豌豆子叶线粒体发育过程中H~+-ATP酶的变化

关于线粒体的发育的研究,较多地以动物和酵母为对象,植物较少。而线粒体发育过程中 H~+-ATP 酶的 F_1-ATP 酶变化的研究,目前尚未见报道。本文以豌豆子叶为材料,就线粒体的发育,H~+-ATP 酶活性变化以及这种变化与 F_1-ATP 酶亚基组成的相关性进行了初步研究,其最终目的是探讨线粒体发育过程中内膜的发生及膜蛋白的组装问题。     

乙醇对F_1-ATP酶和H~+-ATP酶的抑制与其核苷酸结合位点状态的关系

 本文利用动力学方法研究了乙醇对F_1-ATP酶和H~(+)-ATP酶复合体的抑制与其结合核苷酸位点状态的关系,结果表明天然情况下乙醇对F_1呈现反竞争性抑制类型,对H~(+)-ATP酶呈现非竞争性抑制类型,且乙醇对F_1和H~(+)-ATP酶的抑制与核苷酸结合位点的构象密切相关。游离状态下和膜结合状态下的F_1在部分结合的核苷酸被洗脱前后动力学行为的不同,反映了二种状态下的F_1具有不同的构象,且F_0和膜脂对F_1起着一定的调控作用。     

中华眼镜蛇毒膜毒素对鼠肝线粒体膜的作用位点的研究

中华眼镜蛇毒膜毒素C(MT-C)对鼠肝完整线粒体的呼吸有明显抑制作用,但不影响完整线粒体的氧化磷酸化活力以及线粒体碎片上F_1-ATP酶的活力表现。根据膜毒素(MT-C)明显地抑制Ca~(++)诱导下的线粒体6态呼吸速度和质子释放,本文认为膜毒素(MT-C)在鼠肝线粒体上的真正作用位点可能位于内膜上Ca~(++)的结合位点附近,而不在呼吸酶系或磷酸化酶系本身。     

Mg~(2+)影响嵌有线粒体H~+-ATP酶脂酶体的表面电荷密度和流动性

<正> 我们实验室曾报道,用胆酸盐透析法将猪心线粒体H~+-ATP酶嵌入大豆磷脂脂质体形成脂酶体时,透析液中Mg~(2+)的存在会降低脂酶体的膜脂流动性,并明显提高重建H~+-ATP酶的活性以及对寡霉素或DCCD的敏感性,因而推论Mg~(2+)的作用很可能是通过改变膜脂的物理状态,形成了维持H~+-ATP酶较高活性的合适构象。但共确切的作用机制仍     

二价金属离子对嵌有H~+-ATP酶脂酶体的膜脂流动性、表面电荷密度、酶活的影响及其相关性的研究

本文对猪心线粒体H~ -ATP酶在大豆磷脂脂质体上重建过程中,二价金属离子(M_e~(2 ))影响膜脂流动性,面电荷密度,酶活及其相关性进行了研究和比较.结果表明:二价金属离子通过与脂酶体酸性磷脂的相作用,影响膜脂的流动性,进而影响H~ —ATP酶的构象,提高了酶活.     

猪心线粒体F_1-ATP酶的水解活性与色、酪氨酸残基相关的构象的关系

线粒体H~ -ATP酶具有双向功能,即ATP的合成与ATP的水解。H~ -ATP酶的头部F_1具有催化这二种功能的活性部位,F_1的活性表现位与它结合核苷酸的类型、数目以及亲和力有关。至于F_1分子活性部位中什么结构与这两种功能有关,目前尚不肯定。自1960年以来关于线粒体F_1的水解功能与其结构中氨基酸残基关系的研究,多采用特异的化学试剂去修饰某些氨基酸残基,然后测其水解活力被抑制的情况。Senior认为不是含—SH基的半胱氨酸而是酪氨酸残基,还可能包括色氨酸残基与ATP的水解有关。也有报道认为是与组氨酸、谷氨酸或精氨酸残基有关。现在蛋白质结构     

外源绿原酸缓解黑大豆SB铝毒害的机理研究

该文研究了外源绿原酸(CGA)对Al胁迫下铝敏感型黑大豆SB根生理生化指标以及根中胁迫相关基因表达的变化,探讨外源CGA缓解SB根铝毒害的效果及分子机理。以不同浓度Al和CGA处理SB,筛选出CGA缓解Al毒害的最佳浓度,测定Al含量、抗氧化系统酶活性、14-3-3蛋白与H~+-ATP酶的表达、H~+泵活性。结果表明:低浓度CGA能缓解Al胁迫下黑大豆SB根伸长抑制,并促进侧根数目增加,而高浓度CGA的缓解效果下降;0.01 g·L~(-1) CGA使Al胁迫下SB根尖Al含量与MDA含量下降,促进根系柠檬酸的分泌。RTPCR和Western Bloting分析表明0.01 g·L~(-1) CGA促进Al胁迫下SB根中14-3-3b、14-3-3m、14-3-3k和GHA2基因(质膜H~+-ATP酶)的表达,抑制MATE基因的表达。同时,0.01 g·L~(-1) CGA能促进Al胁迫下质膜H~+-ATP酶蛋白磷酸化水平以及其与14-3-3蛋白结合,且能提高质膜H~+-ATP酶和H~+泵活性。因此推测外源CGA可能通过增加侧根数,增强14-3-3蛋白和质膜H~+-ATP酶基因蛋白表达水平和互作,弥补Al胁迫下MATE表达的抑制,增加柠檬酸的分泌,增强SB对铝毒害的耐受性。     

钒酸钠对叶绿体ATP酶和光合功能的影响

钒酸钠是一种对红色链胞霉(nurospora)质膜—ATP酶有抑制作用的药物。Bowman近来发现氧化态五价钒离子对有产电质子泵(Electrogenic proton pump)作用的质膜—H~ -ATP酶也有专一的抑制效应,但它不影响线粒体的ATP酶活力。至于它对叶     

硒对T-2毒素引起培养软骨细胞超微结构与功能改变的拮抗作用

当培养液中存在0.01ppmT-2毒素时,可引起离体培养鸡胚软骨细胞胞外基质胶原微原纤维和质膜P面膜内蛋白颗粒明显减少,线粒体内膜细胞色素c氧化酶活力和H~+-ATP酶活力及其对OIigomycin敏感性明显下降。在0.01ppmT-2毒素存在下,加入1ppm Na_2SeO_3到培养液中,则胶原微原纤维和质膜膜内蛋白颗粒的减少不再呈现,细胞色素c氧化酶活力和H~+-ATP酶活力及其对Oligomycin敏感性的下降幅度明显减小。这些结果表明硒能够显著的拮抗T-2毒素引起的软骨细胞超微结构和功能的改变。从亚细胞水平和分子水平为阐明缺硒是大骨节病发病的重要条件和硒在预防大骨节病中的作用机理提供了依据。     

水稻幼苗根细胞质膜和液泡膜微囊Ca2+-ATP酶的特性

水稻幼苗根质膜和液泡膜Ca2 -ATP酶对ATP的Km值分别为7.1和4.5 μ mol·L-1;反应的最适pH分别为8.0和7.0.两者活性均受Na3VO4和曙红B(EB)抑制;CPZ抑制质膜Ca2 -ATP酶活性,但促进液泡膜Ca2 -ATP酶活性.30mmol·L-1CaCl2浸种和CaCl2浸种结合低温锻炼预处理,均可提高此酶的活性和冷稳定性.     

溶酶体膜H^＋—ATP酶的细胞化学观察

本实验在以p-NPP为底物、氯化铈为捕捉剂、Tricine-KOH为缓冲液的中性最适环境中温育大鼠肝组织,进行肝细胞、血窦内皮细胞和枯否氏细胞内溶酶体膜上H~+-ATP酶定位的细胞化学研究。温育反应形成的磷酸铈反应产物电子密度高、颗粒细、分布均匀、非特异性反应产物少、重复性好。对照实验证实,溶酶体膜上的H~+-ATP酶是对哇巴因耐受的,对NEM敏感的囊泡膜H~+-ATP酶。     

水稻幼苗根细胞质膜和液泡膜微囊Ca^2＋－ATP酶的特性

水稻幼苗根质膜和液泡膜Ca2+-ATP酶对ATP的Km值分别为7.1和4.5 μ mol·L-1;反应的最适pH分别为8.0和7.0.两者活性均受Na3VO4和曙红B(EB)抑制;CPZ抑制质膜Ca2+-ATP酶活性,但促进液泡膜Ca2+-ATP酶活性.30mmol·L-1CaCl2浸种和CaCl2浸种结合低温锻炼预处理,均可提高此酶的活性和冷稳定性.     

低温、高pH胁迫对水稻幼苗根系质膜、液泡膜ATP酶活性的影响

以耐冷性不同的两个水稻品种为材料,比较研究了幼苗根系质膜、液泡膜ATP酶对低温(8℃)及高pH(8.0)胁迫的反应。结果表明水稻根细胞质膜和液泡膜上均存在Ca3+-ATP酶,但活性远低于H+-ATP酶。耐冷品种武育粳3号经低温(8℃)处理2d,根系质膜和液泡膜H+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均明显升高,至冷处理12d,H+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性有所下降,但仍与对照相近;而冷敏感品种汕优63经低温(8℃)处理2d,根系质膜H+-ATP酶活性略有升高,而质膜Ca2+-ATP酶以及液泡膜H+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性已明显下降;至冷处理12d,4种酶活性均明显低于对照。高pH胁迫使质膜和液泡膜H+-ATP酶活性下降,而使Ca2+-ATP酶活性上升。高pH胁迫会加剧低温冷害。结果表明,耐冷品种质膜、液泡膜ATP酶比冷敏感品种对低温胁迫有更强的适应能力。     

Mg~(2+)对线粒体H~+-ATP酶的F_O在脂质体重建时的影响

线粒体ATP合成酶是由具有H~+转运活性的F_0亚基,可溶性的催化中心F_1和连接二者的致寡霉素敏感蛋白(OSCP)所组成. 将纯化的猪心线粒体H—ATP酶复合体的F_0亚基,用胆酸盐透析法在有Mg~(2+)和无Mg~(2+)条件下在大豆磷脂脂质体上重建得脂酶体(L·F_0).用探剂9-AA荧光淬灭法和电权法测定了两种脂酶体的质子转运活力.由两种方法所得的实验结果均表明,在透返介质中加入1mmolmg~(2+)条件下形成的脂酶体(L·F_0)+Mg~(2+)较无Mg~(2+)者的质子转运活性明显增加.前者的荧光强度变化较后者增加约30%;由电极法测得的质子转运的初速度,前者为5nmolH~+′sF_0,后者为3nmolH~+′s·nmolF_O,质子转运活性高约一倍.这进一步支持Mg~(2+)通过调节脂的物理状态而诱导F_O具有较适合的构象,并进而将这一影响传递至F_1,使整个H~+—AhP酶具有较高活性的假设.     

Mg~(2+)对线粒体H~+-ATP酶的F_O在脂质体重建时的影响

线粒体ATP合成酶是由具有H~+转运活性的F_0亚基,可溶性的催化中心F_1和连接二者的致寡霉素敏感蛋白(OSCP)所组成. 将纯化的猪心线粒体H—ATP酶复合体的F_0亚基,用胆酸盐透析法在有Mg~(2+)和无Mg~(2+)条件下在大豆磷脂脂质体上重建得脂酶体(L·F_0).用探剂9-AA荧光淬灭法和电权法测定了两种脂酶体的质子转运活力.由两种方法所得的实验结果均表明,在透返介质中加入1mmolmg~(2+)条件下形成的脂酶体(L·F_0)+Mg~(2+)较无Mg~(2+)者的质子转运活性明显增加.前者的荧光强度变化较后者增加约30%;由电极法测得的质子转运的初速度,前者为5nmolH~+′sF_0,后者为3nmolH~+′s·nmolF_O,质子转运活性高约一倍.这进一步支持Mg~(2+)通过调节脂的物理状态而诱导F_O具有较适合的构象,并进而将这一影响传递至F_1,使整个H~+—AhP酶具有较高活性的假设.     

生物膜能量偶联ATP酶的比较研究——Ⅰ.鼠肝线粒体内膜与ATP酶(F_1)的人工重组及ANS萤光探针与ATP酶的结合

本文报导了大鼠肝线粒体内膜ATP酶的析离和重组,以及膜对ATP酶的结构和功能的影响。用(1)胰蛋白酶-尿素、(2)硅钨酸盐和(3)枯草杆菌蛋白酶三种方法分别制备的去ATP酶(F_1)的线粒体内膜与可溶性的F_1重组后,完全恢复或部分恢复到天然线粒体内膜的ATP酶活力水平。寡霉素敏感性测定、ANS结合的发射萤光光谱测定、电镜负染标本观察和低温处理试验等都一致证明,ATP酶与膜重组后表现了一系列与天然膜相似的性质。ANS萤光探针与线粒体内膜结合的萤光增强效应主要在于ANS与ATP酶(F_1)的结合并与F_1的分子构象有密切关系。经胰蛋白酶-尿素处理去掉F_1的线粒体内膜基本上丧失了ANS的萤光增强效应。可溶性F_1经0℃处理2小时后,丧失酶水解活力的84%和ANS萤光增强效应的96.4%。F_1与膜结合后,则表现了对0℃低温的稳定性。结果提示,ANS可能与ATP酶分子的疏水微区相结合;ATP酶分子疏水结构的存在对于表现酶的水解活力和ANS的萤光增强效应是必要的条件;低温处理破坏了酶分子内的疏水结构;膜与ATP酶结合则有稳定酶分子的疏水结构和分子构象的作用。     

残缺类囊体膜与嵴膜小囊的融合膜结构观察

观察了菠菜叶绿体类囊体膜与残缺膜的表面结构及鼠肝线粒体嵴膜小囊在制备过程中的生成过程,证明了嵴膜小囊可有两种,F_1在膜外侧或膜内侧,它们都可与残缺膜组成镶嵌膜,进行光下磷酸化功能。而F_1在膜外侧的嵴膜小囊与残缺膜的嵌合膜活力更高。     

菠菜能量转化复合体的人工组装

从菠菜叶绿体中分离了H~+-ATP酶复合体,其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈九条亚单位带,为纯度较高的酶复合体。将H~+-ATP酶复合体重组于人工膜(脂质体)上,表现出PiATP交换活力。Mg~(++)-ATP酶活力也明显提高。并表现对DCCD,寡霉素的敏感性。 重组H~+-ATP酶复合体表现有ATP诱导的H~+转移。但脂质体也出现类似现象,为此对以pH改变为标准的检测方法提出商榷。     

生物膜能量偶联 ATP 酶的研究:鼠肝线粒体 ATP 酶(F_1)的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP 酶(F_1)在1MKCl-TEA 缓冲液(Tris-SO_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP 水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH 中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH 基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu 膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP 酶水解活力和对DCCD 的敏感性。     

生物膜能量偶联ATP酶的研究:鼠肝线粒体ATP酶(F_1)~*的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP酶(F_1)在1MKCl-TEA缓冲液(Tris-So_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2 mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP酶水解活力和对DCCD的敏感性。