Egr-1基因沉默对A549细胞放射敏感性的影响

目的:探讨Egr-1基因沉默对人肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响。方法:选用A549细胞株作为研究对象,将其分成A、B、C三组,即空白对照组(只加入RPMI-1640培养)、阴性对照组(加入LV3-NC-sh RNA)、实验组(加入EGR1-homo-2294-sh RNA),采用慢病毒介导的sh RNA干扰技术使实验组细胞Egr-1基因沉默表达。利用荧光显微镜、自动化荧光定量细胞成像分析系统分析sh RNA转染,利用FQ-PCR分析Egr-1表达,再利用细胞克隆形成实验检测细胞放射敏感性参数的差异。结果:慢病毒介导的sh RNA成功转染阴性对照组、实验组细胞;空白对照组与阴性对照组Egr-1表达无差异(P0.05),实验组与空白对照组、阴性对照组比较Egr-1均受到明显抑制(P0.05);克隆形成实验中细胞放射敏感性参数D0、SF2实验组细胞与空白对照组、阴性对照组比较均存在明显差异(P0.05)。结论:Egr-1基因沉默使A549细胞放射敏感性降低,Egr-1表达可能与肿瘤细胞对放射的敏感性有关。     

PER1对人肝癌细胞BEL-7402辐射敏感性的影响

本文通过X射线照射SMMC-7721、BEL-7402和HepG2三种肝癌细胞后,以克隆形成试验检测其存活分数,结果显示在梯度剂量X射线0、2、4、6、8、10 Gy照射下SMMC-7721、BEL-7402、HepG2三种细胞克隆存活分数逐渐下降,其中SMMC-7721在三种肝癌细胞系中对辐射最敏感,BEL-7402辐射抗性在三种肝癌细胞系中最高。Western blot检测发现PER1在SMMC-7721中的表达水平明显显著高于BEL-7402和HepG2(P<0.05)。过表达PER1蛋白以后,BEL-7402接受5 Gy X射线照射后凋亡明显增多,同时,western blot和RT-qPCR试验结果发现,X射线照射过表达PER1的BEL-7402细胞,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低,凋亡执行蛋白Caspase-3断裂明显增多。研究结果表明PER1蛋白的高水平表达可以促进X射线诱导的凋亡,增强肝癌细胞的辐射敏感性。     

重组人凋亡素2 配体对放射线诱导肺腺癌A549 细胞凋亡作用的研究

目的:研究凋亡素2配体(Apo-2 ligand,Apo-2L),或称肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing lig-and,TRAIL)在体外对人肺腺癌A549细胞系的放射增敏作用的研究。方法:MTT法检测Apo-2L单药或与放射线联合对腺癌A549细胞的抑制率,将细胞分为4组,对照组、Apo-2L组、Apo-2L+放射照射组、单纯照射组,200ng/ml、286 ng/ml的Apo-2L作用24小时后给予放射照射,照射剂量分别为:(1Gy、1.4 Gy、1.8Gy、2 Gy、3 Gy),然后进行流式细胞仪分析照射后24h各组细胞凋亡率变化。结果:MTT结果显示,腺癌A549细胞的抑制率与Apo-2L的浓度成正相关,凋亡素2配体作用24h后IC50为286ng/ml.流式细胞仪分析显示286ng/ml的Apo-2L处理24h后,细胞凋亡率从(6.68)%上升至(50)%,照射后24h Apo-2L+照射组凋亡率明显升高,为72.790%,对照组0.1185%,Apo-2L组50%,单纯照射组51.5067%。结论:Apo-2L在体外对腺癌A549细胞有抑制增殖和促进凋亡作用,并且Apo-2L联合放射线可以明显提高腺癌A549细胞的凋亡率。     

曲古霉素A增强肺癌细胞对放射线敏感性及机制

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A（trichostatin A,TSA）增强人非小细胞肺癌（NscLc）A549对γ-射线敏感性作用及机制。方法：以TSA（0．51zM）预处理细胞18h,再以5Gyγ-射线照射细胞,24h后采用MTT法检测细胞存活率,AnnexinV—PI染色检测细胞凋亡,Westernblot法检测胞浆中和线粒体促凋亡蛋白Bax的表达,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位变化。结果-5Gyγ-射线照射可轻度降低细胞存活率,仅有少量细胞发生凋亡,以TSA预处理再以γ-射线处理细胞,细胞存活率显著下降,凋亡细胞明显增多,伴有线粒体膜电位下降,以及Bax蛋白的激活,表现在线粒体Bax表达较单纯照射组显著增高。结论：TSA通过促进Bax蛋白的活化激活线粒体凋亡途径,增强增强A549细胞对γ-射线的敏感性。     

澳洲茄边碱通过Caspase3蛋白诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡作用

运用中药龙葵提取物澳洲茄边碱处理人肺腺癌A549细胞,研究其对A549细胞的抑制及凋亡作用,探讨澳洲茄边碱对肺腺癌的作用机制。通过细胞增殖抑制实验检测不同浓度澳洲茄边碱对A549细胞增殖的影响,采用蛋白印迹法(Western blot)检测凋亡蛋白Caspase3的表达水平,采用流式细胞术测定处理后A549细胞的凋亡水平及细胞周期变化。结果显示,不同浓度澳洲茄边碱均能抑制A549的增殖,呈浓度效应;用不同浓度澳洲茄边碱处理A549细胞24h后,Western blot结果显示,随药物浓度增大,凋亡蛋白Caspase3水解程度增高,对A549凋亡作用明显增强;流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示,20μmol·L-1澳洲茄边碱处理A549细胞后,细胞发生明显凋亡,其中早期凋亡细胞比例为25.35%,晚期凋亡细胞比例为11.47%;流式细胞术检测细胞周期的结果显示,20μmol·L-1澳洲茄边碱处理A549细胞后,细胞周期阻滞于G2/M期。本研究结果表明,澳洲茄边碱通过激活细胞凋亡通路中的Caspase3蛋白触发细胞凋亡,同时将A549细胞阻滞在细胞周期的G2/M期,抑制人肺腺癌细胞A549的生长。     

放射诱导调控腺病毒介导gfp报告基因在肿瘤细胞内的表达

为建立放射诱导基因表达调控系统并用于肿瘤的基因治疗,利用PCR技术克隆出放射诱导基因Egr-1基因启动子,经测序证实后与报告基因gfp连接,并利用新型、高效的细菌内同源重组腺病毒载体制备方法制备出重组腺病毒AdEgr-GFP。感染腺病毒的肿瘤细胞给予不同剂量的γ射线照射,体外采用FACS方法检测GFP的表达发现,照射可明显提高GFP表达,并呈剂量依赖性,Western印迹检测也显示类似的结果,为进行体内实验,瘤内注射AdEgr-GFP腺病毒后48h,肿瘤局部接受不同剂量的γ射线照射,8h后制备肿瘤组织标本用于分析GFP的表达。肿组织图像分析结果显示,γ射线照射可显著提高肿瘤组织中GFP的表达,并呈剂量依赖性,结果说明,放射经Egr-1启动子可有效调控腺病毒介导gfp基因的肿瘤细胞内表达。     

曲古霉素A增强肺癌细胞对放射线敏感性及机制

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(trichostatin A,TSA)增强人非小细胞肺癌(NSCLC)A549对γ-射线敏感性作用及机制。方法:以TSA(0.5μM)预处理细胞18h,再以5Gyγ-射线照射细胞,24h后采用MTT法检测细胞存活率,AnnexinV-PI染色检测细胞凋亡,Westemblot法检测胞浆中和线粒体促凋亡蛋白Bax的表达,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位变化。结果:5Gyγ-射线照射可轻度降低细胞存活率,仅有少量细胞发生凋亡,以TSA预处理再以γ-射线处理细胞,细胞存活率显著下降,凋亡细胞明显增多,伴有线粒体膜电位下降,以及Bax蛋白的激活,表现在线粒体Bax表达较单纯照射组显著增高。结论:TSA通过促进Bax蛋白的活化激活线粒体凋亡途径,增强增强A549细胞对y-射线的敏感性。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及其诱导肺腺癌细胞A549凋亡的研究

通过RT-PCR的方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并构建了真核表达载体pCMV-Myc/NS1。将此真核表达质粒转染肺腺癌细胞A549,48 h后,经Western印迹检测,NS1基因能在细胞中正确表达。经荧光显微镜、透射电镜观察和流式细胞仪检测,发现该株流感病毒的NS1蛋白可诱导肺腺癌细胞A549凋亡。     

EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞凋亡及CUGBP1蛋白表达的影响

目的：研究表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）对炎性刺激的人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及与CUGBP1表达的关系。方法：MTT法检测EGCG和LPS刺激A549细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞内CUGBP1蛋白的表达。结果：与对照组相比,LPS体外显著促进A549细胞增殖,其胞核胞质内CUGBP1表达明显增强（P〈0.01）。加入EGCG可拮抗LPS促A549细胞增殖的作用,促进其凋亡,明显抑制LPS刺激的A549细胞内CUGBP1的表达（P〈0.01）。CUGBP1蛋白定量分析可知EGCG和LPS共同孵育A549细胞4h、24h时,细胞中的CUGBP1蛋白表达量较单纯LPS作用时降低。但EGCG和LPS共同孵育A549细胞24h,A549细胞中胞核CUGBP1蛋白表达量（1210.565±3.46）较4h时胞核CUGBP1蛋白表达量（67.344±3.68）高,差异有统计学意义（t=927.164,P〈0.001）。结论：EGCG可能通过干扰CUGBP1基因的表达抑制炎症刺激人肺腺癌细胞A549的增殖,促进其凋亡。     

TSA对非小细胞肺癌A549细胞放疗增敏性的研究

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDIs)trichostatinA(TSA)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞放疗敏感性的影响.方法:以5Gy γ-射线照射细胞,或同时以TSA处理细胞.采用MTT法检测细胞存活率,Armexin V-PI染色检测细胞凋亡,流式细胞仪检测caspase-3活性.结果:SGy γ-射线可轻度降低细胞存活率,仅有少量细胞发生凋亡,但同时以TSA和γ-射线处理细胞,细胞存活率明显下降,凋亡细胞显著增多,且明显提高活化的caspase-3水平.结论:TSA通过促进caspase-3激活增强A549细胞对γ-射线的敏感性.     

MMP-7基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达与鉴定

目的：构建MMP-7基因真核重组质粒,检测并鉴定MMP-7在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法：提取宫颈癌组织总RNA,通过基因克隆构建MMP-7基因真核表达重组质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7,酶切、PCR及基因测序鉴定,用阳离子脂质体介导采用基因转染技术转染人宫颈癌Hela细胞,RT-PCR检测外源基因的表达、间接免疫荧光法检测对表达产物进行鉴定。结果：成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7并转染了人宫颈癌Hela细胞,通过RT-PCR可以检测到MMP-7 mRNA在Hela细胞中的表达,经间接免疫荧光反应可检测到明显的阳性反应,而转染空载体组表达阴性。结论：构建的重组质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7能在Hela细胞中表达,为该蛋白在人子宫癌后续的功能研究奠定了基础。     

SIRT1在宫颈癌细胞耐药中的作用及其机制研究

摘要目的：探讨沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1（silentmatingtypeinformationregulation2homologyl,SIRTl）在宫颈癌化疗耐药中的作用及其机制。方法：体外培养人宫颈癌Hela细胞系和宫颈癌Hela／MMC耐药细胞亚系,westernblotting检测MMC对Hela和Hela／MMC细胞内SIRTl蛋白表达的影响;MTT法检测MMC及Nicotinamide对Hela和Hela／MMC细胞增殖的影响;AnnexinV-PI试验检测Hela／MMC细胞凋亡的亡的情况;RT—PCR方法检测耐药相关蛋白P—gP的mRNA表达情况。结果：正常情况下,Hela／MMC细胞中SIRTl的表达显著高于Hela细胞（P〈0．05）,MMC处理的Hela／MMC细胞中SIRTl的表达显著高于未经MMC处理（P〈0．05）。Nicotinamide对Hela和Hela／MMC细胞具有相似的生长抑制作用,Nicotinamide可使MMC诱导的Hela／MMC细胞凋亡增加,同时降低细胞内P-gP的mRNA表达（P〈0．05）。结论：SIRTl表达下调能显著减轻Hela／MMC细胞对MMC的耐药性,其作用可能与P—gp有关。     

Varp蛋白影响人宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的研究

目的：探讨Varp蛋白对人宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响。方法：构建稳定表达Varp蛋白的Hela细胞株,通过氚标胸腺嘧啶核苷酸（3H—TdR）掺入法及碘化丙啶（PI）染色流式细胞术检测Varp蛋白对Hela细胞增殖、凋亡等方面的影响。结果：稳定表达Varp蛋白的Hela细胞相对于对照细胞,其增殖明显下降,而凋亡明显增加。结论：Varp蛋白在Hela细胞中稳定过表达能够增加细胞凋亡,抑制细胞增殖。     

顺铂诱导入宫颈癌细胞系P27表达及其超微弱发光测定的意义

目的：探讨化疗药物对肿瘤增殖活性的影响。方法：选择人宫颈癌细胞系Hela分为两组,分别采用MTT比色法分析测定顺铂处理Hela细胞的浓度;免疫组化SP法分别检测Hela细胞中P27蛋白表达;流式细胞仪分析加药前后细胞周期变化及凋亡情况;用IFFM-D型流动式化学发光仪检测细胞的超弱发光强度。结果：顺铂处理Hela细胞48h的IC50值为3mg／L,当DDP浓度在3mg／L以下时,对Hela细胞无明显毒性作用,超过此浓度时,其毒性呈剂量效应关系（P〈0．001）;流式细胞仪分析细胞周期可见与Hela细胞相比较,Hela＋DDP细胞的G2期细胞数增多,而Gl、S期的细胞数明显减少（P〈0．01）;从细胞凋亡检测显示Hela与Hela＋DDP相比,细胞凋亡率在不同时间点明显升高,在24h、48h、72h结果分别为（11．4±5．8、21．8±7．9、32．5±11．6）％。免疫组化结果显示Hela＋DDP与Hela细胞相比细胞膜上P27蛋白高表达;在10—4mol／L鲁米诺及0.3％的双氧水（H202）条件下Hela细胞超弱发光强度高于用Hela＋DDP细胞（P〈0．001）。结论：超弱发光能够快速、准确、有效地反映肿瘤细胞氧化代谢特点和增殖活动,也可用于筛选敏感的化疗药物。     

靶向白介素-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系的构建

目的：构建针对IL-1α基因的shRNA表达载体,筛选能够抑制Hela229细胞内源性IL-1α表达的shRNA,建立无内源性IL-1d表达的Hela229稳定细胞系.方法：根据shRNA的设计原则,以IL-1 αcDNA oligo为模板设计一段21 bp核苷酸目标序列,构建成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制IL-1α基因的重组shRNA质粒,转染Hela229细胞,经G418筛选后获得单克隆稳定细胞株,用ELISA方法在蛋白水平上检测IL-1α基因的沉默效果.结果：经酶切鉴定和测序分析确定IL-1 α-shRNA重组质粒构建正确,ELISA筛选出能够显著抑制内源性IL-1α表达的shRNA,获得沉默内源性IL-1 α表达的单克隆稳定的Hela229细胞株.结论：靶向IL-1α基因的重组shRNA表达质粒可显著抑制Hela229细胞内源性IL-1α的表达,成功构建靶向IL-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系.     

Ghrelin抑制H202诱导的肺泡上皮A549细胞中IL-8的产生

目的：通过细胞培养的方法,初步研究了生长激素释放肽Ghrelin在氧化应激相关的肺泡上皮细胞炎症反应中的作用。方法：首先是用双氧水（H202）刺激A549细胞建立肺泡上皮细胞炎症反应模型,分别加入不同浓度的Ghrelin及普通培养基培养A549细胞。用酶联免疫吸附技术（ELISA）从蛋白水平检测上清液中IL-8的含量,采用逆转录聚合酶链反应技术（RT—PCR）检测炎性细胞因子IL．8mRNA的表达。结果：H2O2可以使A549细胞IL-8蛋白的释放及IL-8mRNA的表达明显升高（P〈0．05）,而用Gllrelin干预后IL．8的释放及IL-8mRNA的表达被抑制,明显低于单纯H2O2刺激的模型组（P〈0．05）,且随着浓度的增加Ghrelin的这种抑制作用逐渐增强。结论：分别从蛋白水平和基因水平证明了Ghrelin能够抑制H202诱导的肺泡上皮A549细胞中IL-8的产生,由此推测Ghrelin可能能够抑制以COPD、支气管哮喘为代表的氧化应激相关的肺部炎症反应。