细胞能量监测器——AMP激活的蛋白激酶

在真核生物中 ,ＡＭＰ激活的蛋白激酶(ＡＭＰＫ)因其活性受ＡＭＰ/ＡＴＰ比值调控 ,被称作细胞的“代谢传感蛋白”或“能量监测器”[1] 。当ＡＭＰ/ＡＴＰ比值升高时ＡＭＰＫ被激活 ,通过对下游靶蛋白的磷酸化 ,关闭消耗ＡＴＰ的合成代谢途径 ,并开启分解代谢途径 ,如 :脂肪酸的氧化等 ,由此来监控细胞中ＡＭＰ和ＡＴＰ的水平[2 ] 。由于其下游靶蛋白的种类、数量众多 ,不同的研究者通过不同的方法曾多次发现了这一类蛋白激酶的调控作用 ,但直到获得了编码这些蛋白激酶的ＤＮＡ序列后 ,才发现它们均为同一蛋白激酶亚家族的成员。1 .早期发现…     

TNF受体（P55）胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用,在原核表达系统中表达了TNFR（P55）的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR（P55）胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体pET-32a,在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达了TrxA-TNFR融合蛋白。表达产物以包涵体形式存在,经过变性和复性,并经镍金属鳌和柱亲和层析纯化,得到了纯度较高的可溶性受体蛋白的初纯品。免疫学实验及L929细胞体外实验均表明：该蛋白具有TNFR（P55）特异的抗原性、与TNF结合的活性以及良好的抑制TNF的TNF生物学活性。     

人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定

通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒 (命名为pTCKA′) .将其转化BL2 1(DE3)菌 ,IPTG诱导后未见高效特异表达 .然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体 ,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达 .Western印迹结果证明 :该蛋白能与兔抗人CK2α′3 3 3 3 50 肽段抗血清发生特异性免疫反应 .采用GSH Sepharose 4B柱纯化 ,凝血酶酶切 ,最后从 4g细菌获 4 4mg纯化重组蛋白 .通过性质鉴定和酶动力学分析证明 :克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基 .     

α1,2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)基因组DNA中获得α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fuco-syltransferase,α1,2-fuct)基因,得到大小为906 bp的目的基因,将其定向插入到原核表达载体pET-22b(+)中,得到重组表达载体pET-fuct。将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,25℃,0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,可表达出相对分子质量为33 kD的蛋白,与预期分子量一致,说明α1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌BL21中实现表达,应用HPLC法进行酶活检验,酶活达到了13.21 pmol/(mgPr.h)。     

腺苷酸活化蛋白激酶在糖脂代谢调控中的研究进展

AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一种异源三聚体复合物,作为机体能量平衡和糖脂代谢的重要激酶参与多种生理过程的调节。研究表明,炎症、糖尿病和癌症等多种慢性疾病也与AMPK功能和活性调节有密切关系。新近发现,糖尿病一线用药二甲双胍抑制肝糖产生改善病人高血糖的作用与AMPK激活有关,提示靶向AMPK可能是预防和治疗多种慢性疾病的有效策略之一。文中从AMPK的结构与活性、AMPK在糖代谢调控中的作用和AMPK在血脂代谢调控中的作用3个方面综述了AMPK研究的进展,旨在为糖脂代谢调控的基础和临床研究提供依据。     

人胶源神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

胶源神经营养因子（Ｇｌｉａｌｃｅｌｌｉｎｅｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ)是大鼠B49细胞系中分离纯化得到的一种蛋白质^[1],由于其对多巴胺神经元的专一性的神经营养作用而被发现。GDNF成熟蛋白由134个氨基酸组成,具有两个N-糖基化位点。它属于TGF-β基因家族但与该家族其它成员的氨基酸序列同源性仅为20%,可能是一个新的亚家族。最近研究表明,它对发育中的运动神经元也有很强的神经营养作用^[1]。对啮齿类^[3,4],灵长类的弥猴^[5]的活体试验表明,胶源神经营养因子是一种治疗神经退化发夹知病如帕金森氏症、肌萎缩性脊髓索硬化症等的非常有效的潜在药物。由于GDNF在体内含量极低而且公在发育早期表达,因而只有通过基因工程方法才能获得大量的GDNF。本文报道采用PCR方法从中国入基因组DNA 中扩增出编码GDNF的基因,并实现在大肠杆菌中的高效表达。这为进一步研究GDNF的结构和生物学功能打下了坚实的基础。     

来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过ＰＣＲ的方法从Bacillus subtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,ＤＮＡ全序列分析表明其结构基因全长１１５２个核苷酸（编码３８３个氨基酸）,５′端有一编码２６个氨基酸的信号肽序列。去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌ＩＰＴＧ诱导表达载体pTYB40上,在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的４０％以上,表达产物具有生物学活性,证实了克隆到的中性植酸酶的基因有正常的生物学功能。     

人可溶性APRIL(sAPRIL)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从GenBank中查找出人APRIL蛋白 (编号:075888)序列 ,取其部分胞外 (sAPRIL)序列设计引物 ,用RT PCR从扁桃体总RNA中扩增出人sAPRIL基因 ,经克隆测序后进行同源比较 ,证实所克隆的基因即为sAPRIL。克隆载体经酶切后构建了表达载体 ,并在大肠杆菌中表达 ,纯化蛋白后进行细胞学实验表明sAPRIL有明显刺激肿瘤细胞增殖的作用 ,为深入研究sAPRIL的功能奠定了基础     

鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

以鲑鱼基因组ＤＮＡ为模板,采用ＰＣＲ获得ｓＣＴ基因,并为ＤＮＡ序列分析所证实．以ｐＧＥＸ－３Ｘ为表达载体,利用体外定点突变技术成功地构建了融合蛋白ＧＳＴ－ｓＣＴ的重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ－ｓＣＴ,在大肠杆菌中得到高效表达,其表达量约为菌体总蛋白的３０％;利用亲合层析法对融合蛋白ＧＳＴ－ｓＣＴ进行纯化,再经Ｆａｃ－ｔｏｒΧａ酶切后获得了重组ｓＣＴ,并对其进行活性检测．初步实验证明,重组ｓＣＴ具有较强的生物活性     

α-乙酰乳酸脱羧酶在大肠杆菌中的克隆表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）的基因序列,通过PCR获得了枯草芽孢杆菌168的ALDC基因,将该基因克隆到克隆载体pUC18和表达载体pQE60中,构建了pUC18-ALDC和pQE60-ALDC,经DNA测序证明序列正确。重组大肠杆菌DH5a／pQE60-ALDC经IPTG诱导能够高表达ALDC。对该酶进行了活力测定,结果显示工程菌产酶活力为0．11U／mL。     

hFOXP3-△E251的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建和表达带HIV-TAT穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的人FOXP3突变体PTD-hFoxP3-△E251,为研究人FOXP3的功能奠定基础.方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcTiption-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)总RNA中扩增得到人FOXP3(hFOXP3)的cDNA,然后再利用重叠PCR技术扩增获得hFOxP3-△E251基因实变体片段.将该重组突变体插入表达载体pET28a-PTD中,构建表达质粒pET28a-PTD-hFOXP3-△E251,然后转化感受态细菌E.coli Rosetta(DE3),最终采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达.结果:SDS-PAGE电泳分析发现,经0.5mM IPTG诱导8h后,可高效表达重组的融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在.结论:成功制备了带穿膜序列的人FOXP3△E251突变体融合蛋白.为更好地研究人FOXP3的功能与特性奠定了实验基础.     

人神经生长因子基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

神经生长因子(Nerve　Growth Factor,NGF)是最早发现的生长因子之一。它对中枢和周围神经元具有存活分化效应^[1]。NGF有可能治疗Alzheimers老年痴呆病、某些周围神经病变和脊髓损伤^[2]。NGF在人体组织中含量极微,已有报道从胎盘中纯化hNGF,但其组织来源极其有限,成本高,产量低．不能满足对hNGF的需求,所以如果能利用基因工程方法获得大量有生物学活性的hNGF制品,对其基础理论研究和临床应用具有深远的意义。我们根据已知序列设计合成一对引物,以人基因组DNA为模板,用PCR获得hNGF基因,并构建重组表达质粒．使rehNGF在大肠杆菌中获得表达,表达产物具有免疫学和生物学活性。     

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达王峥,周蓓芸,郑幼霞（中国科学院上海植物生理研究所,２０００３）关键词高温放线菌,β—淀粉酶,基因克隆β—淀粉酶是一种外切型淀粉水解酶,它从淀粉的非还原性末端依次水解α－１,４葡萄糖昔键,产生分构型的麦芽糖。内...     

PTHrP受体胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白,Parathyroid hormone related protein)与多种肿瘤的生物学行为有关,尤其对肿瘤的骨转移起重要作用。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常值得研究的课题。从肾癌组织中提取RNA,采用逆转录PCR (RT-PCR)方法获得PTHrP受体N端胞外区543碱基对的带信号肽的cDNA片段。将其核苷酸序列与国外发表的资料相比,基因中第262位核苷酸由T变为C,相应密码子由TAC变为CAC,导致氨基酸变异,即由酪氨酸变为组氨酸。将获得的受体基因克隆到原核表达载体pET-3a,在大肠杆菌得到高效表达,经ELISA证实表达产物可与PTHrP特异性结合。体外生物学活性检测表明表达产物可阻断PTHrP的生物学活性。     

鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

以鲑鱼基因组ＤＮＡ为模板,采用ＰＣＲ获得ｓＣＴ基因,并为ＤＮＡ序列分析所证实。以ｐＧＥＸ－３Ｘ为表达载体,利用体外定点突变技术成功地构建了融合蛋白ＧＳＴ－ｓＣＴ的重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ－ｓＣＴ,在大肠杆菌中得到高效表达,其表达量约为菌体总蛋白的３０％;利用亲合层析法对融合蛋白ＧＳＴ－ｓＣＴ进行纯化,再经Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ酶切后获得了重组ｓＣＴ,并对其进行活性检测。初步实验证明,重组ｓＣＴ具有较     

人β2-微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

β2-微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子的轻链部分,为制备MHCⅠ类分子四聚体的必要成分。根据已报道的序列设计特异引物,利用RT-PCR方法从人白细胞中克隆了β2m基因,并构建了成熟β2m的原核表达载体,在大肠杆菌中得到高效表达。表达的β2m大部分在包涵体中,经洗涤、变性和复性,并以强阴离子交换柱层析纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,Western印迹法分析表明该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。此工作为制备MHCⅠ类分子四聚体奠定基础。     

HER2胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的可溶性表达

采用反转录PCR和PCR方法分别克隆P185^HER2/neu胞外区基因和噬菌体M13K07g3p—N1结构域基因,然后将二偶联入pET-22b( )载体中,在大肠杆菌中进行融合表达。可溶性目的蛋白表达量占细菌可溶性表达产物总量的30％72右．并通过镍亲和层析纯化出目的蛋白。以上结果为从噬菌体抗体库中筛选抗P185^HER2/neu的抗体奠定了基础。     

人epiregulin在大肠杆菌中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法首次从人肺癌细胞Ａ５４９中扩增得到了ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ的ｃＤＮＡ。在３’端添加６个组氨酸密码子后将期 克隆到本实验室构建的大肠杆菌高效碱性磷酸酶分泌表达系统中进行分泌表达。表达产物经Ｎｉ柱一步分离后得到纯化。对其进行氨基酸序列分析,结果与报道的人ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ的序列一致。ＭＴＴ法测定其对Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３细胞有很强的促增殖作用,而对表皮癌细胞Ａ４３１有较强的抑制生长作