糖蛋白没有作用。等量粟酒裂殖酵母Png1p在不同温度、pH、DTT浓度和底物变性温度下对等量核糖核酸酶B(RNase B)的脱糖基化检测发现, 重组酶的最适反应温度30°C, 最适反应pH为7.0, 需要的最适DTT浓度为10 mmol/L, 底物在100°C处理10 min时酶的脱糖基化率最高。     

粟酒裂殖酵母N-糖酰胺酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

根据GenBank中公布的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)N-糖酰胺酶(Png1p)cDNA序列, 设计并合成一对特异性引物, 利用RT-PCR技术从粟酒裂殖酵母中克隆出糖酰胺酶cDNA。将得到的基因克隆到表达载体pET-15b中。重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中, 经诱导表达和纯化提取后, 进行酶活测定。实验结果表明, 该酶的分子量约为39 kD, 纯化后的重组N-糖酰胺酶可以对变性处理的糖蛋白进行糖链的切除, 且这种作用需要还原剂DTT的辅助作用; N-糖酰胺酶只对错误折叠的糖蛋白有作用, 对天然的糖蛋白没有作用。等量粟酒裂殖酵母Png1p在不同温度、pH、DTT浓度和底物变性温度下对等量核糖核酸酶B(RNase B)的脱糖基化检测发现, 重组酶的最适反应温度30°C, 最适反应pH为7.0, 需要的最适DTT浓度为10 mmol/L, 底物在100°C处理10 min时酶的脱糖基化率最高。     

用聚焦层析法纯化人巯基蛋白酶抑制肽C-hCRI_c

以肾衰病人尿为材料,通过碱变性、酸变性和热变性除去部分杂质和尿蛋白。然后用羧甲基-木瓜蛋白酶-琼脂糖4B亲和层析,最后用多缓冲剂聚焦层析,把人的巯基蛋白酶抑制肽C(human cysteine proteinase inhibitor C,简称 hCPI_C)和其他的hCPI_C分开,制备得高纯度、高活性的hCPI_C。在SDS-PAGE中为均一条带,每mg蛋白可抑制50单位木瓜蛋白酶活性的50-63％。     

小麦多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的部分结构

为了弄清小麦多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 (polygalacturonase inhibitingprotein ,PGIP)的作用机制 ,并为其在基因工程中的应用提供依据 ,对其结构进行了研究 .用Edman降解法测得小麦PGIP的N端序列为Lys Pro Leu Leu Thr Lys Ile Thr Lys Gly Ala Ala Ser Thr .用CD谱研究其二级结构 ,发现小麦PGIP天然态含有 4 3 7%的 β折叠和 13 1%的α螺旋 .酸碱和温度变性引起了二级结构改变 .不完全变性阶段 ,二级结构的变化表现为α螺旋无明显变化 ,β折叠遭到破坏 ;活性完全丧失阶段 ,β折叠变化很小 ,α螺旋含量明显减少 .用NR R(非还原 还原 )双向对角线SDS PAGE鉴定出小麦PGIP含有链内二硫键 .用去糖基化法确证了小麦PGIP的糖含量为 2 2 %.小麦PGIP与双子叶植物PGIP相比 ,一级结构差异较大 ,同源性由 36 %变为 9%;二级结构相似 ,都是高 β 折叠的蛋白 ;均具有链内二硫键 ;在糖含量上也相似 .研究结果为进一步弄清小麦PGIP作用机理打下了基础 ,同时对于植物抗赤霉病基因工程具有重要意义 .     

人重组PSP及其生物活性研究

为了获得人重组 persephin( PSP)并研究其生物学活性 ,从人胎脑组织中提取总 RNA,以RT- PCR方法获取编码人 PSP成熟蛋白 c DNA.将人 PSP c DNA插入含 T7启动子的质粒 p ET-2 8a( + ) ,构建表达质粒 p ET- PSP,转化大肠杆菌 BL 2 1 ( DE3)获得表达菌株 BLPSP,经 IPTG诱导表达的 PSP形成包含体 .凝胶自动扫描分析表明 ,PSP表达量约占菌体总蛋白 2 0 %以上 .用Ni2 + - NTA树脂一步法纯化目的蛋白 ,纯度达 85%以上 .纯化和复性的 PSP蛋白能显著促进脊髓神经元的存活 .     

差示扫描量热法分析Ca2+对嗜热菌来源的α-淀粉酶热稳定性的影响

采用毛细管差示扫描量热法,分析Ca~(2+)对嗜热菌Anoxybacillus sp.来源的α-淀粉酶AGXA的热稳定性的影响及其机制。脱气后的蛋白样品和缓冲液,分别加入对应的样品池和缓冲液池中,测量温度为10℃～120℃,升温速率为1℃/min。测量结果中,纵坐标为C_p,横坐标为温度,去折叠变化曲线峰最高点对应的横坐标为蛋白质去折叠温度T_m,去折叠变化曲线与对应温度的积分值为热焓变化值ΔH,范特霍夫焓变化值ΔH_v由去折叠变化曲线峰形状决定。根据改进的吉布斯-亥姆霍兹方程计算AGXA的自由能变化值ΔG,绘制AGXA自由能变化与温度关系的稳定性曲线。结果表明:有Ca~(2+)和无Ca~(2+)存在时,AGXA的ΔH_v与ΔH的比值都约等于1.0;有Ca~(2+)时,AGXA的T_m、ΔH和ΔC_p值,分别为77.8℃、292.5 kcal/mol和2.76 kcal·mol~(-1)·℃~(-1);无Ca~(2+)时,AGXA的T_m、ΔH和ΔC_p值,则分别为67.3℃、238.3 kcal/mol和3.81 kcal·mol~(-1)·℃~(-1);有Ca~(2+)时的AGXA,其T_m、ΔH值分别比无Ca~(2+)时的高,ΔC_p值则比无Ca~(2+)时的低。有Ca~(2+)和无Ca~(2+)的α-淀粉酶AGXA的热变性过程皆为不可逆的双态模式,有Ca~(2+)的AGXA,通过增大ΔH和降低ΔC_p的方式提高其热稳定性。研究揭示了Ca~(2+)提高AGXA的热稳定性机制,为进一步扩大该酶的应用提供了理论和实践支撑。     

动力学接触序: 基于量子跃迁的蛋白质折叠速率参数

把蛋白质折叠看成多肽链上扭转态间的量子跃迁, 依据构象动力学的量子理论, 提出用接触残基间多肽链转动惯量和扭转势能来表征接触特性的动力学接触序, 从而能定量地从动力学角度研究蛋白质折叠速率. 在80个蛋白的数据集上实验, 证实了构象量子跃迁观点的合理性并得到以下结论: (1) 折叠速率与接触转动惯量之间存在显著相关性; (2) 多态蛋白的折叠可以看成在同样转动惯量、温度等条件下的二态蛋白折叠基础上的中间态延迟, 并估计了延迟时间的数量级; (3) 折叠可以分为释能和吸能两类, 蛋白质折叠速率上限由释能折叠决定, 并导出大多数折叠速率大的二态蛋白的量子跃迁过程为释能反应, 而折叠速率小的多态蛋白为吸能反应.     

生物分离法制备细胞色素C质量的影响因素

细胞色素C为临床上应用广泛的生化药品。为了提高细胞色素C的质量,对制备过程中影响细胞色素C质量的因素进行考察,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对不同工艺制备的细胞色素C进行纯度分析,并对SDS-PAGE图谱中约2.5×10~4的蛋白质进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析与鉴定。结果表明:在SDS-PAGE电泳图中,使用三氯乙酸(TCA)沉淀剂的传统工艺制备的细胞色素C样品除了有1.22×10~4的细胞色素C,还包括1个约2.5×10~4的蛋白分子;而不使用三氯乙酸沉淀剂的新工艺制备的细胞色素C样品,仅有1.22×10~4的细胞色素C,而未发现约2.5×10~4的蛋白。SDS-PAGE图谱中分子量2.5×10~4的蛋白分子的LC-MS/MS分析与鉴定结果表明其与猪源细胞色素C覆盖率最大(达到76%),结合其分子量大小,可以证明该蛋白为细胞色素C二聚体。细胞色素C制备过程中三氯乙酸沉淀剂易导致细胞色素C形成二聚体,故三氯乙酸是影响细胞色素C质量的关键因素之一。     

人PSP94的分泌表达及其表达产物抗前列腺癌作用

将编码人 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 ( PSP94) c DNA与酵母整合载体 p PICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞 GS1 1 5,获得了 PSP94在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .诱导后的培养物中 ,rh PSP94表达量约为 0 .9mg/L,分子量约 1 6.5k D.培养上清经离子交换层析纯化后 ,目的蛋白的纯度为 92 % .体外在人前列腺癌细胞上活性分析表明 ,rh PSP94以1 0 0μg/L ,对该细胞的抑制率 2 0 .4% ;单纯新型 TNF,以 1 0 3 U/ml,抑制率 2 9.8% ;rh PSP94和新型 TNF以上述同样剂量联合应用 ,抑制率为 86.3% .提示 PSP94在体外对抗前列腺癌细胞有杀伤作用 ,但不明显 ;PSP94与新型 TNF联合应用 ,可使抑制率明显提高 ,可能 PSP94与新型 TNF有协同抗前列腺癌的作用 .     

不同水体营养条件对刺苦草和密刺苦草生长的影响

以贡湖水体营养盐水平现状[ρ(TN)0.4~4 mg·L-1、ρ(TP)0.04~0.4 mg·L-1]为依据,研究不同梯度营养盐水体对刺苦草(Vallisneria spinulosa)与密刺苦草(V.denseserrulata)生长及生理的影响,探讨同属沉水植物对不同营养水体的响应差异。结果表明:水体营养条件对两种沉水植物的生物量累积没有显著影响;处理组刺苦草的最大株高分别增加了19%(P0.05)、63%(P0.05)、205%(P0.01),密刺苦草高浓度中植株最大株高与低浓度差异显著(P0.05);刺苦草与密刺苦草在高浓度水体中的克隆繁殖能力分别下降了30%和20%;低浓度水体中刺苦草与密刺苦草叶片丙二醛含量增加(P0.05),叶绿素含量减少(P0.05),表明其受到养分胁迫;在ρ(TN)1.5~4 mg·L-1、ρ(TP)0.15~0.4 mg·L-1范围内,两种苦草表现出较强适应性。     

通过快速荧光动力学曲线探测白黄瓜光系统Ⅱ的热激胁迫效应

以耐热性较强的短粗型白黄瓜和长棒型白黄瓜为试材,并以耐热性较差的‘新泰密刺'和耐热性较强的‘津春4号'为对照品种,经热激胁迫后采用植物效率仪PEA测试,进行光系统Ⅱ(PSⅡ)快速叶绿素荧光诱导动力学分析(JIP-test)及其热稳定性的热力学分析.随着热激胁迫温度的升高(在30～57 ℃下5 min),表现为PSⅡ的最大光化学效率Fv/Fm、单位面积的光合机构含有的反应中心数目RC/CSo、放氧复合体活性ρk呈"S"型下降趋势;单位反应中心以热能形式耗散的能量DIo/RC呈"S"型上升趋势.综合分析反映出热激胁迫下PSⅡ反应中心的可逆失活、放氧复合体(OEC)的钝化和热耗散的三重机制在保护PSⅡ防止光抑制中起到重要作用.热激胁迫温度超过30 ℃时ρk就开始下降;超过40 ℃时RC/CSo开始下降;超过44 ℃以上,PSⅡ热耗散能力DIo/RC才表现出增加;超过51℃时,会加重耐热性较差的新泰密刺品种PSⅡ热耗散机构对PSⅡ保护的负担.通过标准状态变性自由能变ΔGD计算的变性中点温度Tm表明,PSⅡ蛋白复合体的热稳定性优于PSⅡ反应中心复合体热的稳定性和放氧复合体(OEC)的热稳定性.对于Fv/Fm、RC/CSo、和ρk的Tm均呈现出津春4号耐热性较强,新泰密刺耐热性较差,长棒型白黄瓜和短粗型白黄瓜耐热性居中.     

尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素DaHT-3的纯化与性质

被尖吻蝮蛇咬伤会引起严重的出血,对蛇毒出血毒素的研究有利于治疗蛇伤出血药物的筛选.通过SephadexG-75,DEAE-SephadexA-50,SephadexG-200和两次PBE聚焦层析,从尖吻蝮蛇(Dienagkistrodonacutus)蛇毒中纯化到一个分子量为56000的出血毒素(DaHT-3),经氨基酸组成测定计算,由487个氨基酸残基组成.此成分在SDS-PAGE上显示出一条均一的蛋白染色带,用等电聚焦电泳测定,其pI为5.50.该出血成分的最小出血剂量是2.6μg,具有蛋白水解酶活力,其活力为3.68,但没有精氨酸酯酶和磷脂酶A2活力.用红外光谱仪研究DaHT-3在溶液中酰胺I带的吸收谱,该毒素含有31.8%的α螺旋、56.1%的β折叠和12.1%的转角;当加入EDTA螯合剂去除金属离子后,它们的α螺旋、β折叠、转角和无规卷曲分别变为11%、26.4%、46.2%和16.5%,而出血活力和蛋白水解酶活力均丧失,表明该出血毒素是金属蛋白酶     

多刺蚁属细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ序列变异及其进化关系

从Gen Bank下载多刺蚁属26个不同种的细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COXⅡ)蛋白部分氨基酸序列进行分析,研究多刺蚁细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的氨基酸序列变异和系统进化关系。多刺蚁属种间存在氨基酸变异位点84个,占总氨基酸数目的 36%,而N端跨膜螺旋区氨基酸保守性最高。采用MEGA 4.0构建的邻接法(NJ)系统发育树表明:佛瑞尔刺蚁(Polyrhachis foreli)和甲胄刺蚁(Polyrhachis andromache)聚为一枝,双钩刺蚁(Polyrhachis bihamata)和叉形刺蚁(Polyrhachis ypsilon)聚为一枝,麦凯刺蚁(Polyrhachis mackayi)、澳洲刺蚁(Polyrhachis australis)和软毛刺蚁(Polyrhachis pilosa)三个种聚为一枝,这些种间亲缘关系较近;基于COXⅡ蛋白序列的系统发育关系分析与基于细胞色素b蛋白的系统发育关系既存在一致性,也存在一定的差异。多刺蚁属中序列变异度最大的4个种的COXⅡ对应的3D结构在螺旋和折叠排列方式上完全相同,表明多刺蚁属内COXⅡ序列变异并不影响其结构的形成。     

不同产地玛咖中酰胺含量分析

建立玛咖酰胺测定方法,测定不同产地玛咖切片中玛咖酰胺含量。采用HPLC法,色谱条件为Sepax Sapphire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)流动相:乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B),梯度洗脱:0~15 min,90%~95%A;15~50 min,95%A。检测波长208 nm,体积流量1.0 m L/min,柱温30℃。酰胺1、酰胺2、酰胺3分别在0.88~132μg/m L、0.85~128μg/m L、0.96~144μg/m L线性关系良好。酰胺1、酰胺2平均回收率分别为99.21%(RSD=1.64%)、98.59%(RSD=1.75%)。不同产地玛咖中玛咖酰胺含量差别较大,建立可靠、准确、重复性好的检测方法,有利于评价不同产地玛咖的质量。