甜菜碱改善水稻高GC含量DNA序列的PCR扩增

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)作为一项基本的分子生物学技术,是DNA序列扩增的强有力工具。水稻作为人类最重要的粮食作物之一被广泛研究,然而由于水稻基因组序列的GC含量相对较高,而高GC含量DNA序列的PCR扩增一般比较困难,使得水稻高GC含量序列的功能研究受阻。通过使用不同的添加剂,发现相比于二甲基亚砜和甘油等,甜菜碱对于水稻高GC含量片段的PCR扩增的增强效果最明显。通过对多个高GC含量的水稻DNA片段进行PCR扩增,发现1-2 mol/L甜菜碱对于增强PCR扩增效果显著。此外,甜菜碱对于多种DNA聚合酶作用下的PCR扩增均有增强效果。     

甜菜碱改善水稻高GC含量DNA序列的PCR扩增北大核心CSCD

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)作为一项基本的分子生物学技术,是DNA序列扩增的强有力工具。水稻作为人类最重要的粮食作物之一被广泛研究,然而由于水稻基因组序列的GC含量相对较高,而高GC含量DNA序列的PCR扩增一般比较困难,使得水稻高GC含量序列的功能研究受阻。通过使用不同的添加剂,发现相比于二甲基亚砜和甘油等,甜菜碱对于水稻高GC含量片段的PCR扩增的增强效果最明显。通过对多个高GC含量的水稻DNA片段进行PCR扩增,发现1-2 mol/L甜菜碱对于增强PCR扩增效果显著。此外,甜菜碱对于多种DNA聚合酶作用下的PCR扩增均有增强效果。     

进境德国云杉原木中夹带栎树猝死病菌的检疫鉴定

[目的] 检测自德国进境云杉原木夹杂的水青冈植物叶片上是否携带栎树猝死病菌。[方法] 采用磁珠法提取水青冈植物叶片DNA,根据巢式PCR方法和DNA序列测定分析方法,进行栎树猝死病菌的检测。[结果] 采用巢式PCR方法,能够扩增出约280 bp的特异性条带;DNA序列测定表明,该DNA序列与GenBank中多个栎树猝死病菌分离物DNA序列相似性达99%,位于同一个发育分支。[结论] 样品中检出栎树猝死病菌,这是我国口岸首次从进境德国云杉原木中截获栎树猝死病菌。     

纵纹腹小鸮DNA指纹谱探针的筛选和初步应用

以人工合成的微卫星序列 (GTG) 5,(GT) 8,(CAC) 5和人源小卫星 33 1 5作引物 ,扩增纵纹腹小的基因组DNA ,产生多态性DNA片段 ,回收了 8个表现个体特异性的片段。当用小的基因组总DNA探针与它们杂交时 ,其中 2个表现阳性 ,说明PCR方法扩增出的高变异产物含有重复序列。用含重复序列的个体特异性PCR产物作探针 ,与无关个体小基因组DNA的HaeⅢ酶切产物进行DNA印迹 ,获得了变异性较高的DNA指纹图谱。且通过对京白鸡家系分析表明 ,用小基因组DNA的PCR产物分离制备的探针所获得的DNA指纹图带能够稳定的遗传。因此 ,高变异的PCR产物可以有效地用作DNA指纹探针。     

唾液中人类疱疹病毒7型的分离与培养

目的：了解人群中人类疱疹病毒7型（HHIV－7）的感染情况,并对HHV－7进行分离培养、鉴定。方法：以聚合酶链反应（PCR）检测唾液中的HHV－7,再以巢式PCR及酶切加鉴别;分离其中2例标本中的病毒,以人脐带血单个核细胞（HCBMC）进行培养,再通过DNA序列测定来鉴定培养结果。结果：检测120例唾液标本有97例阳性,PCR阳性结果示186bp处有一荧光带,经ECORI酶切后成为126bp和60bp两条荧光带,巢式PCR结果示94bp处有一荧光谱,HCBMC可用于HHV－7的传代培养,唾液中分离的HHV－7与培养结果所测得的病毒序列一致。与Berneman分离测得的JI株结果相似,结论：人的唾液中HHV－7检出率高,HHV－7可在HCBMC中增殖。     

DNA测序技术的进展和挑战

基因是人类的遗传信息的载体,其遗传和表达影响人类的繁衍及各种生命活动;个体基因组DNA序列突变往往会导致疾病的发生,获取个体的基因组DNA序列将有助于疾病的诊断.DNA测序技术潜在的医学应用前景使其近几年有了飞速的发展.本文将介绍各代DNA测序技术已经取得的进展,目前尚待克服的挑战及可能的解决办法,并着重分析最新的单分子测序技术的发展潜能及临床应用前景.     

MDA技术在转基因检测中的研究与应用

PCR技术是转基因植物及其产品检测的主要方法,但是因为其对模板纯度和质量有较高要求,对于低质量模板难以获得稳定的检测结果。本研究利用MDA技术可将低至10 copies的微量DNA样品扩增至可用PCR方法稳定检出;进一步利用MDA技术对转基因玉米有证标准物质Bt11粉末的单颗粒痕量样品释出DNA进行扩增,结合PCR扩增检测,玉米粉末颗粒中内源参照基因的检出率达到70%以上,转基因特异性序列检出与内源参照基因检出的比值,与标准物质标称值基本相符,为建立基于MDA技术转基因植物及其产品粉末颗粒等痕量样品检测方法奠定了基础,同时也为加工产品中复合性状转基因作物的检测提供了潜在的解决方案。     

单分子PCR技术及其应用

常规PCR技术大都以大量DNA分子(一般为105个以上)为模板进行DNA扩增。新近发展起来的单分子PCR技术是一种以极少量DNA分子(1、5或10个分子)为模板进行扩增的技术。在高保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术能扩增出高度一致的DNA;在低保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术又能构建出含有大量突变基因的DNA库。该将介绍单分子PCR的基本原理、实验步骤、特点及其应用。     

纵纹腹小HaoDNA指纹谱探针的筛选和初步应用

以人工合成的微卫星序列（GTG）5,（GT）8,（CAC）5和人源小卫星33.15作引物,扩增纵纹腹小Hao的基因组DNA,产生多态性DNA片段,回收了8个表现个体特异性的片段,当用小Hao的基因组总DNA探针与它们杂交时,其中2个表现阳性,说明PCR方法扩增出的高变异产物含有重复序列,用含重复序列的个体特异性PCR产物作探针,与无关个体小Hao基因组DNA的HaeⅢ酶切产物进行DNA印迹,获得了变性性较高的DNA指纹图谱,且通过对京白鸡家系分析表明,用小Hao基因组DNA 的PCR产物分离制备的探针所获得的DNA指纹图带能够稳定的遗传,因此,高变异的PCR产物可以有效地用作DNA指纹探针。     

种子特异性启动子(napinB promoter)分离、表达载体构建及转基因植物获得

利用PCR技术从油菜Brassica napus H165基因组DNA中分离了napinB启动子。序列分析表明,扩增片段(nap300)与文献报道的napinB启动子相应区域的同源性为97%。将其与gus连接构建种子特异性表达载体,农杆菌介导转化烟草。PCR、Southern结果显示,nap300已整合到烟草基因组DNA中,获得了转基因植株。     

种子特异性启动子（napinB promoter）分离，表达载体构建及转基因植物获得

利用PCR技术从油菜Brassica napus H165基因组DNA中分离了napinB启动子,序列分析表明,扩增片段（nap300)与文献报道的napinB启动子相应区域的同源性为97％,将其与gus连接构建种子特异性表达载体,农杆菌介导转化烟草,PCR,Southern结果显示,nap300已整合到烟草基因组DNA,获得了转基因植株。     

古DNA技术在人类墓葬遗骸研究中的应用及进展

考古工作中得到的生物遗骸由于长期的风化,自然侵蚀等因素的影响,遗骸本身含有的古代生物的DNA的大部分会分解,使得对遗骸中的生物遗传信息研究变得非常困难.可将现代生物工程的PCR技术应用到考古工作中,该技术能够对残存的微量DNA进行大量的生物体外扩增,得到更多的古代生物的遗传信息,提高时遗骸种属鉴定的准确性.通过对出土的人类遗骸中微量DNA的扩增、测试和遗骸间DNA序列的对比,在计算机软件的帮助下与已知的人类DNA序列进行比较,能确定同一墓葬中不同遗骸的亲缘关系和该遗骸群体在整个人类进化体系中的位置.对这一试验过程的一些方法、技术、研究进展和目前仍然面临的一些问题作了介绍.     

一种新的DNA 片段扩增法— 聚合酶链式反应法

随着分子生物学的发展,对特定核若酸片段进行 分离、纯化及扩增已成为基因分子生物学研究的中心 问题。自从197,年Southern转移技术建立以来,这 一领域已经取得很大进展。但已建立的方法在特异性 和灵敏度等方面尚未达到令人满意的水平：同时操作 复杂,这已成为提高研究速度的主要限制因素。用常 规方法对特定DNA片段进行分离,提纯和扩增,不仅 费时费力,并且对微量样品中的单拷贝片段的分离和 扩增尤其显得困难。由Mullis等％L23建立的聚合酶 链式反应法（polymerase chain reaction,简称PCR）有 效地解决了这一问题。运用PCR技术可以使1微微 克样品DNA中存在的仅有一个拷贝的特定核营酸片 段得到大量扩增。与常规方法相比,运用PCR技术 可大大地缩短操作时间及减小劳动强度,因为不再需 要次级克隆及分离、纯化等繁杂的步骤,而只要合成两 个起始引物,将基因组DNA与这两个引物及DNA聚 合酶等所组成的反应体系在三个不同温度的水浴中机 械地操作之后,就可得到两个引物5‘末端之间的大量 的DNA片段。并且不需要进一步纯化,其纯度就足 以满足有关核昔酸片段的分析研究。现在国外一些公 司已推出一种装置,可使PCR反应完全自动地进行。 从PCR技术的出现（Mullis"], Saikit'23, Saikiti41）到 现在只一年多的时间,但这技术已广泛地应用于分子 生物学研究的各个方面。可以预期,PCR技术将极 大地促进基因分子生物学的研究。     

新疆塔吉克族人群线粒体DNA序列多态性研究

目的：研究中国新疆塔吉克族人群线粒体DNA D环区序列遗传多态性,并结合文史资料,对塔吉克族的起源及迁移进行了初步探讨。方法：应用PCR扩增产物直接测序法,对34名塔吉克族无关个体线粒体DNA D一环区高变区Ⅰ进行测序分析。结果：34个个体核苷酸序列与Anderson相应序列比较共发现有47处突变位点,构成22种单倍型塔吉克族线粒体DNA D环高变一区基因差异度为0.9822,偶合概率为0.0466。结论：研究表明新疆塔吉克族与高加索人种遗传关系较近。     

TAIL-PCR技术及其在植物基因中的克隆

热不对称性PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术.该技术利用3个根据已知序列设计的嵌套特异性引物分别和简并引物组合进行PCR反应,选择恰当退火温度对目标片段进行PCR扩增.TAIL-PCR技术作为一种使用技术简单易行,反应高效灵敏,产物特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经在分子生物学研究领域广泛应用.本文从TAIL-PCR技术原理出发,对该技术特异性引物设计、随机引物组合选择、PCR反应条件等关键性问题进行综述,并介绍TAIL-PCR技术在植物基因克隆上的应用现状及发展前景.     

TT型病毒基因组的克隆与进化分析

利用PCR方法从输血传播性病毒 (transfusiontransmittedvirus,TTV)阳性标本中获得不同长度且重叠覆盖TTV基因组的DNA片段。将PCR扩增片段克隆到pT Adv载体中 ,筛选获得阳性克隆。DNA序列测定结果表明所克隆的片段为TTV基因组序列。利用DNA片段中特有的限制性内切酶位点将TTV的DNA片段首尾相连 ,得到近全长的基因组克隆 ,命名为TTV0 2 1。对TTV0 2 1的核酸序列进行分析 ,TTV0 2 1长 3472nt,存在 2个阅读框架ORF1和ORF2 ,分别编码 785和 1 46个氨基酸。将TTV0 2 1与其它已知的TTV基因组全序列进行了同源性比较 ,并进行进化分析。结果表明 ,TTV0 2 1序列与TTV分离株CHN2、BDH1的遗传距离较近 ,而与其它分离株相对较远。     

实现“终极版”核苷酸测序仪的技术要素

20世纪70年代发明的第一代DNA测序技术,尽管测序通量有限,却成功地保证了“人类基因组计划”的实施;世纪之交出现的下一代(第二代) DNA测序技术经历了通量飞跃,为各种精准医学项目的实施提供了保障;目前的第三代技术,尽管通量居二代之后,但读长和单分子测序优势也让其有立足之本;第四代测序技术的基本标志是不经过cDNA (以RNA为模版合成的互补DNA),无PCR扩增,而直接测定单分子RNA序列,以及确定单分子RNA上的修饰核苷酸位点。从技术的角度看,第三、四代技术有一定技术要素共享(比如在单分子水平测定DNA序列),但是就测序对象而言,第四代应该属于“终极版”核苷酸测序仪：可以从单细胞出发,既能测定DNA序列,也可以测定RNA序列,也可以直接确定修饰核苷酸位点。因此,要实现这个“终极版”核苷酸测序仪,就要调动相关核心技术要素,而这些要素毫无疑问地会涉及物理、化学、工程学、生物学、半导体科学、计算机科学等领域的前沿技术,包括纳米科学、单分子光学、单分子拉曼光谱、单分子核磁共振、单分子酶学、人工智能等所谓的“硬科技”。其功能是从单细胞的裂解开始,经微纳结构实现组分分流后,直接导入RNA序列测定单元,定量分析细胞RNA分子的种类、数量、序列和修饰核苷酸位点的存在频率。本文系统介绍了第四代测序仪的可能技术要素,以及应用需求和新研究范式。     

长距离反向PCR技术高效扩增已知DNA片断的侧翼序列

为解决传统反向PCR技术扩增片段短、假阳性多的不足,建立了长距离反向PCR(LD I-PCR)扩增技术:0.5μg DNA/mL的反应体系使DNA酶解片段充分自身环化连接,其产物用25 nt~30 nt的序列特异引物进行长距离PCR。结果表明该方法能特异地扩增出长达16 kb的序列,在已知DNA片段的侧翼序列克隆方面具有高效、简便、特异的优点。     

RecA蛋白介导的三链核酸结构形成及其序列提取

人工合成的单链DNA分子经PCR扩增形成双链DNA分子。将RecA蛋白与生物素标记的寡聚核酸探针序列在ATPγS存在的情况下共同哺育,使RecA蛋白包裹寡聚核酸探针,然后加入含同源序列的上述双链DNA分子经适当环境哺育形成了稳定的局部三链核酸结构。通过加入链亲和素包裹的磁珠吸附生物素化的探针,这样同源双链DNA分子与寡聚核酸探针形成的局部三链核酸结构也被吸附在磁珠上。使用磁分离装置提取这一结构,逐步降低盐离子浓度以洗脱双链DNA分子。将洗脱液中残留的蛋白质去除,经PCR扩增可获得目的DNA序列。同时使用同源探针和非同源探针在其它序列中提取目的DNA序列,结果显示目的DNA序列只被同源探针提取。实验结果显示了这一三链核酸结构形成的序列特异性,并且其稳定性随盐离子浓度降低而下降。提示在这一结构中同源的寡聚核酸单链与双链DNA分子形成了氢键结合,同时提示使用文中描述的方法可以提取特异的序列,用以克隆相应的基因。     

基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法学的建立

目的:大量研究证实线粒体DNA(mtDNA)突变与肿瘤发生及进展密切相关,但使用传统测序方法难以高通量、高精确度的检测mtDNA突变,为此本研究建立了基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法.方法:提取肝癌患者癌、癌旁组织以及外周血细胞总DNA,利用PCR技术对线粒体基因组进行富集并对PCR产物进行平末端、粘性末端连接或对PCR引物进行氨基修饰,构建mtDNA测序文库.经Illumina HiSeq 2000平台测序后利用生物信息学方法与人类mtDNA参考序列进行比对,并进行测序数据分析.结果:通过对不同质量基因组DNA进行评估后,发现三对引物法适用于大部分DNA样本的mtDNA富集.进一步我们发现PCR引物的氨基修饰可显著提高测序数据覆盖均一性,降低测序成本.结论:本研究利用新一代测序技术通过对线粒体DNA富集方法以及测序覆盖度均一性进行优化,建立了一套灵敏、特异、高通量的mtDNA突变检测策略,为mtDNA突变与疾病研究提供了新方法.