乙肝病毒X 蛋白通过CREB 上调HBx结合蛋白促进肝癌细胞迁移

乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）对肝癌的发生发展具有十分重要的作用. HBx 具有促进肝癌迁移的作用,但其作用的分子机制不清. 本研究对 HBx 促进肝癌细胞迁移的分子机制进行了探讨. 伤口愈合和 Boyden’s chamber结果表明,HBx 可明显促进肝癌 HepG2 细胞迁移. 在稳定转染 HBx 的 HepG2（HepG2-X）细胞中转染 HBx 结合蛋白（hepatitis B X-interacting protein,HBXIP）的 RNA 干扰片段,可明显抑制 HBx 的促迁移作用. 免疫组化和实时定量 PCR 结果表明,HBXIP 在肝癌组织中显著高表达,并且与 HBx 表达成正相关. 荧光素酶报告基因和免疫印迹结果表明,HBx 显著增强 HBXIP 的启动子活性和蛋白质表达水平. 应用 HBx 的 RNA 干扰处理 HepG2-X 细胞,HBXIP 的启动子活性和蛋白质表达水平明显下降.将 HBXIP 启动子区的cAMP效应元件结合因子（CREB）结合位点突变后,HBx 上调 HBXIP 的作用消失. 应用 CREB 的 RNA 干扰处理肝癌细胞,在启动子水平和蛋白质水平上, HBx 对 HBXIP 的上调作用被显著抑制. 染色质免疫共沉淀结果表明,HBx 能够通过 CREB 结合到 HBXIP 的启动子上,进而发挥激活 HBXIP 的功能. 本研究结果表明,HBx 促进肝癌细胞迁移的作用是通过 CREB 上调 HBXIP 实现的. 这一发现对进一步揭示 HBx 促进肝癌细胞迁移的分子机制具有重要意义.     

骨桥蛋白通过NF-κB上调钙蛋白酶小亚基1促进肝癌细胞迁移

骨桥蛋白(osteopontin,OPN)参与调控多种信号途径激活转移相关基因,进而促进细胞迁移.钙蛋白酶小亚基1(calpain small subunit1,Capn4)与肿瘤转移密切相关,在许多肿瘤及其转移组织中高表达.为了探讨OPN促进肝癌细胞迁移的分子机制,应用报告基因检测、RT-PCR、免疫印迹及伤口愈合等方法检测了肝癌细胞中OPN对Capn4的调控作用及其对肝癌细胞迁移的影响.结果显示,在HepG2细胞中过表达OPN后,Capn4的启动子转录活性显著增强,同时mRNA及蛋白质表达水平也明显上调.在HepG2细胞中应用siRNA干扰OPN的表达可导致Capn4启动子转录活性受到明显抑制,同时mRNA及蛋白质表达水平也显著下调.应用核转录因子-κB(NF-κB)的抑制剂PDTC可抑制由过表达OPN导致的HepG2细胞中Capn4的上调.伤口愈合实验显示,OPN可以通过上调Capn4促进肝癌细胞迁移.因此,研究发现,OPN通过NF-κB上调Capn4的表达,进而促进肝癌细胞的迁移,这一发现对进一步阐明肝癌细胞迁移的分子机制具有重要意义.     

乙肝病毒X蛋白通过骨桥蛋白OPN促进肝癌细胞迁移

乙型肝炎病毒(HBV)感染与肝细胞癌(HCC)的发生具有十分密切的关系,乙肝病毒X蛋白(HBx)对HCC的发生和转移具有重要的作用.研究发现,骨桥蛋白(OPN)在许多肿瘤及其转移组织中高表达,与肿瘤转移密切相关.为了进一步阐明HBx在肝癌细胞迁移中的作用及其分子机制,以稳定表达HBx的肝癌细胞H7402-X为模型探讨了HBx与OPN的关系.结果发现,HBx可激活OPN启动子转录活性和上调OPN的mRNA表达."体外划痕"实验结果显示,HBx与肝癌细胞的迁移能力呈正相关.通过RNA干扰下调OPN的表达可抑制H7402-X细胞的迁移能力.本研究发现,HBx通过上调OPN的表达促进肝癌细胞迁移,对揭示肝癌转移的分子机制具有重要意义.     

乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)增强肝癌细胞NF-κB转录活性的实验研究

前期研究结果表明,乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白(hepatitis B virus X-interacting protein,HBXIP)具有促进细胞增殖的作用.为了进一步阐明其分子机制,观察了HBXIP对核因子κB(NF-κB)转录活性的影响.实验中通过基因共转染将NF-κB报告基因质粒pNF-κB-Luc和HBXIP真核表达载体pcDNA3-hbxip导入人肝癌H7402细胞系中,进行荧光素酶活性分析.结果显示:H7402细胞过表达HBXIP后NF-κB的转录活性明显增强;此外,基因转染后经免疫印迹检测显示,与NF-κB二聚体结合的抑制亚基IκBα的磷酸化水平明显增加;同时,提取H7402细胞的核蛋白,然后应用免疫印迹检测细胞核中p65/NF-κB的水平.结果显示,H7402细胞中HBXIP过表达后细胞核中p65/NF-κB的水平明显增加.当应用RNA干扰技术抑制了细胞内源性的HBXIP基因表达后,则出现与上述结果相反的效果.上述结果提示,HBXIP可增加核内p65/NF-κB蛋白水平,进而发挥NF-κB促转录调控的作用.因此,HBXIP可通过调控NF-κB信号途径而促进细胞增殖.     

COX-2在乙肝病毒X蛋白（HBx）促进肝癌细胞和肝细胞增殖中的作用

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）X蛋白（HBx）对肝癌的发生发展具有十分重要的作用．大量研究结果表明,与花生四烯酸代谢相关的磷脂酶COX-2与肿瘤细胞的增殖密切相关．为了阐明COX-2在HBx促进肝细胞增殖中的作用,在前期应用基因芯片方法检测发现稳定转染HBx 基因的肝癌细胞H7402-X中COX-2基因表达明显上调的基础上,本研究应用免疫印迹技术在蛋白表达水平上获得了相同的结果．进而,应用COX-2的特异性抑制剂Indo分别作用H7402-X细胞和L-O2-X细胞（稳定转染HBx 基因的人永生化L-O2肝细胞）,观察HBx蛋白是否通过COX-2促进肝癌细胞或肝细胞增殖．BrdU掺入实验和流式细胞仪检测结果显示,50 μmol/L的Indo可明显抑制H7402-X细胞和L-O2-X细胞的增殖．本研究结果提示,HBx可通过COX-2所介导的花生四烯酸代谢促进肝癌细胞和肝细胞增殖．     

USP9X低表达通过下调Mcl-1促进肝癌细胞凋亡

研究抑制泛素特异性蛋白酶9X（ubiquitin-specific protease 9X,USP9X）对人肝癌（primary hepatocellular carcinoma,HCC）细胞SMMC7721和HepG2中髓细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1,Mcl-1）蛋白的表达调控及对细胞凋亡和生长活力的影响。实验分为USP9X-siRNA组和阴性对照NC组两组进行分析。通过Western blot技术分别检测USP9X在肝癌细胞SMMC7721、HepG2和正常人肝细胞株L02中的蛋白表达情况;应用化学合成USP9X-siRNA转染肝癌细胞SMMC7721和HepG2,通过Western blot、流式细胞仪和MTT检测转染前后Mcl-1的蛋白表达差异以及细胞凋亡和生长活力变化。结果表明,USP9X在肝癌细胞SMMC7721和HepG2中的蛋白表达水平均高于正常肝细胞L02（t=15.155,P=0.000;t=9.171,P=0.001）;SMMC7721和HepG2细胞中抑制USP9X能明显下调Mcl-1的蛋白表达,并导致细胞凋亡增加和生长活力降低。提示,肝癌细胞SMMC7721和HepG2中USP9X表达上调;USP9X表达降低可能通过下调Mcl-1的蛋白表达进而诱导人肝癌细胞SMMC7721和HepG2的凋亡。     

特异性蛋白1(SP1)上调FOXP4-AS1促进结直肠癌细胞增殖

大量的证据表明,长链非编码RNAs (long non-coding RNAs)在结直肠癌发生发展中发挥重要作用。有迹象表明,lncRNA FOXP4-AS1推动结直肠癌的进程。本文通过数据库信息分析发现,FOXP4-AS1在结直肠癌中高表达且与患者较差的预后正相关。实时荧光定量PCR方法也证实,FOXP4-AS1在结直肠癌细胞和组织中的表达量均高于正常细胞和组织。其中,FOXP4-AS1在结肠癌细胞LOVO中表达量最高,是正常结直肠细胞的13倍。生物信息学预测结合双荧光素酶报告基因实验和染色质沉淀研究结果表明,特异性蛋白1（specificity protein 1,SP1）可直接结合在FOXP4-AS1启动子上,上调其活性。过表达FOXP4-AS1,可下调p16和p18表达,同时上调CDK4、CDK6和细胞周期蛋白 D1表达,最终促进结直肠癌细胞增殖。相反,敲低FOXP4-AS1将上调p16和p18表达,抑制CDK4、CDK6和细胞周期蛋白 D1,获得相反的结果。总之,特异性蛋白1(SP1)上调FOXP4-AS1,促进结直肠癌细胞增殖。     

miR-340-5p及PDCD4在过表达乙肝病毒X蛋白的足细胞中的表达及生物学意义

乙肝病毒X蛋白(HBx)引起足细胞损伤与乙型肝炎相关性肾小球肾炎的发病有关,但具体的机制尚不清楚。miR‐340‐5p是受到HBx调控的miR,能够靶向细胞程序性死亡基因4(PDCD4)基因发挥神经元保护作用。本研究观察了过表达HBx的足细胞中miR‐340‐5p及PDCD4表达的变化及生物学意义。培养小鼠足细胞系MPC5后转染HBx质粒、miR‐340‐5p、si‐PDCD4,MTS法检测细胞增殖活力OD₄₉₀、TUNEL法检测细胞凋亡率、荧光定量PCR检测miR‐340‐5p的表达、Western blot检测PDCD4的表达、双荧光素酶报告基因实验验证miR‐340‐5p靶向PDCD4基因3’UTR。结果显示,与对照组比较,HBx组细胞中miR‐340‐5p的表达、OD₄₉₀水平降低,PDCD4的表达、凋亡率增加;与HBx组比较,HBx+miR‐340‐5p组细胞中miR‐340‐5p的表达、OD₄₉₀水平增加,PDCD4的表达、凋亡率降低,HBx+si‐PDCD4组细胞中OD₄₉₀水平增加,...     

Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5通过抑制ERK1/2磷酸化抑制C3H10T1/2细胞成脂分化

旨在探究Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(type Ⅲ domain-containing protein5,FNDC5)对C3H10T1/2细胞成脂分化的调控作用.利用qRT-PCR和Western印迹检测FNDC5在C3H10T1/2细胞成脂分化过程中的时序性表达规律;构建慢病毒包被的过表达/干扰FNDC5载体,转染C3...     

HBXIP基因对乙肝病毒X蛋白诱导细胞凋亡的影响

探讨乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白(hepatitisBXinteractingprotein ,HBXIP)基因在乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)诱导肝癌细胞凋亡时对细胞周期的影响.构建HBXIP基因真核表达载体pcDNA3 hbxip ,进行瞬时基因转染,将克隆有HBx基因的pCMV X (分别为1μg、2 μg和3μg)和pcDNA3 hbxip质粒分别和共转染至人H74 0 2肝癌细胞中(总体积分别为5 0 μl) .发现瞬时转染3μgpCMV X质粒后,肝癌细胞凋亡发生率为34 4 % ,肝癌细胞的细胞周期相关蛋白p2 7表达水平发生明显上调;与对照组相比,瞬时转染1μg、2 μg和3μg时,细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平均发生明显上调,但随着HBX水平的增加细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平发生明显下降;在稳定转染pCMV X质粒的H74 0 2 X肝癌细胞中无明显的细胞凋亡发生,研究发现p2 7的表达水平发生了明显下调,而细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平发生了明显上调;当pcDNA3 hbxip质粒与pCMV X质粒进行共瞬时转染时,细胞凋亡发生率由pcDNA3质粒与pCMV X质粒共转染时的2 9 2 %下降为13 3% ,p2 7的表达水平发生了下调,但细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平无明显变化.研究结果表明,瞬时转染一定剂量的x基因可导致肝癌细胞发生凋亡,细胞周期相关蛋白p2 7、细胞周期蛋白D和     

乙型肝炎病毒X基因及HBx蛋白的研究进展

我国是乙型肝炎高发区,乙型肝炎病毒(HBV)X基因及其编码的多功能蛋白HBx是乙型肝炎病毒基因转录所必需的作用因子,在乙肝的致病过程中起到重要作用。HBx可直接或间接改变肝脏结构细胞的结构和功能,引发肝脏细胞的凋亡;具有广泛的非特异性反式激活作用,反式激活细胞内的某些癌基因或病毒基因,与乙型肝炎和肝细胞癌的发生关系十分密切。本文从多方面综述了X基因及HBx蛋白目前的研究进展,展现了X基因功能的多样性。     

Hepatitis B virus X protein upregulates alpha-fetoprotein to promote hepatocellular carcinoma by targeting miR-1236 and miR-329

Hepatitis B virus (HBV) infection is the most common cause of hepatocellular carcinoma (HCC) worldwide, wherein the expression of alpha-fetoprotein (AFP) is reactivated to promote tumorgenesis. Hepatitis B virus X protein (HBx) protein encoded by the HBV virus X gene has been considered to be oncogenic and implicated in hepatocarcinogenesis. However, the relationship between HBx and abnormal AFP expression in HCC is yet to be fully understood. To explore the potential regulation of HBx on AFP re-expression in HCC, 97 HCC samples of different etiologies were analyzed, and extremely higher serum AFP levels were found in patients with HBsAg⁺. Analyses of HBV-related HCC specimens showed that the expression of AFP was negatively correlated with the levels of miR-1236 and miR-329. Further analyses indicated that HBx promotes the expression of AFP by orchestrating the levels of miR-1236 and miR-329 both in vitro and in vivo. Specifically, miR-1236 and miR-329 bind to the potential target sequences in AFP mRNA 3′-untranslated region to suppress its expression. HBx transfection resulted in the significant decrement of these microRNAs and increment of AFP expression. Moreover, AFP promotes the proliferation of hepatoma cells and attenuates the proapoptotic effect of chemotherapy agents. These findings revealed a novel regulatory mechanism of HBx on the abnormal AFP expression in HCC, which may provide a therapeutic approach for combating HBV-related HCC by targeting the regulation of AFP expression.     

体外针对X基因的小干扰RNA的抗乙型肝炎病毒效应研究

目的：探讨体外针对乙型肝炎病毒（HBV）X基因的小干扰RNA（siRNA）对HBV复制和抗原表达的抵制作用。方法：利用siRNA表达框架法设计针对HBVX基因的siRNA,转染HepG2．2．15细胞,RT-PCR半定量检测转染前后X基因的表达;ELISA法测定各组24、48、72hHBsAg和HBeAg的含量;荧光定量PCR检测48h时HBVDNA的变化。结果：制备了HBVX基因的siRNA,转染后24、48和72h,HBVX基因mRNA的量分别减少了57％、78％和40％;siRNA能抑制HBsAg和HbeAg的分泌,抑制高峰在48h,抑制率分别为42％和43％;荧光定量PCR证实HBVDNA的复制亦受到抑制。结论：针对HBVX基因的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。     

丙型肝炎病毒E2蛋白对HepG2细胞MAPK／ERK的激活

人CD81是丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）的细胞表面特异性受体,HCV包膜蛋白－2（E2）可与其结合。细胞个信号调节激酶（extracellular signal-regulated protein kinase,MAPK/ERK1,2）信号途径主要介导细胞增殖及分化。为探讨HCV E2蛋白与人CD81结合对MAPK／ERK活性变化的影响,以HCV E2蛋白刺激HepG2细胞,采用免疫印迹、免疫组化及免疫荧光等方法动态观察细胞内MAPK／ERK的激活情况,并以流式细胞术检测细胞表面CD81的表达。结果表明：HepG2细胞高表达人CD81;HCV E2蛋白可激活细胞内MAPK／ERK;MAPK／ERK的磷酸化反应与HCV E2蛋白浓度、作用时间呈依赖关系;HCV E2－CD81相互作用引发的细胞异常信号转导可能与HCV致病性相关。     

乙肝病毒X蛋白诱导肝癌细胞凋亡的信号转导途径

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)X蛋白(HBX)与肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的发生具有密切的关系.HBX不但具有拮抗细胞凋亡的作用,还具有促进细胞凋亡的作用.为了进一步探讨HBX促细胞凋亡作用的分子机制,通过脂质体转染的方法将携带X基因的真核表达载体pCMVX导入H7402肝癌细胞,使乙肝病毒x基因(HBx)瞬时过量表达.流式细胞仪检测结果显示,在瞬时转染3μgpCMVX质粒后,肝癌细胞发生凋亡.为阐明HBX诱导细胞凋亡的信号转导途径,对HBX与线粒体释放细胞色素c的关系做了初步探讨.通过罗丹明123染色,经流式细胞仪分析,显示在转染HBx基因后细胞线粒体膜电位明显下降,表明HBX可促进细胞色素c从线粒体释放增加.Western印迹检测结果显示,肝癌细胞在导入HBx基因后,细胞凋亡线粒体转导途径中细胞色素c、Apaf1、procaspase3和procaspase9等的表达水平均上调.研究结果说明,HBX可通过影响线粒体凋亡途径促进肝癌细胞凋亡.