重组人白细胞介素—6与肿瘤坏死因子突变体融合蛋白的构建及表达

针对肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上的白细胞介素－６（ＩＬ－６）受体明显增高的事实,根据ＴＮＦ结构与功能研究的最新信息,利用ＰＣＲ技术,对人ＴＮＦα基因进行了改造,并将共与ＩＬ－６成熟肽编码区ｃＤＮＡ通过人工接头进行融合,融合蛋白在大肠杆菌表达后,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明,分子量约为３７ｋＤ,活性检测结果证实,该融合蛋白兼具有ＴＮＦ抗肿瘤活性和结合ＩＬ     

重组人肿瘤坏死因子α和白细胞介素6融合基因的构建和表达

本文利用ＰＣＲ技术和基因定位突变技术,将编码人肿瘤坏死因子α（ｈＴＮＦα）和白细胞介素６（ｈＩＬ－６）成熟肽的基因通过中间接头连接成编码单一蛋白的基因,构建了融合蛋白表达载体ｐＢＩＴ,并在大肠杆菌中得到了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的电泳胶薄层扫描显示,融合蛋白的表达量是菌体总蛋白量的２０％,其分子量约为３７ｋＤ。活性检测证实,融合蛋白既有ＴＮＦ活性,又有ＩＬ－６活性。     

重组人白细胞介素－6与肿瘤坏死因子突变体融合蛋白的构建及表达

针对肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上白细胞介素－６（ＩＬ－６）受体明显增高的事实,根据ＴＮＦ结构与功能研究的最新信息,利用ＰＣＲ技术,对人ＴＮＦα基因进行了改造,并将其与人ＩＬ－６成熟肽编码区ｃＤＮＡ通过人工接头进行融合。融合蛋白在大肠杆菌中表达后,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明,分子量约为３７ｋＤ;活性检测结果证实,该融合蛋白兼具有ＴＮＦ抗肿瘤活性和结合ＩＬ－６受体的能力,在高表达ＩＬ－６受体的人骨髓瘤细胞上测得的细胞毒活性较同样位点突变的ＴＮＦ高约３倍。     

人肿瘤坏死因子与人γ干扰素重组双功能融合蛋白的研制

肿瘤坏死因子与γ干扰素具有非常相似的生物学活性,并在一些主要的生物活性方面表现有较强的协同作用。本文采用寡核苷酸指导下的定位缺失-插入体外基因突变技术,删除了干扰素与肿瘤坏死因子串联基因之间的非编码区,去徐了γ干扰素的翻译终止信号,插入了一个人工设计的连接肽,使γ干扰素与肿瘤坏死因子基因在不改变读码框架的条件下融合起来,并在大肠杆菌表达系统中表述了兼有γ干扰素和肿瘤坏死因子功能的融合蛋白。     

重组人肿瘤坏死因子α(hTNFα)衍生物发酵条件的研究

本文对一种新型重组人肿瘤坏死因子衍生物（命名为ｈＴＮＦＤ）的发酵条件进行了初步研究。通过实验优化选择了适宜该衍生物表达的培养基、ＩＰＴＧ使用浓度、诱导时期以及诱导时间的长短等,并在５０Ｌ发酵罐进行了中试规模的放大培养,菌体的收获量湿重可达１６４３ｇ／Ｌ,ｈＴＮＦＤ表达量占总蛋白的６０％,纯化的衍生物比活为１０１×１０１０Ｕ／ｍｇ,比原型ｈＴＮＦα提高了４６５倍,具有潜在的临床应用价值。     

人γ干扰素/β肿瘤坏死因子重组杂合蛋白对γ干扰素抗性细胞株的杀伤效应

已有大量研究资料表明,γ干扰素(Interferon γ,IFNγ)、淋巴毒素(Lymphotoxin,LT,又称TNFβ)或肿瘤坏死因子(TNFα),均有杀伤肿瘤细胞的细胞毒效应,并对其作用机理进行了广泛的研究。与此同时还对晚期肿瘤患者进行了临床治疗的探索,也取得了可喜的进展。但有些肿瘤细胞对这两种淋巴因子有天然的或逐渐获得的抗性现象,而且这两者在临床用有效抗癌剂量时,又可出现不同程度的副作用。为此有人用IFN和TNF联合处理肿瘤细胞,发现它们具有协同抗癌效应,这就为低剂量治疗肿瘤以减轻副作用提供了理论依据。据此,Feng等于1988年将人IFNγ和人TNFβ两个cDNA片段连接为融合基     

人α降钙素基因相关肽与肿瘤坏死因子的融合表达

用半酶和半化学合成的方法合成和克隆了人ａ降钙素基因相关肽基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子之后插入表达载体ｐＳＢ－９２中,使融合基因的５＇端直接置于大肠杆菌ＰＬ启动下游,采用３０℃培养,４２℃诱导,使ＴＮＦ与ＣＧＲＰ融合蛋白在大肠杆菌中获得了表达,表达的融合蛋白既有ＣＧＲＰ的结合活性（酶标检测为阳性）又有ＴＮＦ的生理功能（对Ｌ－９２９细胞的细胞毒活性）。表达菌裂解液走ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示     

靶向抗肿瘤蛋白iRGD-CDD的原核表达及生物活性鉴定

目的: 原核表达并纯化具有特异性成纤维细胞激活蛋白(FAPα)酶切位点的靶向抗肿瘤GP-CDD-iRGD融合蛋白,利用FAPα的酶切功能切除融合标签,检测其对FAPα阳性肿瘤细胞株的毒性。方法: 设计并合成GP-CDD-iRGD基因,插入pGEX-4T3 载体,构建重组表达质粒,转化至BL21大肠杆菌感受态细胞中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析重组融合蛋白的表达,Western blot检测融合蛋白的表达,经GST亲和柱纯化融合蛋白后,通过体外细胞毒性试验(MTT法)和细胞凋亡实验评价该融合蛋白的靶向抗肿瘤活性。结果: 成功构建重组原核表达质粒pGEX-GP-CDD-iRGD,可溶性表达相对分子量约为36 kDa的融合蛋白GST-GP-CDD-iRGD,纯化后蛋白纯度约为90%,经MTT实验测定其对FAPα阳性4T1细胞株的ED50约为18.5μmol/L,流式细胞术检测到其对FAPα阳性4T1细胞株具有选择性毒性作用,早期凋亡比例达到约28%。结论: 原核表达的重组融合蛋白GP-CDD-iRGD对FAPα阴性4T1细胞株未显示毒性,而对FAPα阳性4T1细胞株具有显著的促凋亡作用,为进一步研究其在体内的靶向抗肿瘤活性提供了依据。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3融合蛋白的表达研究

利用PCR扩增得到粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆至pGEM-T,构建成GMCSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆至T7RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴定扫描分析,目的基因产物表达量占菌体总蛋白量的30%以上,目的基因表达产物以包涵体的形式表达。Westernblot鉴定表明,该表达产物可以与GM-CSF抗体及IL-3抗体特异性结合。目的基因表达产物经过包涵体变性、透析复性及柱层析纯化,用GM-CSF、IL-3依赖细胞株TF-1检测,具有明显的生物学活性。     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

Targeting of Tumor Necrosis Factor Receptor 1 to Low Density Plasma Membrane Domains in Human Endothelial Cells

TNFR1 (tumor necrosis factor receptor 1) localizes to caveolae of human endothelial-derived EA.hy926 cells. Transduced TNFR1 molecules lacking amino acid residues 229–244 (spanning the transmembrane/intercellular boundary) are expressed on the cell surface equivalently to full-length TNFR1 molecules but incompletely localize to caveolae. A peptide containing this sequence pulls down CAV-1 (caveolin-1) and TNFR1 from cell lysates but fails to do so following disruption of caveolae with methyl-β-cyclodextrin. We previously reported that methyl-β-cyclodextrin eliminates caveolae and blocks tumor necrosis factor (TNF)-induced internalization of TNFR1 but not TNF-induced activation of NF-κB in EA.hy926 cells. Both CAV-1 and FLOT-2 (flotillin-2), organizing proteins of caveolae and lipid rafts, respectively, associate with caveolae in EA.hy926 cells. Small interfering RNA-mediated knockdown of CAV-1 but not FLOT-2 strikingly reduces caveolae number. Both knockdowns reduce total TNFR1 protein expression, but neither prevents TNFR1 localization to low density membrane domains, TNF-induced internalization of TNFR1, or NF-κB activation by TNF. Both CAV-1 and FLOT-2 knockdowns reduce TNF-mediated activation of stress-activated protein kinase (SAPK). However, both knockdowns reduce expression of TRAF2 (TNF receptor-associated factor-2) protein, and small interfering RNA targeting of TRAF2 also selectively inhibits SAPK activation. We conclude that TNFR1 contains a membrane-proximal sequence that targets the receptor to caveolae/lipid rafts. Neither TNFR1 targeting to nor internalization from these low density membrane domains depends upon CAV-1 or FLOT-2. Furthermore, both NF-κB and SAPK activation appear independent of both TNFR1 localization to low density membrane domains and to TNF-induced receptor internalization.     

Generation and Characterization of Small Single Domain Antibodies Inhibiting Human Tumor Necrosis Factor Receptor 1

The cytokine TNF is a well known drug target for several inflammatory diseases such as Crohn disease. Despite the great success of TNF blockers, therapy could be improved because of high costs and side effects. Selective inhibition of TNF receptor (TNFR) 1 signaling holds the potential to greatly reduce the pro-inflammatory activity of TNF, thereby preserving the advantageous immunomodulatory signals mediated by TNFR2. We generated a selective human TNFR1 inhibitor based on Nanobody (Nb) technology. Two anti-human TNFR1 Nbs were linked with an anti-albumin Nb to generate Nb Alb-70-96 named “TNF Receptor-One Silencer” (TROS). TROS selectively binds and inhibits TNF/TNFR1 and lymphotoxin-α/TNFR1 signaling with good affinity and IC₅₀ values, both of which are in the nanomolar range. Surface plasmon resonance analysis reveals that TROS competes with TNF for binding to human TNFR1. In HEK293T cells, TROS strongly reduces TNF-induced gene expression, like IL8 and TNF, in a dose-dependent manner; and in ex vivo cultured colon biopsies of CD patients, TROS inhibits inflammation. Finally, in liver chimeric humanized mice, TROS antagonizes inflammation in a model of acute TNF-induced liver inflammation, reflected in reduced human IL8 expression in liver and reduced IL6 levels in serum. These results demonstrate the considerable potential of TROS and justify the evaluation of TROS in relevant disease animal models of both acute and chronic inflammation and eventually in patients.     

重组人GM－CSF／MCAF融合蛋白抗血清的制备与鉴定

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）融合蛋白经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５和ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ两步柱层析,获得了电泳纯的ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ融合蛋白。为进一步研究其结构与功能,我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。ＤｏｔＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验表明,该抗血清效价高、特异性好,可分别与ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ、ＧＭ－ＣＳＦ和ＭＣＡＦ发生反应。     

人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达

构建人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体,并表达得到该融合蛋白.通过设计强特异性的引物,利用重叠PCR技术,定向定量的拼接得到hPTH(1-34)二联体-HSA融合蛋白的基因;将构建好的融合基因插入表达载体pPIC9K,大量扩增重组质粒,并用Sal I线性化,电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷和G418抗性双重筛选得到阳性转化子;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达.测序结果表明得到的重组质粒pPIC9K-hPTH(1-34)二联体-HSA与目标设计完全一致;基因组PCR鉴定结果证明成功构建了hPTH(1-34)二联体-HSA融合基因的毕赤酵母(GS115)表达系统;SDS-PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达3d后融合蛋白的产量为127 mg/L.     

重组人GM－CSF／MCAF融合蛋白抗血清的制备与鉴定

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）融合蛋白经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５和ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ两步柱层析,获得了电泳纯的ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ融合蛋白。为进一步研究其结构与功能,我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。ＤｏｔＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验表明,该抗血清效价高、特异性好,可分别与ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ、ＧＭ－ＣＳＦ和ＭＣＡＦ发生反应。