化妆品中耐热大肠菌群和金黄色葡萄球菌检测能力验证分析

为增强实验室竞争力,考察实验室检测水平,本实验室参加了ACAS-pT743(2019)化妆品耐热大肠菌群及金黄色葡萄球菌的检测能力验证.本次能力验证中实验室共接收了四个样品,按照《化妆品安全技术规范》2015版对样品展开检测,并采用关键生理生化指标对可疑菌落加以确定以及16 S rDNA序列测定方法对结果进行复确认.结...     

实验动物金黄色葡萄球菌的实验室检测能力验证结果评价

目的通过实施实验动物金黄色葡萄球菌检出能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,通过低温冻干制备样品,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果共有28个实验室参加本次能力验证项目,其中获得满意验证结果的实验室为22个,占总参加机构的78.57%;未得到满意验证结果的实验室为6个,占21.43%。采用国标检测方法的有27个,采用PCR检测方法的有1个。结论实验动物质量检测机构对金黄色葡萄球菌的检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。     

藏绵羊子宫内膜炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立与评价

本研究旨在建立一种多重PCR方法检测青海藏绵羊子宫内膜炎主要的病原菌。首先,提取5种标准菌株基因组,筛选出特异性引物;然后以标准菌株的基因组为模板,建立多重PCR方法。用无菌棉拭子涂抹藏绵羊子宫,置于LB培养液中培养并编号,48 h后提取样品基因组。运用单一PCR法对600份样品基因组进行检测,记录阳性样品;再挑取单一PCR法检测的阳性样品进行多重PCR检测,再次记录阳性样品,通过计算两种检测方法的符合率验证多重PCR方法;随机挑出30份阳性样品,进行病原菌分离鉴定菌种种类。单一PCR检测的样品中,无乳链球菌感染比例占47.33%,大肠杆菌占34.83%,金黄色葡萄球菌占6.5%,未检出沙门氏菌和化脓隐秘杆菌;多重PCR检测的阳性样品中,无乳链球菌感染比例占45.50%,大肠杆菌占33.50%,金黄色葡萄球菌占6.5%;两种检测结果相比较,多重PCR检测出的符合率均高于95%;分离鉴定的病原菌与两种PCR方法检测出的菌种结果基本一致。成功建立了多重PCR方法并检测出引起青海藏绵羊子宫内膜炎的主要病原菌为无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。     

金黄色葡萄球菌的检测方法优化及其在舟山市水产品加工厂中的污染状况调查

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起食物中毒的重要致病菌。为简化金黄色葡萄球菌复杂的检测方法,并了解舟山市水产品中该致病菌的污染状况,通过比较已公开的3套针对耐热核酸酶编码基因的PCR鉴定体系,根据特异性和灵敏性实验筛选了1套最优的针对金黄色葡萄球菌的PCR鉴定体系。基于这一体系和国家规定的标准方法,对舟山市水产品加工厂各个环节采集的120份样品中金黄色葡萄球菌的污染状况进行了调查。结果显示,120份样品中金黄色葡萄球菌的检出率为8.3%,PCR检测方法与国标法检出阳性率比较无显著差异,而且集中在原料和环境这两个环节检出金黄色葡萄球菌,在半成品和成品中却未检测到。由此,可以认为舟山市水产品加工厂的原料和环境中存在着一定的安全隐患,而成品相对较为安全。     

浅析微生物检验在化妆品检验中的应用

目的:检验日常化妆品中微生物的污染情况,分析微生物检验在化妆品检验中的应用。方法:对市场上常见的化妆品进行抽检,共200份样品,对样品的菌落总数、粪大肠菌群、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、霉菌和酵母菌进行检测。结果:使用前采样的化妆品微生物合格率为99%,使用前、使用30d后及60d后的化妆品,微生物合格率随其使用时间的延长而依次降低。结论:化妆品在使用过程中存在二次污染,使用时间越长,污染越严重,要正视微生物检验在化妆品检验中的积极作用,对当前存在的问题展开分析,加强检验工作。     

牛奶中金黄色葡萄球菌PCR检测方法的建立与应用

目的:建立一种直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCR快速诊断方法.方法:根据已发表的金黄色葡萄球菌16-23SrRNA特异性序列设计并合成一对引物,通过优化反应条件建立从牛奶中直接检测金黄色葡萄球菌的PCR方法.结果:与细菌的常规分离方法相比,PCR法敏感性高,与其它型葡萄球菌无交叉反应,特异性迭100%,检测细菌基因组DNA最低浓度为35ng/μL,能在5h内对送检的牛奶样品直接进行金黄色葡萄球菌的测定,可用于乳制品中金黄色葡萄球菌的检测.结论:成功建立了快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌PCR方法.     

实验小鼠肾匀浆中苹果酸酶-1和异柠檬酸脱氢酶-1实验室检测能力验证结果评价

目的通过实验小鼠肾匀浆中苹果酸酶-1和异柠檬酸脱氢酶-1检测能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,通过样品制备,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果共有10个实验室参加本次能力验证项目,其中满意结果的实验室8个,占总参加机构的80%,不满意的实验室有2个,占20%。结论实验动物质量检测机构在实验小鼠肾匀浆中苹果酸酶-1和异柠檬酸脱氢酶-1的检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。     

FTA滤膜用于PCR检测肉中的金黄色葡萄球菌

利用FTA滤膜,采用PCR技术可直接检测肉及肉制品中的金黄色葡萄球菌,无需增菌,灵敏度高。在采用浮选与溶剂萃取相结合方法的基础上,使用FTA膜可高效地从鲜肉中提取金黄色葡萄球菌的DNA,消除PCR反应的抑制因子。以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因,经过PCR扩增得到279bp的产物。经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物。使用FTA滤膜处理样品,再通过PCR方法检测金黄色葡萄球菌,猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉匀浆液的检出限均为10cfu/mL,可在6h内完成对肉中金黄色葡萄球菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h 。实际检测了72份样品,同时与GB 4789.10-94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌检测方法做比较,PCR方法的检出率为72.2％,检出时间为6h,GB 4789.10-94方法检出率为70.8%,检出时间为5d,Prfilm RSA方法的检出率为61.1％, 检出时间为18h,BairdParker R.P.F方法的检出率为69.4％,检出时间为18h,结果表明FTA滤膜用于PCR检测肉中金黄色葡萄球菌检出率高,耗时短。使用FTA滤膜法制备模板DNA,为食品中的致病菌快速检测构建了一个技术平台。     

产毒金黄色葡萄球菌鉴定及在百叶中生长与产毒特性分析

从生鲜食品中分离鉴定得到产肠毒素SEA的金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）菌株,研究金黄色葡萄球菌在百叶中的生长变化及产肠毒素特性。将不同浓度的金黄色葡萄球菌同时接种到减菌（样品组）和未减菌（对照组）百叶中,高、低初始接种量分别控制在4.0 lg(cfu/g)和2.0 lg(cfu/g)左右,并定时追踪不同储存温度条件下百叶中金黄色葡萄球菌的活菌数及产毒情况。金黄色葡萄球菌肠毒素的检测采用商业化的ELISA试剂盒。在37 ℃储存过程中,金黄色葡萄球菌在样品组中不但能生长良好并在18 h后菌落数可达到7.0 lg(cfu/g)并被检测出肠毒素,对照组中金黄色葡萄球菌生长良好菌落数可达到7.0 lg(cfu/g)却未检测出产肠毒素。在25、15和5 ℃储存过程中,样品组和对照组百叶都未检测出肠毒素。温度对金黄色葡萄球菌在百叶中是否产肠毒素具有决定性的作用,且百叶中本身存在的杂菌可能可以抑制金黄色葡萄球菌产肠毒素。     

兔出血症病毒抗体的实验室检测能力验证结果评价

目的通过兔出血症病毒抗体检测能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,通过筛选血清制备样品,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果来自14个省市自治区的20个实验室报名参加本次比对实验,均在规定时间内反馈了检测结果,17个实验室检测结果为合格或优秀,占参加比对实验室的85%。在20个实验室中,14个实验室采用了酶联免疫吸附实验(ELISA)方法,6个实验室采用血凝抑制实验(HAI)方法。结论全国各实验动物检测机构兔出血症病毒抗体总体检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。     

妇科凝胶类微生物限度检测方法的验证

目的:建立妇科凝胶的微生物限度检查方法。方法:按2010?年版《中国药典(二部)》相关要求进行试验,以枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、黑曲霉为试验菌,铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌为控制菌对样品进行微生物限度检查的方法学验证。结果:细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证试验中,试验菌的回收率均大于70%;控制菌检查结果符合《药典》相关要求。结论:该方法准确可靠,适用于妇科凝胶类微生物限度的检测。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术建立了对肉中金黄色葡萄球菌检测的方法。实验中,使用了最新的Bst 20 WarmStart DNA聚合酶完成LAMP扩增反应,并针对金黄色葡萄球菌所特有的保守性耐热核酸酶基因（nuc）设计得到了一套LAMP扩增引物。对LAMP法和PCR法的检测灵敏度进行了比较,同时对人工污染肉中的金黄色葡萄球菌进行检测。结果表明：所建立的LAMP法能够特异性的检测金黄色葡萄球菌,并且检测金黄色葡萄球菌纯菌的灵敏度为201×100CFU/mL,是普通PCR检测灵敏度的100倍。在检测肉中金黄色葡萄球菌时,检测限为201×101CFU/mL。因此,本实验所建立的LAMP法检测肉中金黄色葡萄球菌的方法,具有灵敏、快速以及简便等的优点,是一种具有很好的发展前景的检测手段。     

mecA基因PCR扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的 应用mecA基因PCR扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus,MRSA）。方法 临床分离的70株金黄色葡萄球菌,应用mecA基因PCR扩增法鉴定MRSA,并与苯唑西林纸片扩散法进行比较。结果 70株金黄色葡萄球菌用PCR扩增法和纸片扩散法有6株鉴定有差异,4株。mecA基因阳性而纸片扩散法鉴定为敏感,1株mecA基因阳性纸片扩散法鉴定为临界耐药,1株mecA基因阴性却表现为苯唑西林耐药,2种方法符合率为91．43％。结论 mecA基因PCR扩增法可以准确、快速判定MRSA,特别是对隐匿型或低水平耐药菌株的检出有重要的价值。     

金黄色葡萄球菌LDH多克隆抗体制备及其交叉反应性

目的:在原核载体中表达、纯化金黄色葡萄球菌乳酸脱氢酶,免疫小鼠获得多克隆抗体,使用多克隆抗体分析与其它菌种的交叉反应性。方法:复苏p ET28a-ldh/Bl21重组菌,IPTG诱导重组融合蛋白表达、以抗HIS标签的单克隆抗体进行western-blot鉴定重组蛋白。使用纯化的重组蛋白以及相应的佐剂免疫小鼠,利用ELISA测定血清抗体效价,并使用小鼠抗血清进行免疫印迹法鉴定重组蛋白的反应原性及其与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌的交叉反应性。结果:SDS-PAGE电泳在39 KDa处可见目的条带,免疫印迹法验证了重组LDH的表达,纯化后获得2.8 mg重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性Ig G效价为1:50000,western-blot鉴定显示所制备的多克隆抗血清能分别识别金黄色葡萄球菌重组及天然乳酸脱氢酶,但不识别表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌中天然乳酸脱氢酶。结论:纯化的LDH具有良好的免疫活性,免疫小鼠获得高滴度的多克隆抗体。使用多克隆抗体western-blot显示与其它菌种LDH不存在交叉反应性,为后续使用该重组蛋白进行金黄色葡萄球菌感染的诊断研究奠定基础。     

VITEK-2 compact全自动微生物鉴定仪对葡萄球菌鉴定能力的评价

目的评价VITEK-2 compact全自动微生物鉴定仪对葡萄球菌的鉴定能力。方法收集从我院病人标本中分离的葡萄球菌81株。常规细菌培养后,用VITEK-2 compact和API Staph系统进行检测,以API Staph系统为参照,评价VITEK-2 compact的优势和不足。结果 VITEK-2 compact和API Staph系统的总体鉴定符合率为95.1%,其中金黄色葡萄球菌的鉴定符合率为100%,凝固酶阴性葡萄球菌的鉴定符合率为90.5%。结论 VITEK-2 compact鉴定系统能够满足临床工作的需求,其中对金黄色葡萄球菌的鉴定率较高,在进行凝固酶阴性葡萄球菌鉴定时有一定的局限性,需要其他方法予以补充。     

雪貂葡萄球菌的分离与鉴定

目的对雪貂分离菌株进行鉴定。方法通过菌落、菌体形态、生化特征等细菌学检测方法和药敏实验对所分离菌株进行鉴定。结果根据生物学特性和药敏实验确定所分离菌株为金黄色葡萄球菌和中间葡萄球菌。结论分离菌株为金黄色葡萄球菌和中间葡萄球菌。     

犬肾细胞MDCK无血清贴壁及单细胞悬浮培养

旨在挖掘用于鉴定金黄色葡萄球菌的高特异性靶点及其PCR检测引物。采用C++语言编程,以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus MRSA 252基因组编码序列为对象,对2 656个可编码区进行分析,获得特异性靶点序列,并设计PCR扩增引物。对包括葡萄球菌属11个种及其他细菌属在内的共计137株细菌验证引物特异性,筛选获得9个DNA序列,并设计了4对引物。经验证2对引物的特异性较好,其中引物SA3的基因组DNA检测限为13.7 fg/μL,菌体检测限为9.25×102 CFU/mL。结果验证     

实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体的实验室检测能力验证结果评价

目的通过实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,血清经过标定后,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果共有17个省市的27个实验动物检测机构报名参加本次能力验证项目。27个检测机构均提交了满意结果,占总参加机构的100%。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法的有26个检测机构,采用免疫荧光实验(IFA)方法的有1个检测机构。结论实验动物质量检测机构实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。     

兰州市餐饮食品、餐具食源性致病菌监测结果分析

目的：掌握兰州市主城区餐饮食品卫生状况,为卫生行政部门制定相应监督、监测方案提供科学依据。方法：采集57家餐饮单位餐饮凉拌菜、炝拌菜、熟肉制品、冷加工糕点、鲜榨果汁、沙拉果盘、动物性水产品、餐饮器具、器皿等共计418个样品,进行大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特氏菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌检测,并利用生物梅里埃全自动鉴定系统对菌种进行分析。结果：312份食品样品合格率为90.06%,大肠菌群检出率6.41%、金黄色葡萄球菌检出率0.96%、李斯特氏菌检出率1.60%、沙门氏菌检出率0.64%、副溶血性弧菌检出率0.32%,未检出志贺氏菌。106份餐饮器具总检出率为5.66%,其中,李斯特氏菌、大肠菌群分别占0.94%、4.72%。结论：本检测结果可指导食品监管部门提高应急处置突发事件的能力,切实保障广大人民群众的利益。     

PCR技术在检测鼠金黄色葡萄球菌中的应用研究

目的　建立实验大小鼠金黄色葡萄球菌的快速检测方法———PCR法。方法　根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果　金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性 ,结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。结论　本研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测。