芽孢杆菌原生质体的形成和质粒转化的研究

测定了芽孢杆菌属中21个种、68个菌株的原生质体形成率。在高渗缓冲液(SMMP 或SMN)中,原生质体形成率在90％以上的有37株。降低高渗缓冲液中钠离子浓度,有利于原生质体的形成。用质粒(pUB 110或pC194) DNA对16株芽孢杆菌的原生质体进行了转化试验。转化成功的共8株：纳豆芽孢杆菌AS 1.107、AS 1.921、幼虫芽孢杆菌AS 1．430、球芽孢杆菌AS 1.1362、迟缓芽孢杆菌#50、苏云金芽孢杆菌松蠋亚种AS 1．294、地衣芽孢杆菌# 18和坚强芽孢杆菌#28。原生质体在DM3再生培养基上的再生率分别为0．1％一19．2％,转化效率分别为1．4×102一1．0×105转化子／μgDNA。转化效率低或未转化成功的菌株,其原生质体的再生率一般都很低或不能再生,有的菌株在形成原生质体后发生自溶。     

多粘芽孢杆菌质粒的研究 Ⅰ.多粘芽孢杆菌质粒的分离和鉴定

从多粘菌素E产生菌多粘芽孢杆菌中分离到两株药物抗性菌株,其中P19-4为双重抗生素抗性菌株(Ap~R、Sm~R),P250-2为多重抗生紊抗性菌株(Pen~R、Ap~R、Sm~R、Em~R、Tc~R、Nm~R、Cm~R、Km~R)。用吖啶橙消除质粒试验及亚硝基胍回复突变试验,初步证明抗生素抗性基因在质粒上,而决定多粘菌素E生物合成的基因可能在染色体上。用琼脂糖-溴化乙锭凝胶电泳分析在两株菌的DNA中鉴别出明显的质粒带,用电镜方法在两株菌的DN^制剂中均观察到共价闭合超螺旋和开放型环状两种构型的DNA分子。     

地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究

目的：提高地衣芽孢杆菌原生质体的产量和形成率,为进一步提高原生质体转化率打下基础。方法：通过酶解法对地衣芽孢杆菌工业生产菌株Bacillus licheniformis303原生质体的制备及再生条件进行了研究。考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间、渗透压稳定剂和再生培养基等因素对地衣芽孢杆菌原生质体的制备及再生的影响。结果：对数生长后期的菌体,以SMMP作渗透压稳定剂,溶菌酶浓度为100mg/mL,37℃下酶解30min,原生质体生成量可达8×109个/mL;再生培养基选用含1mol/L琥珀酸钠的DM3时,再生率最高可达17%。在此条件下,采用PEG法将游离型质粒pHY-P43-secQ转化宿主菌B.lichenifor-mis303,转化率可达10~15 CFU/μg DNA。     

芽孢杆菌原生质体作为质粒DNA转化的受体

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B3F 7658,短小芽孢杆菌(B. pumilus) AS 1.940,巨大芽孢杆菌(B．Megaterium) AS 1.941,和多粘芽孢杆菌(B. polymyxa) AS 1.878等菌株,既不能作为染色体DNA的转化受体,也不能作为质粒DNA的转化受体。用不同量的溶菌酶处理这些菌株形成原生质体,然后加pUB110质粒DNA,经聚乙二醇6000(PEG)诱导,在含新霉素(400μg／ml)的DM-3再生培养基上恢复细胞壁,培养48小时后,转化子数为1.0 x 103一4.6×105／μg DNA。若同时用PEG和Ca2+ 离子诱导,转化子数可提高2—3倍。质粒pUBll0用EcoRI酶切后,转化子数大大下降(2.0×102转化子／μg DNA)。Eco RI酶切后,用T4连接酶连成环状,转化子数有所增加(1．7×103转化子／μg DNA)。     

球形芽孢杆菌Ts-1原生质体电诱导质粒转化研究

本文探讨了球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus Ts-1原生质体电诱导质粒pHV 33转化的最佳条件：3个连续的间隔为1秒,时程为10μs,强度为21Kv／cm的脉冲,使其转化频率为2．44×102转化子／μgDNA,转化效率为3．16×10-6,质粒转化吸附的饱和浓度为5μg／l03CFU。利用此条件,将重组杀蚊毒蛋白克隆pJB41 7转入Bacillus subtillis 168M和Bacillumphaericus Ts-1中,使得B．Sublilis有了杀蚊活性,但未能提高Ts-1的毒性。     

芽孢杆菌原生质体的形成、再生及种间融合的研究

原生质体融合技术不仅能使遗传基因高频率重组,而且可以集双亲优良遗传性状为一体.自Schaeffer等人成功地进行了微生物原生质体融合以来,这项技术便广为人们所接受.枯草芽孢杆菌分泌的抗菌蛋白能抑制多种植物病原菌的生长,苏云金芽孢杆菌生成的伴孢晶体蛋白可毒杀植物害虫.利用原生质体融合技术将这两种芽孢杆菌抑菌杀虫的遗传特性融为一体,选育出防治植物病虫害的新一代生防菌株成为可能,有关这方面的研究国内外尚未见报道.本文报道了抗菌蛋白产生菌TG26-10和晶体蛋白产生菌AS1.904-17原生质体的形成,再生及种间融合的影响因素,为进一步筛选目的融合子提供基础.     

球形芽孢杆菌TS—1原生质体电诱导质粒转化研究

This report gave the best conditions of Bacillus sphaericus Ts-1 protoplast-plasmid pHV33 electroporation. The highest transformation frequency and transformation efficiency induced by three pulse of 21 KV/cm and 10 microseconds duration applied at an interval of one sec., was 2.44 x 10(2) transformants/micrograms DNA and 3.16 x 10(-6) respectively. The saturated concentration of DNA absorbed by the protoplast was 5 micrograms DNA/10(9) cells/ml. By means of this method, pJB417, a recombinant mosquito larvicide clone, was introduced into B. subtilis 168M and B. sphaericus Ts-1. The transformants of B. subtilis 168M with biocide activity were obtained, but the toxicity of B. sphaericus Ts-1 was not increased.     

地衣芽孢杆菌原生质体最佳形成和再生条件的研究

近年来,微生物原生质体融合及诱变受到广泛重视,实验方法日趋完善,实践证明它是一种有效的育种方法。在微生物原生质体制备和再生过程中,各种微生物所需的最佳条件差别很大。我们研究厂地衣芽孢杆菌53-A,菌株原生质体形成和再生的各种因素及最佳条件,并用光学显微镜和电镜观察了原生质体形成、再生和原生质体的聚集现象,现将结果报道如下。     

蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)原生质体形成与再生条件研究

研究了溶菌酶浓度、酶解温度及时间、制备液的pH值、渗透压稳定剂对蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）TO-8-24-2原生质体的形成与再生的影响.TO-8-24-2菌株原生质体形成和再生的最佳条件是以SMM pH7.5作酶解缓冲液,溶菌酶浓度为O.15mg/mL,在37℃下,酶解45分钟.原生质体形成率为91.7%,再生率为13.6%.     

芽孢杆菌原生质体的形成,再生及种间融合的研究

原生质体融合技术不仅能使遗传基因高频率重组,而且可以集双亲优良遗传性状为一体.自Schaeffer等人成功地进行了微生物原生质体融合以来,这项技术便广为人们所接受.枯草芽孢杆菌分泌的抗菌蛋白能抑制多种植物病原菌的生长,苏云金芽孢杆菌生成的伴孢晶体蛋白可毒杀植物害虫.利用原生质体融合技术将这两种芽孢杆菌抑菌杀虫的遗传特性融为一体,选育出防治植物病虫害的新一代生防菌株成为可能,有关这方面的研究国内外尚未见报道.本文报道了抗菌蛋白产生菌TG26-10和晶体蛋白产生菌AS1.904-17原生质体的形成,再生及种间融合的影响因素,为进一步筛选目的融合子提供基础.     

质粒pXZ101 45DNA转化棒杆菌原生质体的研究

用SDS处理谷氨酸棒杆菌1014(Corynebacterium glutamicum 1014),获得消除质粒的衍生株1014—6。通过质粒pXZl0145(Cmr)转化1014—6菌株的原生质体,研究了转化最适条件。0．6u／ml青霉素处理对数期菌体可明显提高转化效率。转化促进剂PEG以分子量6000,浓度30％为最佳。转化在37℃水浴进行3min效果最好。转化效率最高可达2×104转化子/μg DNA。质粒pXZ10145电已成功地转入钝齿棒杆菌B9(C．Crenatu B9)。并在新 宿主中基本保持稳定。     

芽孢杆菌质粒的研究II．几种芽孢杆菌质粒的分离与鉴定

侧孢芽孢杆菌AS 1.864,多粘芽孢杆菌AS 1.794,球形芽孢杆菌AS 1.560是带有质粒的菌株,通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析,回收质粒DNA,并经电镜观察证明质粒DNA分子的存在。首次发现AS 1．864菌株的培养液及其无菌过滤液对蚊幼虫有显著的致死作用。     

嗜热脂肪芽孢杆菌抗药性质粒的转化

从堆肥和污泥中分得8株抗药性高温细菌,经电泳检查有质粒存在,对其中1株具有卡那霉素和链霉素抗性的嗜热脂肪芽孢杆菌T617-8的质粒DNA,用电镜测得分子量为26.6×10~6道尔顿。T617-8(Km~rSm~r)菌株经溴化乙锭处理后,对卡那霉素敏感,同时质粒消失。为此确证,卡那霉素抗性是由质粒所控制。以T617-8的质粒(Km~r)DNA,对消除质粒后的菌株(Sm~r)的原生质体进行转化,获得了抗卡那霉素和链霉素的转化子。     

棒状杆菌原生质体的形成、再生以及融合的初步探讨

Corynebacterium 属中的一些种是生产氨基酸的重要菌株。它们对蛋清I容菌酶和其他几种酶均不敏感。作者用0.4—0.8u／ml青霉素G处理对数期菌令菌体,可明显增加对蛋清溶菌酶的敏感性。继而用0.5—1.0mg／ml的蛋清溶菌酶,于37℃,12—15小时保温,渗透压敏感细胞可达99％以上。在丁二酸钠高渗完全培养平皿上,原生质体再生率可达20％。C. pekinenseAS 1.563与C. crenutum 82原生质体融合率为3×10-4 每对原生质体。融合菌株不稳定呈现出不同程度的分离现象。对融合菌株发酵产物——氨基酸进行了纸层析,70％的融合株同时产生两亲株所产的氨基酸,10％菌株不产生两亲株所产的氨基酸。通过光学显微镜和电镜技术,观察了原生质体的形成、再生和原生质体聚集现象。     

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究

为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进.用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DBl342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响.结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DBl342的转化率为750 CFU/μg/DNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/xg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg/DNA.根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内.     

嗜热脂肪芽孢杆菌质粒DNA的高压电穿孔转化研究

采用高压电穿孔法将穿梭质粒导入了嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)K1041和T521菌株.以对数生长后期的菌体制备K1041转化细胞,以LB平板上于50℃培养的过夜菌制备T521转化细胞,细胞密度为5～7×109细胞/mL.电击条件如下电容25μF,电场强度10.0KV/cm,脉冲控制器设定200Ω.K1041和T521最高转化效率分别达2.01×104和1.19×102转化子/μgDNA.此外,研究发现T521和K1041中存在着DNA的限制/修饰系统.     

丝状真菌的质粒、原生质体转化和外源基因表达

以突变和筛选为中心的传统育种方法在工业微生物发展达到现代的规模始终起到重要作用。近年来随着遗传操纵技术扩大到遗传背景清楚的丝状真菌,探讨应用基因工程技术于工业真菌作为育种的基础兴趣日增。