小鼠胚胎致密化起始的调控机制

植入前小鼠胚胎的发育事件包括第一次卵裂、胚胎基因组激活、桑椹胚致密、囊胚形成。小鼠受精卵胚胎的致密化发生在8-细胞阶段晚期, 致密过程中, 胚胎卵裂球本身以及卵裂球之间发生了一系列的变化。这些变化包括卵裂球微绒毛以及胞质成分的极性化分布, 卵裂球之间形成特殊的胞间连接。致密化是哺乳动物胚胎发育过程中的第一个细胞分化事件, 即导致了内细胞团以及滋养外胚层的产生。植入后, 内细胞团将发育成为胚体, 滋养外胚层将发育成为胎盘等胚外组织。细胞粘附分子E-cadherin介导的胞间粘附起始了致密化。卵裂球发生粘附所需的组分在致密前已经存在, 但是直至8-细胞阶段晚期连接复合体才表现出明显的粘附活性。敲除E-cadherin基因, 发现母源性的E-cadherin足以介导致密。E-cadherin介导的胞间粘附是细胞粘附的第一步。文章综述了E-cadherin介导胞间粘附的具体过程以及蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)调控该过程的相关 机制。     

SP细胞的研究现状

在干细胞研究中,侧群（side population,SP）表型是指用来表示某些细胞具有的将进入细胞的荧光染料Hoechst33342或诺丹明123排出的特性,将利用该特性分离的细胞称为侧群细胞（side population cell,SP细胞）。众多实验提示SP表型可能是干细胞或前体细胞的筛选标志。然而也有实验指出SP细胞与干细胞存在差异,因此对SP细胞的研究日益深入。本文就SP表型的形成及影响因素,SP细胞与干细胞的一致性及差异性等研究现状作一综述。     

蛋白激酶Cα在小鼠孤雌及四倍体胚胎早期发育过程中的分布和作用

为了观察蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα在昆明白小鼠受精卵、孤雌激活和四倍体胚胎早期发育阶段的亚细胞定位和致密化进程中的表达变化,本实验利用免疫荧光化学染色与激光共聚焦显微镜观察相结合的方法,对受精卵、孤雌激活和四倍体胚胎早期发育阶段PKCα的表达进行了定位观察,并利用Western blot对三组胚胎致密化进程中PKCα的表达进行定量分析.结果显示,PKCα在上述三组胚胎发育的2-细胞期至囊胚期均有表达,虽然不同胚胎PKCα的分布在同一发育阶段存在差异,却表现出在各胚胎期主要分布于卵裂球核染色质内,以及在胚胎致密化开始,PKCα在卵裂球连接处发生重新分布的共同特点.此外,三组胚胎PKCα在致密化进程中的表达呈升高趋势,即致密化后的表达高于敛密化前.结果表明,PKCct对胚胎致密化的调节具有重要作用,其在8-细胞/4-细胞期的重新分布是胚胎进入桑椹胚期的必然事件,是胚胎致密化的前提,同时伴随蛋白表达增多.此外,PKCα在囊胚期发生了植入前的第二次重新分布.PKCα在三组胚胎各发育阶段表达情况各不相同,它对小鼠胚胎发育的影响体现在整个早期发育阶段.PKCα在小鼠受精卵早期发育阶段的两次重新分布可能与在致密化开始时启动的细胞黏附事件存在某种必然联系.     

人体胚胎发育概况与新进展（二）：人胚早期发育

第1—8周是人胚早期发育阶段,又称胚期。在这个时期,受精卵经过分裂,增殖和分化,形成桑椹胚、胚泡,进而分化形成内、中、外三胚层,胚胎变成圆柱形及主要器官系统的雏形。另外,此期的胚胎发育对环境的影响十分敏感,在某些有害因素(如病毒、药物等)的作用下较易发生先天性畸形。第1周卵裂、胚泡形成与植入受精卵从输卵管向子宫方向的运行中,不断进行分裂、增殖的过程称为卵裂,卵裂产生的细胞称卵裂球。第一次卵裂是在受精后的30小时左右发生,以后每10几小时卵裂一次,第3天时形成一个由12—16个卵裂球构成的实心胚,称桑椹胚。桑椹胚继续细胞分裂并由     

小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立及生物学特性鉴定

目的:探讨建立合适的小鼠孤雌胚胎干细胞建系方法。方法:采用氯化锶联合细胞松弛素B激活B6D2F1杂交小鼠卵母细胞,所获得的囊胚与桑椹胚分别用于孤雌胚胎干细胞的建系,观察两者的建系成功率。结果:共建立了12株小鼠孤雌胚胎干细胞系,这些细胞SSEA-1抗原阳性,SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60表面抗原阴性,具有AKP活性,保持正常染色体核型,体内外分化分别形成畸胎瘤和拟胚体。结论:采用囊胚和去透明带的桑葚胚建立孤雌胚胎干细胞系获得成功。该方法为人类纯合子的胚胎干细胞建系提供基础,在自体细胞治疗领域中具有潜在的应用价值。     

胚胎干细胞

第一次卵裂什么是胚胎干细胞?当受精卵分裂发育成囊胚时(受精后5～6天),内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性,可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。早在1970年科学家已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养。而人的胚胎干细胞的体外培养直到最近才获得成功。进一步说,胚胎干细胞是一种高度未分化细胞,能分化出所有组织和器官,包括生殖细胞。研究和利用胚胎干细胞是当前生命科学领域的核心问题之一。     

胚胎干细胞起源与本质的探讨

胚胎干细胞(ESC)建系取材包括桑椹胚的卵裂球、囊胚的内细胞团(ICM)、上胚层细胞和原始生殖细胞(PGCs),甚至从新生鼠睾丸细胞也分离得到ES样细胞.传统观念常常把ESC等同于ICM细胞,也有学者认为ESC更像上胚层细胞,而在已知的基因标记方面,ESC所具有的特征更接近体内早期生殖细胞.不清楚ESC最接近的体内细胞类型与本质,可能是制约许多品系小鼠和大多哺乳类动物建系成功率提高的原因之一.综述了胚胎多能性细胞、早期生殖细胞和ESC的研究进展及相互关系,发现ESC可源于多种细胞类型.目前仍难以确定ESC最接近的体内细胞类型,进一步应通过研究不同体内细胞类型源ESC系间的差异,以弄清ESC本质,为提高ESC建系效率提供理论支持.     

体细胞来源及培养代数对核移植重构胚发育的影响

为探讨体细胞来源及培养代数对核移植重构胚发育的影响,实验采用电融合法将小鼠2—细胞胚胎卵裂球、胚胎干细胞(ES)、胎儿成纤维细胞、耳成纤维细胞、尾尖成纤维细胞、睾丸支持细胞和精原细胞以及不同培养代次的胎儿成纤维细胞进行了核移植。结果显示：2—细胞胚胎卵裂球供核重构胚发育最好,囊胚率为7．4％;ES细胞重构胚虽然发育率低,但仍有囊胚出现,比例为0．7％;胎儿成纤维细胞重构胚最高发育阶段为桑椹胚,比例为0．2％;精原细胞重构胚只能发育到8-细胞阶段,比例为0．3％;其他几类细胞重构胚则仅能发育至4-细胞阶段。不同培养代数的胎儿成纤维细胞重构胚除第3代外都可发育到8-细胞阶段,且发育率差异不显著,但第一代细胞重构胚2-细胞发育率(40．7％)显著低于2、3和4代细胞重构胚。结果表明：不同分化程度的细胞核移植后,重新编程的难易程度是不一样的,分化程度越高则重新编程越难;未调整细胞周期的ES细胞由于多数处于S期,所以重构胚发育率很低;体外培养传代有利于体细胞核移植后重新编程。     

囊胚形成的基因表达与调控

囊胚形成是胚胎早期发育过程中一个重要阶段,涉及几个重要的生理事件,即细胞融合（compaction,亦称致密化作用）、囊胚腔出现、囊胚腔扩张及滋养层和内细胞团的分化。在细胞间连接蛋白的作用下,各种细胞间连接方式逐步建立起来,在合子型基因组表达调控下,促进了最终囊胚的形成。细胞间连接蛋白和细胞粘附相关蛋白参与组建各种细胞间连接,参与细胞融合、囊胚腔形成、滋养层分化和囊腔扩张等过程。通过顶部的紧密连接、侧部的缝隙连接和桥粒,建立起细胞的连接复合体。在人胚胎8－细胞之前,卵裂球细胞界限明显,可能从中间连接方式相互作用;8－细胞期发生致密化作用,通过紧密连接将细胞分成顶部和基部,使得胚胎处于半封闭状态,促进胚胎内部积液,形成囊胚腔。细胞融合的同时也产生缝隙连接。桥粒最初出现在人胚胎达到32－细胞阶段,桥粒连接参与囊胚腔形成以及在囊胚扩张时维持滋养层的稳定性。桥粒由一些跨膜粒蛋白组成,包括参与细胞内粘附的桥粒子和桥粒球以及一些细胞质内蛋白（如desmoplakins,plakoglobin,plakophilin),由细胞内蛋白质形成空斑结构并介导细胞角蛋白丝固定。对植入前牛胚胎的研究表明,只有DcII,DcIII和plako三种桥粒蛋白参与桥粒组建。在鼠囊胚中DcII的表达部位位于滋养外胚层,对于滋养层的形成具有重要的作用。在牛中,直到桑椹胚期可能才出现紧密连接方式。人胚胎发育至囊胚期时,可检测到角蛋白－18基因的活跃表达,作为细胞骨架蛋白的角蛋白－18参与桥粒位点的细胞与细胞间“识别”的建立。缝隙连接蛋白连接子（Connexin43,Cx43)对于维持细胞融合以及之后囊胚的形成是十分必要的。细胞融合和囊胚腔形成还需要一些介导细胞粘附和滋养层细胞分化的分子表达,如整合素家族中的E－钙调素、链接子（caknin)和ZQ（一种细胞质带状咬合紧密连接相关蛋白）。Na/K-ATP酶基因及细胞因子、生长因子等可促进Na^ 浓度梯度变化,使水分进入囊胚内部,形成囊胚腔,并维持囊腔腔扩张状态。调节发育和分化的基因参与胚胎的发育和内细胞团和滋养外胚层细胞的分化,调节胚胎由未分化状态向分化状态过渡。另外,某些细胞因子对内细胞团细胞增殖有影响。在小鼠胚胎培养基中,添加IGF和EGF有利于胚胎从透明带孵出,TGF－α和EGF在小鼠胚胎发育中能分别通过自泌作用和旁分泌作用囊胚腔的扩张膨大。许多基因参与囊胚的发育和分化,如Pem基因调节早期胚胎细胞分化,可调节鼠早期胚胎由未分化状态向分化状态过渡,Oct-4表达与未分化表型有关,在早期胚胎发育中起转录调节作用。植入前胚胎发育基因调节鼠胚植入前卵裂速度的快慢,以及胚胎预后生存能力。植入前因子PIF在受精后妇女的血清中就能检测出来,其特点和功能与囊胚形成的关系仍需进一步研究。Rex-1编码锌指蛋白,可能是一个转录调节因子,它参与滋养层发育以及精子发生,它是研究内细胞团早期细胞命运决定的有用标志物,对于维持胚胎干细胞的未分化状态和全能性有作用,当其表达显著降低时,内细胞团将分化成胚层。总之,多种蛋白、因子参与囊胚形成的表达调控。通过基因调控的研究,将有助于培养液的研制以及通过测定一些标志基因的表达筛选健康的胚胎。     

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

目的　为扩大胚胎来源并获取特定胚龄胚胎 ,建立小鼠冷冻胚胎库。方法　运用超数排卵、体外受精与胚胎培养及胚胎冷冻技术系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律。卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻。结果　 (1)注射hCG后 12～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,4 2～ 4 8h为 2 细胞期 ,4 8～ 6 0h为 4 细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8 细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～ 92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中。 (2 )培养液中添加促性腺激素 (FSH与hCG) ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育。 (3)在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 细胞阻断 ,其 2 细胞胚的发育率达 10 0 % ,8 细胞胚发育率达 5 5 %以上 ;牛、羊上皮细胞培养液上清也能有效克服 2 细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞期胚的发育率显著提高。 (4)以D PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9 3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 4 %。结论　研究为将生物技术应用于小鼠 ,扩大卵子和胚胎来源     

人-牛异种克隆胚构建及其线粒体来源

通过人-牛异种核移植技术获得异种克隆囊胚, 便于在不消耗人类卵母细胞的情况下从异种克隆胚中分离出人类干细胞。通过透明带下注射法将人胎儿成纤维细胞和牛耳成纤维细胞分别注入去核牛卵母细胞中构建异种和同种胚胎, 并比较两者之间的融合率、卵裂率、8-细胞发育率以及囊胚率。并对处于2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚阶段的异种克隆胚的线粒体DNA来源进行检测。结果表明, 异种克隆胚体外各个阶段的发育率均低于同种克隆胚, 尤其是8-细胞到囊胚阶段的发育率, 以及囊胚率都显著低于同种克隆胚(P<0.05)。异种克隆胚在2-细胞到桑椹胚阶段检测到人、牛线粒体DNA共存, 囊胚阶段只检测到牛线粒体DNA。结果表明: 牛卵母细胞可以重编程人胎儿成纤维细胞, 完成异种克隆胚植入前的胚胎发育, 异种克隆胚由于核质相互作用的不谐调, 影响其发育能力, 使其囊胚率显著低于同种克隆胚。牛线粒体DNA存在于植入前异种胚胎发育的各个阶段。异种克隆胚胎用于人类胚胎干细胞分离具有可行性。     

小鼠类胚胎干细胞分离培养及用于制作嵌合体小鼠的实验研究

目的探讨分离小鼠囊胚内细胞群类胚胎干细胞及用于制作嵌合体小鼠的方法及应用价值。方法分离3.5d小鼠囊胚内细胞群的类胚胎干细胞作为供体细胞,通过显微注射方法将分离的类胚胎干细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中,再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中制作嵌合体小鼠。结果分离36枚囊胚的内细胞群类胚胎干细胞,注射256只昆明小鼠囊胚中,移植32只假孕雌鼠子宫中,获产崽2窝,共12只,其中2只获毛色嵌合体小鼠。结论采用该技术分离所获得的类胚胎干细胞作为供体细胞制作嵌合体小鼠获得成功,该方法为ES细胞介导的转基因动物制作增添了一条新的途径,在同种不同品系的动物改良及遗传病基因治疗中有一定的应用价值,尤其是对未能建立ES细胞系的大动物的遗传工程操作具有一定意义。     

小鼠四倍体早期胚胎基因组甲基化模式

利用小鼠抗5-甲基胞嘧啶(5MeC)单克隆抗体检测了体外培养小鼠四倍体早期胚胎的基因组甲基化模式。结果表明: 利用电融合方法制备的小鼠四倍体胚胎在体外培养体系中经历细胞质融合、细胞核融合及细胞继续分裂发育直到囊胚期的过程, 在细胞质融合的时候胚胎卵裂球同体内体外培养二倍体胚胎一样, 呈现高度甲基化状态; 在细胞核开始融合的时候, 甲基化水平急速下降, 在细胞核完全融合的时候甲基化水平达到最低点; 随着胚胎继续分裂, 胚胎甲基化水平逐渐增加, 在桑葚胚期甲基化水平最高; 但是囊胚期四倍体胚胎内细胞团同滋养层细胞甲基化荧光信号没有差别, 这与体内体外培养二倍体囊胚内细胞团细胞甲基化荧光强度高于滋养层细胞甲基化荧光强度不同。因此, 小鼠体外培养四倍体胚胎的甲基化模式是不正常的, 这可能是四倍体小鼠难以发育到妊娠足月的原因之一。这是对小鼠四倍体早期胚胎基因组甲基化模式的首次报道。     

小鼠植入前胚胎GCN5和HDAC1表达模式及体外培养对其表达的影响

为探讨小鼠植入前胚胎组蛋白乙酰化酶GCN5(general control of nucleotide synthesis,GCN5) 和组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetyluse1,HDAC1)的表达模式及常规体外培养对它们表达的影响,应用荧光免疫细胞化学技术,检测了体内和体外培养的小鼠2、4、8细胞期卵裂胚胎、桑葚胚和囊胚GCN5和HDAC1的表达。结果显示,GCN5在体内组各细胞期卵裂胚胎和桑葚胚的细胞浆内均呈高表达,细胞核内未见明显表达,而囊胚细胞的细胞浆和细胞核内均无表达:HDAC1在体内组小鼠2细胞期胚胎中以细胞浆内表达为主,在其他各期胚胎均以细胞核内表达为主．囊胚期内细胞团部分细胞的细胞核内未见HDAC1表达。GCN5在体外组小鼠植入前各期胚胎均不表达,而 HDAC1的表达强度明显低于体内组的。提示体外培养抑制小鼠植入前胚胎GCN5和明显降低 HDAC1的表达,影响胚胎基因的正确性表达。     

山羊（Capra hircus）重构胚与再重构胚早期发育的研究

选择山羊９细胞期到桑椹胚期的正常胚胎或重构胚的卵裂球,或选择胚泡期胚胎的内细胞团细胞作为供核,并以ＬＲＨ注射后２６－２８ｈ的去核成熟卵球作为受体,制备重构胚或再重构胚,琼脂糖包埋,植入山羊输卵管内,体内培养４－６天发育结果表明：不同发育时期（８细胞期至胚泡期）的正常胚胎细胞核或重构胚细胞核中,至少有部分细胞核均保留着发育的全能性;这些细胞核在母系基因表达产物的调控下,实现＝重新编程,启动并完成正常     

小鼠植入前胚胎GCN5和HDAC1表达模式及体外培养对其表达的影响

为探讨小鼠植入前胚胎组蛋白乙酰化酶GCN5（general control of nucleotide synthesis,GCN5）和组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylasel,HDAC1）的表达模式及常规体外培养对它们表达的影响,应用荧光免疫细胞化学技术,检测了体内和体外培养的小鼠2、4、8细胞期卵裂胚胎、桑葚胚和囊胚GCN5和HDAC1的表达。结果显示,GCN5在体内组各细胞期卵裂胚胎和桑葚胚的细胞浆内均呈高表达,细胞核内未见明显表达,而囊胚细胞的细胞浆和细胞核内均无表达：HDACl在体内组小鼠2细胞期胚胎中以细胞浆内表达为主,在其他各期胚胎均以细胞核内表达为主。囊胚期内细胞团部分细胞的细胞核内未见HDAC1表达。GCN5在体外组小鼠植入前各期胚胎均不表达。而HDAC1的表达强度明显低于体内组的。提示体外培养抑制小鼠植入前胚胎GCN5和明显降低HDAC1的表达,影响胚胎基因的正确性表达。     

胚胎干细胞体外分化的研究进展

从一个受精卵发育为完整机体的过程中,具有相同基因的未分化干细胞如何产生形态和 功能各异的许多细胞?这是数十年来生物学家所一直关注的细胞分化问题。随着生命科学研究的发展,现在普遍认为细胞分化是基因差异性表达的结果,完全取决于哪些基因被激活,在什么时间和空间被激活。哺乳动物胚胎体积小,又在子宫内发育,实验研究较困难。在八十年代初,从小鼠早期胚胎的内细胞团(inner cellmass)或桑椹胚分离建立了具发育全能性的胚胎干细胞(embryonic stem cell,简称ES细     

胰岛素对小鼠胚胎印迹基因Igf2/H19甲基化水平和表达的影响

探讨胰岛素对小鼠早期胚胎体外发育影响的分子机理.将小鼠2细胞胚胎培养于KSOM+0.25 μg/ml胰岛素培养基内,发育至桑椹胚和囊胚.提取桑椹胚和囊胚的总RNA和DNA.实时定量PCR分析,实验组桑椹胚Igf2 mRNA表达是对照组的4.7倍,H19表达是对照组的5.7倍;实验组囊胚Igf2 mRNA表达是对照组的1.8倍,而H19表达量是对照组的2.3倍;BSP测序法分析Igf2/H19印迹控制区的甲基化水平,实验组桑椹胚、囊胚的甲基化率分别为7.3%和32.3%,分别比对照组下降86.4%和35.4%.结果显示,胰岛素降低植入前胚胎Igf2/H19印迹控制区DNA甲基化的水平,从而使Igf2和H19基因表达升高.     

山羊(Capra hircus)重构胚与再重构胚早期发育的研究

选择山羊8细胞期到桑椹胚期的正常胚胎或重构胚的卵裂球,或选择胚泡期胚胎的内细胞团细胞作为供核,并以LRH注射后26—28h的去核成熟卵球作为受体,制备重构胚或再重构胚,琼脂糖包埋,植入山羊输卵管内,体内培养4—6天发育结果表明:不同发育时期(8细胞期至胚泡期)的正常胚胎细胞核或重构胚细胞核中,至少有部分细胞核均保留着发育的全能性,这些细胞核在母系基因表达产物的调控下,实现重新编程,启动并完成正常发育的全过程。     

葡萄糖对ICR小鼠胚胎体外发育的影响

研究葡萄糖在小鼠早期胚胎体外发育中的作用。实验1将6—8周龄的ICR雌鼠超数排卵后与公鼠交配,收集1-细胞放入含0(对照组)、0.5、1、3、5、10mmol/L葡萄糖的CZB中培养;实验2将从超排的ICR雌鼠输卵管内收集的1-细胞放入无糖CZB中培养,分别于1细胞、2细胞、4细胞、桑椹胚阶段移入含3.0mmol/L葡萄糖(最适浓度)的CZB中,培养24h后又移回到无糖CZB中(桑椹胚阶段除外)继续培养以及整个胚胎培养过程均在含糖CZB中,对照组胚胎培养全程均在无糖CZB中。每组胚胎于37℃、5%CO2培养箱中培养120h,每24h在倒置显微镜下观察胚胎发育情况,分别计算2-细胞率、4-细胞率、桑椹胚率、囊胚率和孵化率,并进行囊胚细胞计数。结果显示,小鼠胚胎在含糖CZB中与在无糖CZB中4-细胞发育率无差异;含糖CZB中囊胚率显著高于对照组;3.0mmol/L浓度组囊胚细胞数显著高于其余组;2-细胞至4-细胞、4-细胞至桑椹胚前添加葡萄糖囊胚率显著高于对照组,1-细胞至2-细胞、桑椹胚及其以后阶段添加葡萄糖囊胚率与对照组无差异。实验证实,在ICR小鼠胚胎体外培养中加入葡萄糖不会导致2-细胞阻滞;葡萄糖浓度增至10mmol/L对ICR小鼠胚胎无毒性作用;ICR小鼠胚胎体外培养的最适葡萄糖浓度为3.0mmol/L;2-细胞至4-细胞、4-细胞至桑椹胚前添加葡萄糖是必要的。