ε-聚赖氨酸生物合成研究进展

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种可食用对人和环境无毒害可生物降解的天然生物材料。本文以聚赖氨酸的研究历史为主线,对ε-PL的合成与降解进行了综述并预测了ε-PL可能的代谢途径,最后展望了我国聚赖氨酸研究的发展前景。     

ε-聚赖氨酸生物制造及其在食品防腐领域的应用

ε-聚赖氨酸是由L-赖氨酸α-COOH和ε-NH2 缩合而成,由微生物合成的一种同型氨基酸聚合物.ε-聚赖氨酸是一种优良的生物防腐剂,对G+、G-、酵母菌和霉菌都有较好的抑菌效果.本文综述了ε-聚赖氨酸的来源与性质、产生菌的筛选与改造、发酵过程优化与调控、ε-聚赖氨酸分解酶、ε-聚赖氨酸合成机理和ε-聚赖氨酸酯化结构与...     

ε-聚赖氨酸高产菌株的选育

正ε-聚赖氨酸(PL)由链霉菌合成、分泌[1],对细菌、霉菌、酵母菌等有强烈的生长抑制作用,是一种被广泛应用的生物食品防腐剂。但野生型产生菌的ε-PL合成能力都比较低,利用物理和化学诱变,选育S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸和甘氨酸抗性突变株,已见报道的最高摇瓶产量为2.11 g/L[2];应用等离子诱变技术和基因组重排技术,可将ε-PL最高摇瓶产量提高到3.11 g/L[3]。但传统的选育手段耗时、耗     

ε-聚赖氨酸的微生物合成与降解

ε-聚赖氨酸为一种均聚氨基酸,由单个赖氨酸分子在α-羟基和-ε氨基形成酰胺键而连接成的多聚体,目前主要通过白色链霉菌(Streptomyces albulus)的微生物合成进行生产,具有抑菌谱广、热稳定性好、在酸碱条件下稳定等特点,作者综述了ε-聚赖氨酸微生物合成的方法、可能的生物合成和降解机制等,并简要介绍ε-聚赖氨酸作为食品保鲜剂在食品和生物高分子材料在基因治疗、药物载体、基因芯片、高吸水性材料等方面的应用前景。     

小白链霉菌ε-聚赖氨酸降解酶生理功能分析

[目的] 研究小白链霉菌（Streptomyces albulus）中ε-聚赖氨酸降解酶（Pld）的分布特征和生理功能。[方法] 利用生物信息学手段对已报道的ε-聚赖氨酸（ε-PL）产生菌的Pld进行挖掘和分析,再通过遗传学方法对小白链霉菌M-Z18基因组中存在的两种pld进行敲除、回补和过表达,最后研究重组菌降解ε-PL能力、最小ε-PL抑制浓度（MIC）及其合成ε-PL情况。[结果] PldⅠ和PldⅡ广泛且同时分布于小白链霉菌中,蛋白序列高度保守;PldⅠ、PldⅡ在小白链霉菌M-Z18中均能行使降解ε-PL的功能,但PldⅡ降解活性占主导地位且PldⅠ和PldⅡ对降解ε-PL具有协同作用;pldⅠ、pldⅡ过表达重组菌对ε-PL的MIC值显著提高,其中双过表达pldⅠ和pldⅡ菌株对ε-PL的MIC值是出发菌株的2.19倍。构建的pld重组菌与出发菌株相比,在考察pH值范围内（pH 3.0-5.5）的ε-PL产量未表现出显著差异。[结论] 小白链霉菌中广泛分布PldⅠ和PldⅡ且序列高度保守,主要生理功能是保护小白链霉菌在中性环境中免受自身产物ε-PL的抑制。     

细菌萜类合成酶的生物信息学分析

【目的】目前对于萜类合成酶(Terpenoid synthase,TPS)的研究主要集中在植物和真菌中,而对细菌TPS的系统研究尚少。建立在大量已经被测序的细菌基因组基础上,利用生物信息学方法,对细菌TPS在全基因组范围内进行识别、分类和功能分析。【方法】利用TPS的隐马尔科夫模型(Pfam编号为PF03936)搜索自建的细菌蛋白质组数据库,预测出细菌TPS。对这些候选TPS的蛋白序列用MAFFT 7.130b进行多序列比对,并利用MEGA 6.0对多序列比对结果进行进化分析。利用MEME和PredictProtein分别进行细菌TPS的基序(Motifs)和点突变分析。【结果】建立在生物信息学分析的基础上,1 423条细菌TPS被识别,它们分布在8个门中,即放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)和衣原体门(Chlamydiae)。进化分析表明细菌TPS可分为4大类,Motifs分析表明除了各类之间保守的基序(Motifs)外,还有特异的Motifs,这暗示着细菌TPS在不同类别之间的功能分化。点突变分析表明,细菌TPS不同位点的氨基酸突变对TPS功能的影响不同。【结论】细菌TPS主要分布于8个门中,其中在2个门中细菌TPS尚未见报道,即厚壁菌门(Firmicutes)与酸杆菌门(Acidobacteria)。基于进化分析,可以把细菌TPS分为4类,各类之间的差异可能是由类特异的Motifs决定的,另外细菌TPS不同氨基酸位点的突变分析为今后验证TPS的功能提供了很好的理论基础。     

ε-聚赖氨酸抑菌性能的研究进展

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是抑菌谱广泛的天然抑菌剂,由通过α-羧基与ε-氨基连接的25–35个赖氨酸聚合而成。ε-PL主要由白色链霉菌发酵生产所得,比化学生产更加高效和环保。ε-PL具有水溶性好、耐热和对环境无污染等特点,具有良好的应用前景。本文从发酵生产入手,着重综述了ε-PL对各种微生物抑菌性能、抑菌机制及抑菌机制模型的研究进展。推测ε-PL是通过对细胞膜的破坏而改变细胞的通透性,或者作用到细胞内引起活性氧(reactive oxygen species, ROS)胁迫而影响调节基因的表达,从而起到抑菌作用。根据这2种抑菌方式分别建立了相应的抑菌模型,即毡毯模型和ROS诱导细胞凋亡模型。本文可为ε-PL对微生物抑制性能的深入研究提供依据,同时也提出了ε-PL抑菌机制的新模型,为扩展ε-PL应用领域提供了一定的参考。     

产ε-聚赖氨酸菌株生物合成条件研究

对一株产ε-聚赖氨酸Kitasatospora sp.PL6-3菌株进行生理生化特性研究。并通过5L发酵罐中ε-PL的合成条件的考察,发现在搅拌转速为350r／min,pH4.0,初糖浓度为3％并补糖的操作条件下ε-PL的质量浓度可高达6.65g/L,产率提高近10倍。     

大剂量紫外诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌

以白色链霉菌Z-18为出发菌株,经大剂量紫外诱变处理,用S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸（AEC）氨基酸结构类似物平板定向育种方法,获得1株ε-聚赖氨酸高产菌C-18,其发酵液中ε-聚赖氨酸产量较出发菌株提高42．9％。在含有50g／L葡萄糖的培养基中,ε-聚赖氨酸积累可达1．23g／L。     

氨基酸对禾粟链霉菌生物合成ε-聚赖氨酸的影响

为了探索氨基酸对Streptomyces graminearus LS-B1以葡萄糖发酵生产ε-聚赖氨酸(ε-PL)的影响,分别在发酵过程中添加了16种常见氨基酸.研究结果表明,苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、天冬酰胺(Asn)、色氨酸(Try)6种氨基酸对ε-PL合成有一定的...     

植物肌醇-1-磷酸合成酶的生物信息学分析

采用生物信息学工具及网络资源,对已在GenBank上注册的玉米、小麦、芝麻、菜豆、海茄冬、红三叶等植物的肌醇-1-磷酸合成酶的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、导肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、分子系统进化关系、蛋白二级及三级结构等进行预测及推断。结果表明:植物肌醇-1-磷酸合成酶在进化过程中非常保守,且可能为定位于细胞质的亲水性蛋白;结构预测表明不同来源的MIPS蛋白尽管在结构上有所差异,但是其催化位点及NAD+结合区基本一致,具有较强的保守性。     

ε-聚赖氨酸产生菌新菌株的筛选和产物结构鉴定

通过对Nishikawa的方法进行改进,在广东各地土样中筛选到一株产量为0.846 g/L的新ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌株,命名为Str-8。对Str-8菌株进行形态、生理生化和16S rDNA分析,初步确定为不吸水链霉菌Streptomyces ahygroscopic。纯化的发酵产物通过水解、质谱、紫外光谱等性质确定为ε-PL。     

链霉菌ε-聚赖氨酸发酵过程中的氧化胁迫效应

【目的】探究ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌对p H和ε-PL的耐受性、氧化胁迫与ε-PL合成之间的关系。【方法】选取3株ε-PL产生菌Streptomyces sp.AF3-44、Streptomyces sp.AS32和Streptomyces albulus F15,比较其在发酵性能、p H和ε-PL耐受性以及抗氧化胁迫能力上的差异,并对菌株发酵过程的活性氧成因进行分析。【结果】在3株菌中AF3-44具有最强的p H和ε-PL耐受性及抗氧化胁迫能力,因而在发酵后期能够保持良好的细胞活性和最高的ε-PL浓度;ε-PL引起的氧化胁迫主要发生在发酵前期,而发酵中后期氧化胁迫的产生主要由酸性p H导致。【结论】提高链霉菌ε-PL发酵过程中的抗氧化胁迫能力,可提升菌体活力和发酵水平。     

原生质体诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌株

以白色链霉菌UN2-71为出发菌株,对其原生质体进行硫酸二乙酯(DES)诱变,选育ε-聚赖氨酸高产菌株。经过试管初筛和摇瓶复筛,得到1株稳定性好的菌株D3-32,摇瓶产量达到1.56g/L,比出发菌株提高49.43%。采用2.3L发酵罐进行发酵试验,控制pH分两阶段培养后,ε-聚赖氨酸最高产量达到4.59g/L,比出发菌株提高了2.65倍。     

利用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵培养基

采用响应面法对白色链霉菌ZC7发酵合成ε-聚赖氨酸的培养基进行优化研究。采用Plackett-Burman法对8个因素进行了筛选,结果表明,葡萄糖、酵母膏和硫酸铵的浓度对ε-聚赖氨酸产量影响较大。用最陡爬坡试验及Box-Behnken设计进一步优化,利用Design-Expert软件进行二次回归分析,得到各因素的最佳浓度为:葡萄糖37.22 g/L,酵母膏6.9 g/L,硫酸铵6.55 g/L。在此优化条件下ε-聚赖氨酸的产量达到8.11 g/L,较单因素试验最高值提高24.6%。     

ε-聚赖氨酸高产菌选育与发酵性能评价

【目的】选育ε-聚赖氨酸(ε-PL)高产菌,并探究不同碳源对其发酵性能的影响。【方法】借助基因组重排和核糖体工程两种育种手段强化ε-PL产生菌的合成能力,并利用p H冲击工艺评价不同碳源对ε-PL发酵的影响。【结果】经过4轮基因组重排和4轮核糖体工程连续选育,获得1株高产突变株Streptomyces albulus GS114,其摇瓶ε-PL产量达到3.0 g/L,较出发菌提高了1.7倍。该改造菌株在5 L发酵罐中分别以葡萄糖和甘油为碳源进行192 h的补料-分批发酵时,ε-PL发酵产量分别达到了43.4 g/L和45.7 g/L,较出发菌提高了11.0%和14.9%,而菌体量分别减少了24.0%和33.2%,ε-PL得率提高了34.2%和30.7%。【结论】基因组重排结合核糖体工程育种是一种有效的ε-PL高产菌选育手段,研究结果将为ε-PL高产菌改造和工业生产碳源选择提供直接指导。     

ε-聚赖氨酸生物合成及其产生菌遗传转化研究进展

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由25-35个L-赖氨酸(L-lysine)通过α-ε酰胺键连接的具有很强抗菌活性的聚合物,是自然界中迄今为止仅发现的2种均聚氨基酸(ε-聚赖氨酸和γ-聚谷氨酸)之一。目前,研究发现ε-聚赖氨酸的合成酶是一种非核糖体肽合成酶,它催化前体物质L-lysine经多轮缩合反应合成链长不均一的ε-聚赖氨酸,与I型聚酮合成酶的合成过程相似。ε-聚赖氨酸的合成不受降解酶控制。同时,针对产生菌遗传转化的穿梭质粒载体pLAE001和pLAE003已构建成功,为进一步探索ε-聚赖氨酸生物合成提供了条件。本文主要就ε-聚赖氨酸生物合成及产生菌遗传转化体系进行综述。另外,扼要介绍了作者所在课题组的相关研究工作、取得的进展并提出了相应的见解,论文最后部分对组合生物合成在ε-PL产生菌菌种改造中的应用前景进行了探讨。     

核糖体工程技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

【目的】利用核糖体工程技术选育Streptomyces albulus AS3-14的链霉素和利福平双重抗性突变株,以提高其ε-聚赖氨酸合成能力。【方法】通过链霉素抗性筛选,获得链霉素抗性的ε-聚赖氨酸产量提高突变株;在此基础上,继续筛选其利福平抗性突变株,实现链霉素和利福平双重抗性ε-聚赖氨酸高产菌选育。【结果】获得的双重抗性高产突变株Streptomyces albulus WG-608的ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到3.7 g/L,5 L发酵罐补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量达到53.0 g/L,较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%。【结论】链霉素和利福平双重抗性选育能够显著提高ε-聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus的产物合成能力。     

搅拌转速和pH对ε-聚赖氨酸发酵的影响

采用5L自控式发酵罐研究了ε-聚赖氨酸分批发酵过程中搅拌转速和pH对发酵指标以及菌体细胞形态的影响。提高搅拌速率对菌生长和ε-赖氨酸的合成有显著的促进作用;但当搅拌转速达到400r／min以上时,由于剪切力过大导致细胞死亡,ε-聚赖氨酸产量下降。当pU维持5以上,有利于菌体生长;pH4．0左右可促进￡一聚赖氨酸的合成。搅拌转速350r／min和控制pH4．0时可获得最大的￡一聚赖氨酸产量2．95g/L,菌体量9．33g／L;此时产物E．聚赖氨酸对葡萄糖的得率和对细胞干重的比生成速率分别为0．062g／g和0．006g／g．h。通过对比不同发酵条件下ε丝体的形态变化,发现当菌丝球比较均匀、形态无较大差别、具有致密程度相当的核心时,有利于￡一聚赖氨酸形成。