藻红蓝蛋白β亚基体内重组及其色谱分析

藻胆蛋白是蓝藻中的捕光蛋白,其生物合成的重要一步是藻胆色素与脱辅基蛋白的连接.大多数藻胆色素的正确连接都需要结合位点专一和对色素的构象有选择性的裂合酶来催化完成,但是这方面的报道不是很多.藻红蓝蛋白由两个亚基组成,β亚基(简称β-PEC)含171个氨基酸残基及两个辅基色素藻蓝胆素(简称PCB),分别在Cys-84和Cys-155位以硫醚键共价相连.通过同源性分析获得的由编号为alr0617基因编码的蛋白为藻红蓝蛋白β亚基(β-PEC)中的Cys-84与PCB的连接的催化酶.为了研究层理鞭枝藻藻红蓝蛋白(PEC)β亚基(β-PEC)中藻蓝胆素(PCB)与脱辅基蛋白的连接机制,通过体内重组方式得到色素蛋白PCB-PecB(C155I),分析表明该色素蛋白与β-PEC的吸收光谱和荧光光谱一致.酸性尿素变性实验证明得到的色素蛋白中的藻蓝胆素PCB没有被破坏.使用胃蛋白酶对天然藻红蓝色素蛋白和重组藻红蓝色素蛋白进行相同条件的水解并得到各自的色素肽,高效液相色谱分析表明这两种色素肽相同,由此证明了编号为alr0617基因编码的蛋白质能催化PCB与PecB(C155I)正确共价偶联.     

别藻蓝蛋白的聚集态研究

为了研究鱼腥藻PCC7120（Anabaena sp．PCC7120）中别藻蓝蛋白（APC）α和β亚基（α-APC和β-APC）中藻蓝胆素（PCB）与脱辅基蛋白的生物合成,并在蓝藻体外对这两种色素蛋白PCB—ApcA和PCB-ApcB合成时聚集过程进行分析,通过多种组合的质粒在大肠杆菌体内共同表达进行重组。色素蛋白的吸收和荧光光谱以及Zn电泳表明,在大肠杆菌体内同时得到色素蛋白PCB—ApcA和PCB—ApcB,并且体内重组色素蛋白的细胞荧光光谱显示,色素蛋白以三聚体的形式存在,而破碎细胞后所得上清液所显示的光谱特征为单聚体的特征。     

藻红蓝蛋白α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素的重组

利用在大肠杆菌中表达的藻红蓝蛋白α－亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素PCB重组,吸收光谱、荧光光谱和高效可逆光化学性质分析表明,藻红蓝蛋白α－亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素直接重组,生成的胆素蛋白中辅基色素仍为藻蓝胆素;而藻红蓝蛋白α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素在藻红蓝蛋白α－亚基重组酶（pecE和pecF基因的表达产物）催化下重组,生成的胆素蛋白中辅基色素转变为藻紫胆素,并具有高效可逆光化学特性。     

层理鞭枝藻藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基Cys-155的藻胆色素共价偶联

层理鞭枝藻(Mastigocladus laminosus PCC7603)藻蓝蛋白β-CPC和藻红蓝蛋白β-PEC中均存在2个藻胆色素结合位点(Cys-84和Cys-155),可与藻蓝胆素(简称PCB)发生共价偶联反应,已有研究证实编码基因为alr0617的裂合酶CpcS1是催化Cys-84与PCB共价偶联的裂合酶。在研究Cys-155与PCB共价偶联的过程中,通过BLAST软件同源性对比分析后,筛选出4个基因:cpcT1、cpcT2、cpcS1、cpcS2,其中基因cpcT1和cpcS2,利用分子克隆的技术,根据实验需要转到载体pCDFDuet上,通过DNA电泳和蛋白质电泳挑选出正确的克隆。此4个基因对应的质粒与在大肠杆菌内生成PCB必需的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA,以及质粒pET-cpcB(C84S)或pET-pecB(C84A),共同转入大肠杆菌BL21(DE3)内,进行体内重组,得到各重组蛋白,经过亲和层析柱提纯并透析,过滤掉金属离子,纯化透析后的蛋白经过活性比较、蛋白质电泳以及锌染色、蛋白质变性等试验以及荧光和紫外吸收光谱等鉴定,通过与相应文献中PCB光谱的比对,确定编码基因为all5339的裂合酶CpcT1能高效地催化Cys-155与PCB共价偶联,而其余3个基因不能起到催化作用。由此,能催化脱辅基蛋白β-CPC和β-PEC的两个位点共价偶联PCB的裂合酶均被发现。实验对于研究藻胆蛋白的生物合成、光合作用捕光机理以及藻胆体的组装等有重要的意义。       

层理鞭枝藻藻红蓝蛋白E基因片段的克隆与表达

藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白,可分为藻红蛋白(简称PE),藻蓝蛋白(简称PC),别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC).藻胆蛋白连有发色团辅基色素-藻胆色素(Phycobilins),藻胆色素分四类:藻蓝胆素(简称PCB),藻红胆素(简称PEB),藻尿胆素(简称PUB)和藻紫胆素(简称PVB)1.       

鱼腥藻PCC7120基因all5292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶(biliprotein lyase)编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻(Anabaena)PCC7120中获取了同源基因all5292和alt0647.同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53.4%和61.4%.随后,对这两个基因进行了初步研究.结果显示:All5292和Air0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白(phycocyanin)或藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)B亚基上的功能.通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索.结果表明:all5292和alt0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达.     

藻红蓝蛋白裂合异构酶对几种脱辅基藻胆蛋白的催化作用

PecE/PecF是层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基(α-PEC)生物合成的裂合异构酶。以4种脱辅基藻胆蛋白为底物,初步研究了PecE/PecF对底物蛋白的催化专一性。结果表明,PecE/PecF可催化藻蓝胆素(PCB)与高度同源的层理鞭枝藻不同亚种的α-PEC脱辅基蛋白的体外重组,也可催化经128位Trp定点突变到Phe而得到的α-PEC脱辅基蛋白的体外重组,但PecE/PecF对PCB与藻蓝蛋白α亚基(α-CPC)脱辅基蛋白的体外重组无催化作用。A-PEC脱辅基蛋白的重组不受表面活性剂Triton X-100的影响,而Triton X-100可改进PCB与α-CPC脱辅基蛋白的重组。     

鱼腥藻PCC7120藻蓝蛋白α亚基体内重组研究

为了研究藻蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pETDuet-cpcA、pCOLADuet-cpcE-cpcF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpcE和cpcF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻蓝蛋白α亚基基因cpcA共同转入大肠杆菌BL21(DE3)。通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的CpcA-PCB。成功实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白α亚基84位半胱氨酸残基与PCB的连接。而在裂合酶基因cpcE和cpcF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.2%的CpcA-PCB产生。以上研究为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础。     

鱼腥藻PCC7120基因all5292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶(biliprotein lyase)编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻(Anabaena)PCC7120中获取了同源基因all5292和alr0647。同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53.4%和61.4%。随后,对这两个基因进行了初步研究。结果显示:All5292和Alr0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白(phycocyanin)或藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)β亚基上的功能。通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索。结果表明:all5292和alr0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达。     

鱼腥藻PCC7120基因a115292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶（biliprotein lyase）编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻（Anabaena）PCC7120中获取了同源基因all5292和alt0647。同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53．4％和61．4％。随后,对这两个基因进行了初步研究。结果显示：All5292和Alr0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白（phycocyanin）或藻红蓝蛋白（phycoerythrocyanin）β亚基上的功能。通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索。结果表明：all5292和alr0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达。     

鱼腥藻PCC7120藻红蓝蛋白α亚基体内重组研究

为了研究藻红蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的4种重组质粒pETDuetp-ecA、pCOLADuet-pecE、pCDFDuetp-ecF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因pecE和pecF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻红蓝蛋白α亚基基因pecA共同转入大肠杆菌BL21(DE3),通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的PecA-PCB。结果表明生成的色素藻胆蛋白具有藻红蓝蛋白α-亚基所特有的光谱性质和可逆光致变色性质。而在裂合酶基因pecE和pecF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.1%的PecA-PCB产生。以上研究对藻胆蛋白生物构建具有重要意义。     

优化培养基增加层理鞭枝藻藻胆蛋白产量

藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻藻胆体的组成部分,是光合作用集光复合体的组成部分,一般由α和β亚基构成,每个亚基含1～4个辅基色素,从而使藻胆蛋白具有特定的光谱吸收性质。根据这些吸收光谱性质,可以将藻胆蛋白分为:别藻蓝蛋白(APC)、藻蓝蛋白(PC)和藻红蛋白(PE)等,在某些缺乏PE而有异形胞的蓝藻中存在充当PE天线捕光功能的藻红蓝蛋白(PEC)〔1〕。藻胆蛋白可用于天然食用色素、化妆品色素和制药行业,还可作为免疫检测、荧光显微技术和流式细胞荧光测定法技术方面的荧光探针。特别是本工作研究的层理鞭枝藻(简称M.laminosu…     

鱼腥藻PCC7120藻蓝蛋白α亚基体内重组研究

为了研究藻蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pETDuet-cpcA、pCOLADuet-cpcE-cpcF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpcE和cpcF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻蓝蛋白α亚基基因cpcA共同转入大肠杆菌BL21(DE3)。通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的CpcA-PCB。成功实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白α亚基84位半胱氨酸残基与PCB的连接。而在裂合酶基因cpcE和cpcF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.2%的CpcA-PCB产生。以上研究为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础。     

钝顶螺旋藻藻胆蛋白的分离,纯化及其理化特性

钝顶螺旋藻(Spirulina Platensis var.nanjingensis)一变异株的水溶性色素精提物,经固体硫酸铵沉淀,羟基磷灰石(HA)和Sephadex G-100柱层析后可分离、纯化出藻蓝蛋白(C-PC)和别藻蛋白(APC)。它们的纯度可分别达到AS 620/A_(277)=4.71;A_(650)/A_(270)=5.62。纯化后的C—PC和APC在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中仅见一条色带,其最大吸收峰分别在620nm和050nm。经12％的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE),以及高效液相色谱(HPLC)分离,C—PC和APC均可分为α和β两个亚单位。两者的亚单位分子量分别为:C—PC—α,15000;C—PC—β,14500;APC—α,15000;APC—β,13500。依此推算,该藻的C—PC和APC的最小分子量应为29.5kD和28.5kD。经等电电泳法测定,其C—PC和APC的等电点分别在4.8和4.9。氨基酸组成和含量分析结果表明,除色氨酸(Try)未测外,c—PC含有14种氨基酸,APC含有15种氨基酸,两者都缺乏组氨酸(His)和脯氨酸(Pro),C—PC还缺少蛋氨酸(Met)。     

藻红蛋白的高效异源生物合成及其生物活性

[目的]实现藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成。[方法]将藻红蛋白生物合成的多个基因构建到单一表达质粒上,质粒转化大肠杆菌后获得表达菌株,优化诱导物、诱导温度和诱导时长等发酵条件,利用亲和层析法分离纯化重组藻红蛋白,分析重组蛋白的光谱学性质与抗氧化活性。[结果]获得了高效生物合成藻红蛋白的大肠杆菌菌株,以乳糖为诱导物时最佳诱导条件为:2.0 g/L的乳糖、25℃下诱导28 h,藻红蛋白表达量达211.6 mg/L;以IPTG为诱导物时最佳诱导条件为:0.4 mmol/L的IPTG,在25℃条件下诱导28 h,藻红蛋白表达量达188.7 mg/L。藻红蛋白色基结合率达92.0%,OD555/OD280为8.0。[结论]成功实现了藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成,重组藻红蛋白具有羟基自由基的清除活性。     

多管藻中R-藻蓝蛋白能量传递途径及动力学

以蛋白亚基复性技术和皮秒级时间分辨荧光光谱,研究海洋红藻多管藻中R－藻蓝蛋白（R－PC）单体和三聚体内能量传递过程。利用亚基复性技术对分离后的β亚基复性,以R－藻蓝蛋白单体和β亚基之间的差谱获得α亚基的吸收光谱。皮秒级时间分辨三维谱图（时间、波长和强度）直观地显示出藻红胆素发色团向藻蓝胆素发色团的能量传递;根据时间分辨测量结果的组份解析,对R藻蓝蛋白单体和三聚体内能量传递途径和相关传递参数进行了指认和讨论;对观察到的单体与三聚体能量传递组份特性的差别提出了解释。与C－藻蓝蛋白光谱对比,R－藻蓝蛋白独特的色团组成使其更有效地捕获与传递光能。     

藻蓝蛋白裂合酶CpeS半胱氨酸的定点突变及功能研究

藻蓝蛋白β亚基(简称β-CPC)中有2个色素结合位点(Cys-84和Cys-155)分别以硫醚键与藻蓝胆素(PCB)连接[1,2].     

发菜藻蓝蛋白基因克隆及原核表达

发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻,具有重要的经济和生态价值。运用双向电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS鉴定和数据库检索,获得藻蓝蛋白部分氨基酸序列并设计简并性引物,克隆藻蓝蛋白基因并研究其表达。结果表明,发菜藻蓝蛋白α和β亚基两个基因的编码序列及两者之间的间隔序列全长为1097bp,编码β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp,β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游,两者之间通过89bp的基因片段连接,GenBank登录号为GU549478,并对推译的α和β亚基三维结构进行了预测。将藻蓝蛋白的α和β亚基基因在大肠杆菌中表达,获得了符合预期的外源重组蛋白。研究结果为进一步研究发菜藻蓝蛋白的分子结构及生物学功能奠定了基础。     

Synechococcus sp. Strain WH8102藻红蛋白裂合酶 CpeY、CpeZ的克隆、表达及功能研究

通过蛋白质序列相似性分析,在Synechococcus sp. strain WH8102里面找到了与Fremyella diplosiphon的藻红蛋白裂合酶编码基因cpeY、cpeZ同源的基因SYNW2013、SYNW2012,分别命名为cpeY-Syn、cpeZ-Syn。通过分子克隆技术,将其构建在不同的表达载体上。通过大肠杆菌体内表达系统,藻红胆素(PEB)在CpeY-Syn和CpeZ-Syn的共同催化下,共价连接到藻红蛋白α亚基脱辅助基蛋白CpeA上,生成色素蛋白PEB-CpeA。实验也表明,在缺少CpeY-Syn的情况下,不能产生色素蛋白,而在缺少CpeZ-Syn的情况下,色素蛋白产率有所降低。与CpcE/F催化藻蓝蛋白α亚基共价连接藻蓝胆素(PCB)一样,CpeY/Z-Syn专一性的催化藻红蛋白α亚基与PEB的连接,它们属于同一类的蛋白家族。