逆转录的发现及启示

逆转录是在研究病毒致癌过程中提出的一种假说——前病毒假说,而1970年逆转录酶的发现标志着逆转录现象的证实？逆转录的发现过程是一种教科书式的程序,从科学难题到提出假说到最终证实假说,是一个基本的科学探索过程,通过对逆转录过程的回顾能够从中得到许多科学研究方法的启示。     

双重实时逆转录PCR检测G2、G3型轮状病毒方法的建立

目的建立一种双重实时逆转录PCR,用于G2、G3型轮状病毒的快速检测和定量分析。方法采用G2、G3型轮状病毒VP7基因特异性引物/探针和体外转录RNAs,建立双重实时逆转录PCR,在同一反应管中同时检测G2、G3型轮状病毒VP7基因;并对该方法的灵敏度、重复性、有效性进行验证。结果双重实时逆转录PCR标准曲线R~2>0.99,扩增效率在90%～110%之间。灵敏度可达10~1拷贝,不同浓度体外转录RNAs重复性检测CV均≤4.18%。单重和双重实时逆转录PCR均可以对G2、G3型单价样本和混合样本进行有效检测,试验内CV均≤2.08%,试验间CV均≤2.52%。单重和双重实时逆转录PCR检测同一样本时具有良好的一致性,检测结果之间差异无统计学意义(P>0.05),两种方法相关性较好(R~2>0.95)。结论本方法特异、快速、灵敏且重复性好,可以在同一反应管中同时检测两种目的基因,缩短了检测周期,降低了检测成本和污染风险,为轮状病毒的分型和定量提供了更为快速、有效的检测方法。     

生物制品中逆转录酶活性检测

在以往报道的逆转录酶（RT）检测方法的基础上,以噬菌体MS2RNA为模板,在有外源RT作用下,缩短逆转录的时间,产生特异性cDNA,经过PCR扩增,增加了试验的灵敏度。在PCR过程中,加入了RnaseA酶消化步骤,降低了逆转录反应的pH值到5．3,并用高浓度的琼脂糖凝胶观察扩增产物,减低了由于细胞内DNA聚合酶造成的假阳性结果的产生,而且使方法得到简化。     

水稻逆转录转座子RIRE10拷贝数与LTR区转录活性的鉴定

在水稻第四号染色体的长臂上鉴定了一个结构完整的Ty3型逆转录转座子RIRE10。RIRE10两LTR间的中间区域在gag pol的上游还包含另一个开放阅读框。通过RT PCR与Northern印迹杂交检测到来自LTR区的转录产物 ;根据点杂交结果 ,鉴定出包含中间区域的RIRE10成员的个数以及LTR区的拷贝数。除了 6 5个完整的逆转录转座子所具备的两个LTR外 ,水稻基因组还含有近 90 0个RIRE10的solo LTR。LTR区的转录以及导致solo LTR产生的同源重组可能影响了RIRE10成员在水稻基因组中的转座活性     

减毒活疫苗中逆转录酶活性检测

逆转录酶 (RT)是目前发现的所有逆转录病毒的一个重要标志 ,凡是逆转录病毒均携带逆转录酶 ,逆转录酶活性的测定可以反映出制品中是否有逆转录病毒的污染 ,不受病毒基因序列的影响。采用PCR法进行逆转录酶活性检测方法 ,以整个生活周期中无DNA过程的MS2RNA为模板 ,设计一对引物 ,在逆转录系统中加入待检样品 ,经过RT PCR扩增后 ,放大检测对象物进行观察 ,从而了解制品中是否存在逆转录酶的污染 ,继而间接推测其是否污染逆转录病毒。对不同生物制品厂家生产的减毒活疫苗的逆转录酶活性进行检测 ,发现在一些疫苗里有逆转录酶活性阳性。     

逆转录聚合酶链反应检测Ⅱ型登革病毒基因

本文应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ⅱ型登革病毒基因。所设计引物在E基因区,引物1位于碱基序列的1566—1586,引物2位于1437—1458。引物在黄病毒属中为Ⅱ型登革病毒特有,它是Ⅱ型各株保守区。反应产物为150bp,内含一个HindⅢ酶位点,酶切后有111bP和39bp两个片段。使用本法对一系列稀释的培养液进行检测,可检出少至5TCID_(50)的病毒RNA。此外还检测了10份经病毒分离与免疫萤光分型证实为Ⅱ型登革热病人的血清和14份疑似Ⅱ型登革热病人但病毒分离阴性的急性期血清。证明本法敏感性明显高于病毒分离。     

定量PCR和逆转录PCR在病毒学的应用

<正>在过去几年内,分子杂交法由于其技术多样性和高度特异性已被广泛用于基础和应用病毒学中。采用这些技术,可以在分子水平上直接进行临床样品的DNA和RNA病毒的检测、病毒基因体外-体内特异性转录活性的分析、以及病毒-宿主相互关系的研究。然而,尽管这些方法对多种检测是很有效的,但只有PCR扩增技术的发展和最佳化才明显提     

肝素对逆转录抑制作用的研究

目的:研究肝素在逆转录过程中的作用.方法:提取人肺胚胎二倍体细胞和肝素抗凝血中总RNA,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量好后,逆转录合成相应的cDNA,分别进行看家基因β-actin的聚合酶链反应(PCR),其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测;用基因芯片技术检测cDNA.将肝素抗凝血中提取的总RNA分为等量的两部分,分别用肝素酶或氯化锂处理RNA进行逆转录为cDNA和RNA合成cDNA后再用肝素酶或氯化锂处理,分别进行看家基因β-actin的聚合酶链反应(PCR),其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测;并用基因芯片技术检测氯化锂处理RNA后cDNA.结果:二倍体细胞来源的RNA为模板,能扩增出β-actin产物,并且在基因芯片上有杂交点.肝素抗凝血来源的RNA,在肝素酶或氯化锂作用后行逆转录者,能扩增到β-actin的目的片段,且基因芯片上有杂交点;而在未处理者不能扩增到目的片段,且基因芯片上无杂交点.结论:肝素是一种逆转录的抑制剂.对RNA逆转录cDNA过程有较强的抑制作用.     

逆转录——聚合酶链反应技术诊断丙型肝炎病毒感染

本文采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术对２１２例住院及门诊病人其中肝病患者９８例（慢性肝炎４３例、肝炎后肝硬化４７例、原发性肝细胞癌８例）进行ＨＣＶ－ＲＮＡ检测。结果９８例慢性肝病患者血清中ＨＣＶ－ＲＮＡ－ＰＣＲ阳性２７例（２７．６％）,１１４例非肝病患者血清中ＨＣＶ－ＲＮＡ－ＰＣＲ阳性９例（７．９％）,两组间差异非常显著（Ｐ〈０．０１）,各种肝病患者的ＨＣＶ－ＲＮＡ－ＰＣＲ阳性率均高于     

应用循环逆转录PCR技术检测丙型肝炎病毒RNA

循环逆转录（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ,ＣＲＴ）是线性增长逆转录ｃＤＮＡ产量的一种新技术。为了将该技术用于检测ＨＣＶ ＲＮＡ,通过改变ＣＲＴ的循环次数,结合竞争ＰＣＲ,作出标准曲线。采用１６次ＣＲＴ加３４次循环ＰＣＲ检测了１３６例ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ阳性、５４例ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ阴性和１０８例临床可疑病人全血标本,并与逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）和巢式ＰＣＲ（     

一批逆转录酶活性检测假阳性的鉴别

目前逆转录病毒的检测方法被普遍应用的是逆转录酶活性检测,自从PCR方法被应用到逆转录酶活性检测中后,使检测的灵敏度及特异性得到极大地提高。同时,假阳性结果也带给各实验室很大困扰,包括试验过程中的实验用试剂及检测样品本身带来的假阳性。实验中观察了一批逆转录酶活性检测阳性样品和两个依赖DNA的DNA聚合酶的假阳性,通过对检测的严密监控以及改变反应体系pH值,抑制了由于细胞死亡后所释放的细胞内DNA聚合酶以及实验用DNA聚合酶的类逆转录酶样作用,从而达到鉴别结果的真实性的目的。     

结合RT-PCR体外扩增检测HCVssRNA的研究

本研究旨在以HCV为平台,在简化RT-PCR基础上,结合体外转录,建立一种特异、高效、简便的检测血清中HCVRNA的体外转录合成系统。本法扩增终产物为特定极性的ssRNA,其特异性经凝胶电泳和斑点杂交确定;RNA定量分析结果显示本法核酸扩增效率高于巢式PCR近20倍。     

应用逆转录PCR检测海产贝壳类中的甲型肝炎病毒

污染水体中生长的贝壳类是传播甲型肝炎的重要媒介之一,本文介绍了用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测贝壳类中甲型肝炎病毒(HAV)的方法。贝壳类中HAV的浓集回收采用洗脱-沉淀法并加以改进,30g贝肉中的病毒浓集回收在1.5~2.0m l上清液中。RT-PCR检出限为回收样品经二次扩增后10-2稀释度。从7种39份采自大连近海海域的贝壳类样品中,用该法检测出阳性样品4种10份,阳性率为26%。说明各种贝壳类有不同程度的污染。     

逆转录套式PCR检测粪便样本中的SARS冠状病毒

为了观察SARS冠状病毒在SARS患者粪便中的存在规律,建立了检测SARS冠状病毒RNA的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并应用该方法检测了241份SARS患者粪便样本。部分PCR产物应用测序技术进行验证。RT-PCR的灵敏度为10^-10稀释度的病毒原液(原液为10^8TCID50／ml)。241份粪便样本的总体检出率为24．1％(58／241),其中发病后的前10d和20d的检出率均为50．0％。随着发病时间的延长,阳性检出率呈下降趋势。应用RT-PCR从粪便中检测SARS冠状病毒是可行的,在发病50d以后仍有17．0％左右的阳性检出率,提示SARS恢复期患者具有排毒的可能性,给后续的卫生防疫措施提供了一定的参考数据。     

HBV逆转录复制分子机制的研究进展

HBV感染是世界范围的公共卫生事件,我国尤为严重。理解和阐明HBV逆转录复制分子机制是优化治疗和处理耐药的基础。目前,通过生物化学及遗传学手段揭示了参与HBV逆转录过程的主要结构基础及顺式作用元件。在HBV逆转录复制过程中,主要经历了由P-ε结构介导的第一次模板转换、5E/3E及M介导的第二次模板转换和5′r/3′r介导的第三次模板转换,从而完成逆转录复制整个过程。本文对这一过程中所涉及的重要结构和顺式作用元件详细阐述,同时对相关研究进展加以概括说明,以期能够给出HBV逆转录过程的全貌。     

真核生物转录的发现

转录过程是遗传信息传递过程中一个非常重要的阶段,是生命研究中一个重要方面.该文阐述真核转录的研究进程,重点介绍卢德(Roeder RG)在此过程中发挥的重要作用,以熟悉这位科学家的贡献和真核转录发现的历史过程.