葡萄糖苷转移酶生产菌种的筛选

用甲基葡萄糖及麦芽糖为底物,对５０多株黑曲霉α－葡萄糖苷酶活性作了测定,结果表明各菌株对这二类底物之水解能力并不一致,甲基葡萄糖水解活性高的,其麦芽糖水解能力未必也高。通过ＴＬＣ测定这些菌株生成异麦芽低聚糖之能力,结果表明甲基葡萄糖和麦芽糖为底物的水解能力并不能正常反映转苷反应的能力。酶活力高的,生成异麦芽低聚糖的能力未必比活性低的为强,造成上述结果的原因,或许是胞外酶中存在着仅有水解作用的α－葡     

黑曲霉α-葡萄糖苷酶cDNA的克隆及表达

研究黑曲霉(Aspergillus niger)M-1菌株的α-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达。以M-1菌株的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增α-葡萄糖转苷酶的cDNA,重组到Trc启动子控制下的表达载体pSE380中,构建重组质粒pSE-αtg,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。初步研究表明:重组蛋白具有葡萄糖苷酶活性,最适pH为6.0,最适温度为45℃,金属离子Cu2 和Mn2 对酶活力有明显的促进作用。添加1.6mmol/L IPTG对重组菌的诱导作用最大,在培养中添加麦芽糖,对重组菌产酶有显著的促进作用。     

黑曲霉突变株葡萄糖淀粉酶的底物特异性

黑曲霉(Aspergillus niger)突变株T-21葡萄糖淀粉酶(GAI)仅能水解多种淀粉及麦芽低聚糖生成唯一产物β-葡萄糖,其水解麦芽糖及麦芽三糖的速度分别为200和570mg葡萄糖·h~(-1)·mg~(-1).GAI水解α-1,4键的速度比水解α-1.6键快100多倍.除了马铃薯淀粉外,对其它淀粉及麦芽低聚糖几乎都能100%地水解,但不能水解环状糊精,其水解各麦芽低聚糖的最先产物都比原底物少一个葡萄糖单位,说明GAI为一外切型淀粉酶.GAI对麦芽糖、麦芽三糖、可溶性淀粉、糯米淀粉、糊精及糖原的Km值分别1.92mmol/L、0.38mmol/L、0.053%、0.045%、0.059%、及0.076%,V_(max)分别为590、1370、1270、1520、1120和1220mg葡萄糖·h~(-1)·mg~(-1).D-葡萄糖酸-δ-内酯及麦芽糖醇对此酶分别具有反竞争性抑制和混合性抑制.     

海藻糖微生物酶法合成机制的研究

来源于嗜酸热古菌芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12的麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(MTHase)基因在大肠杆菌中获得表达。将获得纯化的两个酶,分别以麦芽寡糖和淀粉为转化底物,在pH5.5,60℃条件下合成海藻糖。从反应产物分析结果可知,两个酶合成海藻糖时能利用的最小底物是麦芽四糖,海藻糖产率与麦芽寡糖链长正相关。同时还发现两个酶都具有轻微的α-1,4-葡萄糖苷酶活性,能在麦芽寡糖还原末端水解α-1,4糖苷键,生成葡萄糖分子,其反应最小底物分别是麦芽三糖和四糖。推测海藻糖合成酶可能有两个不同的催化活性中心。     

家蝇幼虫消化器官中纤维素酶的组成及酶活性分析

采用DNSA法研究家蝇3龄幼虫各消化器官中纤维素酶的组成及特性。结果表明,家蝇各消化器官均含有内切β-1,4-葡聚糖酶（endo-β-1,4 glucanase,EC 3214,EG）、外切β-1,4-葡聚糖酶（exo-β-1,4-glucanase, EC3.2.1.91,CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase, EC 3.2.1.21,BG）。家蝇消化器官中EG、CBH和BG的最适反应时间均为60 min,最适反应温度为50℃,这些酶在体外的热稳定性较好,在50℃以下处理1 h能保持较高的活性。这三种纤维素酶在不同消化器官中的配比关系和活性表现存在一定的差异,其中中肠的酶活性最高,在最适反应条件下,EG、CBH和BG的酶活性分别达到1.02±0.033 IU/mg、1.57±0.070 IU/mg和1.2±0.048 IU/mg。     

差异柠檬酸杆菌GXW-1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及分子改造

【目的】筛选鉴定1株产β-葡萄糖苷酶的菌株,克隆、表达该菌株中的β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行分子改造。【方法】在自然界中采集土样,筛选到1株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株,对野生菌进行16S rDNA鉴定,比对分析Gen Bank数据库中与野生菌同属的β-葡萄糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因保守区;设计引物扩增目的基因,以pQE30为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中进行诱导表达;采用镍亲和层析对重组酶进行纯化,研究其酶学性质;采用易错PCR和定点随机突变相结合的方法对野生型β-葡萄糖苷酶进行分子改造。【结果】一个来自于差异柠檬酸杆菌GXW-1的β-葡萄糖苷酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶CBGL的最适温度为45°C,最适p H为6.0,V_(max)值是(0.1704±0.0073)μmol/(mg·min),K_(cat)值为(0.2380±0.0102)/s。CBGL能水解α-pNPG、甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。对野生酶进行分子改造,获得V_(max)是野生酶2.54倍的突变体W147F。【结论】CBGL不仅具有β-1,4-糖苷键水解能力,还可能具有一定的α-糖苷键水解酶活性。此外,CBGL还能够水解天然底物甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的催化性质

通过测定黑曲霉β-葡萄糖苷酶的底物特异性,表明该酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯-β-D葡萄糖苷,还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖苷和β-D-木糖苷。Ag~+、Cu~(2+)和Hg~(2+)对该酶有较强的抑制作用。该酶水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷、水杨苷和纤维二糖的Km值分别为2.32、19.11和30.18mmol/L,V_(max)则分别为412、237和198μmol·min~(-1)·mg~(-1),Lineweaver-Burk作图法表明,D-葡萄糖和δ-葡萄糖酸内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为5.17和1.31mmol/L。     

赤霉素诱导甘蔗节间伸长的效应与相关酶活性的关系

以甘蔗品种'新台糖22号'为试验材料,在伸长初期以200 mg/L GA3进行叶面喷施处理,对照喷清水,研究GA3处理后甘蔗节间糖苷酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的变化,以揭示赤霉素诱导甘蔗节间伸长与相关酶活性的关系.结果表明:(1)GA3处理的株高在各个时期显著高于对照,而且在处理后7、14和28 d分别比对照提高了17.32%、14.50%和8.35%,GA3处理引起甘蔗植株表现的高度优势一直保持到后期,节间伸长效果主要是在茎的中部(5～10节).(2)GA3处理后α-葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶的活性较对照显著下降;POD和β-半乳糖苷酶的活性也略有下降;α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基已糖苷酶、过氧化氢酶的活性显著提高;β-葡萄糖苷酶的活性也有一定程度提高.由此推测,外源GA3主要通过调节α-葡萄糖苷酶活性、α-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基已糖苷酶活性和过氧化氢酶,其次是POD、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性,最终达到节间伸长效果.     

黑曲霉突变株葡萄糖淀粉酶的底物特异性

黑曲霉(Aspergillus niger)突变株T-21葡萄糖淀粉酶(GAI)仅能水解多种淀粉及麦芽低聚糖生成唯一产物β-葡萄糖,其水解麦芽糖及麦芽三糖的速度分别为200和570mg葡萄糖·h^(-1)·mg^(-1).GAI水解α-1,4键的速度比水解α-1.6键快100多倍.除了马铃薯淀粉外,对其它淀粉及麦芽低聚糖几乎都能100%地水解,但不能水解环状糊精,其水解各麦芽低聚糖的最先产物都比原底物少一个葡萄糖单位,说明GAI为一外切型淀粉酶.GAI对麦芽糖、麦芽三糖、可溶性淀粉、糯米淀粉、糊精及糖原的Km值分别1.92mmol/L、0.38mmol/L、0.053%、0.045%、0.059%、及0.076%,V_(max)分别为590、1370、1270、1520、1120和1220mg葡萄糖·h^(-1)·mg^(-1).D-葡萄糖酸-δ-内酯及麦芽糖醇对此酶分别具有反竞争性抑制和混合性抑制.     

妊娠早期产前诊断的研究——绒毛六种酶的测定

以妊娠6.5—10周经人工流产后完全发育的叶状绒毛为材料,用等电聚焦和淀粉凝胶电泳方法分析了绒毛的磷酸葡萄糖变位酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、腺苷激酶、酸性磷酸酶、酯酶D和腺苷脱氨酶探讨了这些酶活性定量测定的方法,报道了绒毛6种酶活性的正常值,为某些代谢病的孕早期产前诊断奠定了基础。     

纤维素酶滤纸酶活测定方法的改进

微生物的纤维素酶是多组分的酶系。用粘度法测CX酶活(内切β-1,4-葡聚糖酶)和以水杨苷等为底物测定β-葡萄糖苷酶活都能不受其它组分的影响而准确测得～纤酶系中这两个组分的活力。在菌种选育和酶的生产中,主要需了解一纤酶系作用于纤维性材料时产生还原糖的能力,这是C1酶(外切β-1,4-葡聚糖纤维二糖水解酶)与上述     

一种筛选胞外纤维素酶产生菌的快捷、灵敏、有效的方法

【目的】建立一种能快捷、灵敏、有效筛选高β-葡萄糖苷酶活性的胞外纤维素酶产生菌的方法,用于胞外纤维素酶产生菌检测筛选。【方法】将以微晶纤维素(Avicel)或羧甲基纤维素(CMC)为底物的胞外纤维素酶产生菌平板筛选法常用的刚果红或碘液浸泡染色改为碘液熏染,减少碘液的消耗和对环境的污染;建立以对硝基苯酚-β-1,4-葡萄糖苷(pNPG)为底物的β-葡萄糖苷酶发色底物平板筛选法;将两方法串联用于高β-葡萄糖苷酶活性的胞外纤维素酶产生菌的筛选。【结果】建立了分别以CMC和Avicel为底物结合碘液熏染的胞外纤维素酶产生菌平板筛选法和以pNPG为底物的β-葡萄糖苷酶发色底物平板筛选法,从56株真菌中筛选出了8株纤维素酶活性水平为++++的胞外纤维素酶产生菌,从后者筛选出4株高β-葡萄糖苷酶活性的胞外纤维素酶产生菌。【结论】将以CMC和Avicel为底物结合碘液熏染的平板筛选法和以pNPG为底物的发色底物平板筛选法串联,可快捷、灵敏、有效地用于高β-葡萄糖苷酶活性的胞外纤维素酶产生菌的筛选。     

重组根瘤农杆菌葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶性质

目前已发现的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶均来源于真菌, 尚无原核细胞来源的相关报道。从根瘤农杆菌LBA4404中克隆β-葡萄糖苷酶基因bg1, 将其构建在表达载体pET-28b上, 转化Escherichia coli RP (DE3), IPTG诱导表达。重组β-葡萄糖苷酶的比活高达36.7 μmol/(min·mg)。对经过Ni柱纯化的重组酶进行酶学分析发现: 该酶是糖基水解酶家族1的成员, 底物亲和力高, 专一性低, 在温度为40°C和pH在5-8之间时具有较高的酶活, 在低于40°C和pH 5-10之间时可稳定保存。以pNP-β-Glc为底物, 该酶的最适pH为6.4, 最适温度为60°C, 在37°C和pH 6.4的反应体系中, 该酶的Km为0.09 mmol/L, 竞争性抑制剂葡萄糖酸-δ-内酯和葡萄糖的Ki分别为0.03 mmol/L和75 mmol/L, 具有很高的葡萄糖耐受性, 当金属离子Ag+和Zn2+存在时, 酶活被明显抑制。该酶对pNP-β-Gal和pNP-α-Glc的Km分别为3.61 mmol/L和14.31 mmol/L。     

贵州传统发酵豆制品中水解银杏黄酮苷的微生物β-葡萄糖苷酶筛选

[目的]微生物β-葡萄糖苷酶法水解银杏黄酮苷具有重要意义,不过目前这方面的研究极少。因此,本文目的是筛选到水解银杏黄酮苷的酶活高的微生物β-葡萄糖苷酶,并分析其底物选择性机制。[方法]以银杏叶提取物作为唯一碳源富集培养,从贵州传统发酵豆豉中筛选产对银杏黄酮苷水解酶活高的β-葡萄糖苷酶的菌株,并对该菌株进行鉴定。然后比较此β-葡萄糖苷酶对不同底物的选择性,同时测定此酶水解银杏黄酮苷反应的米氏常数Km及最大反应速率Vmax。最后,对不同的底物进行分子对接,分析其底物特异性机制。[结果]结果表明,筛选到的菌株GUXN01所产β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的酶活最高,被鉴定为枯草芽孢杆菌。此β-葡糖糖苷酶对β构型的糖类以及苷类等具有广泛的底物特异性和不同的选择性,尤其对银杏黄酮苷具有很好的亲和性。分子对接研究表明枯草芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶对银杏黄酮苷和其他糖苷类具有不同亲和性和选择性的原因主要是酶结构和底物分子结构的相互作用力的差异导致的。[结论]这些发现为GUXN01所产的β-葡萄糖苷酶应用于水解银杏黄酮苷类生产相应苷元奠定了良好的基础。     

水文管理措施对长白山区恢复泥炭地土壤酶活性的影响

以长白山区天然泥炭地、不同水文管理的恢复泥炭地(高水位、高-低水位循环和低水位)及退化泥炭地(弃耕地)为研究对象,分析水文管理措施对恢复泥炭地表层土壤(0～10 cm)酶活性的影响及其驱动因素。结果表明：泥炭地土壤β-1,4-葡萄糖苷酶和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶活性表现为天然泥炭地>恢复泥炭地>退化泥炭地;退化泥炭地土壤酸性磷酸酶活性显著低于天然泥炭地和恢复泥炭地;多酚氧化酶活性在天然泥炭地最低。在恢复泥炭地,随着恢复区管理水位的下降,土壤β-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶和酸性磷酸酶活性均逐渐降低,土壤多酚氧化酶活性表现为高-低水位循环恢复区最低。相关分析表明,土壤β-1,4-葡萄糖苷酶活性和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶活性均与土壤有机碳、含水量、水位和全氮含量呈显著正相关,与pH和全磷含量呈显著负相关;土壤酸性磷酸酶活性与水位呈显著正相关,与pH和全磷含量呈显著负相关;土壤多酚氧化酶活性与土壤有机碳、含水量和全氮含量呈显著负相关。RDA分析表明,环境因子共可解释研究区土壤酶活性变异的81.2%,水位和土壤有机碳是影响研究区土壤酶活性的主...     

中药提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选

目的：从中药中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。方法：采用α-葡萄糖苷酶、淀粉酶以及蔗糖酶活性测定方法,对126种经水煮醇沉提取的常用中药进行α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选。结果：在0．28mg／ml反应体系下,24种中药提取物显著抑制α-葡萄糖苷酶活性;在0．1mg／ml反应体系下,5种中药提取物抑制α-淀粉酶活性。大黄、山茱萸、赤芍、五倍子对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶以及转化酶活性均有抑制作用,与阳性药物拜唐苹比较,这4种中药抑制α-淀粉酶的活性较低,但抑制α-葡萄糖计酶和转化酶的活性明显强于拜唐苹。结论：某些中药提取物能显著抑制α-葡萄糖苷酶活性,如果对其进一步分离、纯化并提取活性部位,可望获得抑制活性更强的中药α-葡萄糖苷酶抑制剂。     

嗜碱性芽孢杆菌碱性α淀粉酶的纯化和性质

淀粉是高等植物体内碳水化合物的主要储藏形式,广泛存在于谷物、豆类的种子和果实中.α1,4葡聚糖4葡聚糖水解酶(α1,4glucan4glucanohydrolase,EC3.2.1.1),又简称为α淀粉酶(αamylase),能水解淀粉分子内部α1,4葡萄糖苷键,水解产物有糊精、麦芽寡糖、麦芽糖和葡萄糖.它和β淀粉酶、α葡萄糖苷酶、去分枝酶(普鲁兰酶)和异淀粉酶等都属于糖苷水解酶13家族,即α淀粉酶家族[1].α淀粉酶是目前世界上最早生产、产量最大的工业酶制剂品种之一,在食品、纺织、医药和饲料等工业中都有非常重要的应用;其中碱性α淀粉酶常用于洗涤剂和纺织品工业中,…     

五味子抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性的比较研究

筛选出五味子抗氧化活性最强及α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最优的部位。对各提取物及有效部位进行含量测定。以对DPPH·清除能力和铁离子还原能力代表其抗氧化活性,比较五味子各提取部位的抗氧化活性。以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物,阿卡波糖(ACAR)为阳性对照,对各提取部位的α-葡萄糖苷酶活性的体外抑制作用进行比较。采用Origin 8软件中的多项拟合计算活性实验的IC50值及Abs0.7值,并采用皮尔森相关性分析测定活性成分含量与抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性间的相关性。五味子药材中含量最高的是总多糖类物质,含量为72.9 mg GL/g DM,其次为总酚酸类物质,含量为46.8 mg GA/g DM,木脂素类物质含量为39.6 mg SC/g DM,三萜类物质含量为32.2 mg OL/g DM,总黄酮类物质含量最低,为22.6 mg RU/g DM。五味子各有效部位抗氧化活性顺序为:总木脂素总黄酮总三萜总酚酸总多糖。对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用最强的为总木脂素(IC50值为0.24),抑制作用最弱的为总三萜。五味子70%乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用最优。五味子中总木脂素具有最优的抗氧活性及α-葡萄糖苷酶活性抑制活性。抗氧活性和α-葡萄糖苷酶活性抑制活性与木脂素类物质的含量呈正相关。     

饲用型青霉α-半乳糖苷酶活力测定的研究

研究了比色法测定饲用α-半乳糖苷酶活力,以对硝基苯酚-α-D-吡喃半乳糖苷为底物和对硝基苯酚作标准产物。酶活力的测定条件受很多因素的影响,如酶浸提液的pH、酶液稀释倍数、反应温度、作用时间。其中稀释倍数和pH的影响较为显著。稀释酶液的酶活测定值在0．02～0．07U／mL内较为合适。考虑到动物饲用酶制剂的特殊性,测定α-半乳糖苷酶活力时建议规定pH为5．5,反应温度为40℃。根据研究结果,反应时间采用10min,比色波长405nm为宜。     

α-环糊精葡萄糖基转移酶催化合成α-熊果苷

以对苯二酚和麦芽糊精为底物,通过α-环糊精葡萄糖基转移酶和淀粉葡萄糖苷酶的两步酶法反应体系催化合成α-熊果苷。优化后的催化条件:以葡萄糖当量(DE)值为8%~10%的麦芽糊精作为供体底物,麦芽糊精60g/L,对苯二酚150 mmol/L,缓冲液p H 6.0,在40℃下反应24 h。在此反应条件下,α-熊果苷的产量为3.17 g/L,对苯二酚转化率为7.77%。通过萃取法对α-熊果苷进行了初步分离,再经高效液相色谱-电喷雾串联质谱技术进行了结构测定,确定产物为α-熊果苷。