小鼠脑脊髓炎病毒标准血清制备及间接ELISA检测方法的应用

目的制备小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）标准血清,建立ELISA检测方法,实现一种病毒多种检测方法的比对研究。方法用TMEV感染3周龄SPF级BALB／c小鼠,制备免疫用抗原。分别在0、7、14d以腹腔注射的方式免疫SPF级6-8周龄BALB／c小鼠,免疫血清用IFA、IEA法进行鉴定;TMEV感染BHK-21细胞,制备EHSA抗原,确定酶结合物、抗原和标准阳性血清的最佳工作浓度,建立TMEVEHSA检测方法,进行敏感性、特异性、重复性和稳定性实验。结果制备TMEV免疫血清,以IFA、IEA测定血清效价分别为1：640和1：320,与痘苗病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒、仙台病毒和呼肠孤病毒-Ⅲ型均无交叉反应;建立了ELISA检测方法,确立了各种试剂的最佳工作浓度,其中酶结合物最佳工作浓度为1：10000,抗原为2.5μg／mL,阳性参考血清为1：200;EHSA检测灵敏度为1：3200。板内特异抗原、正常抗原平均变异系数为4.67％和5.7％,板间为4.39％和7.61％。稳定性实验相对偏差均小于20％。结论本研究制备的TMEV免疫血清可作为血清学检测方法中的标准质控血清;建立的ELISA方法重复性、稳定性好,敏感性和特异性强,可用于小鼠脑脊髓炎病毒血清抗体检测。     

小鼠仙台病毒标准化血清的制备及鉴定

目的制备标准化抗小鼠仙台病毒（Sendai Virus,SV）免疫血清,为清洁级及SPF级实验小鼠质量检测提供批量、稳定、敏感的质控血清。方法使用动物来源的仙台病毒（sv）感染BALB／c小鼠,获得高效价免疫血清,经IFA、IEA、ELISA等方法检测血清效价。结果制备多量抗SV血清,经多种方法检定,IFA效价达1：640,IEA效价达1：320,ELISA效价达1：102400～1：204800。结论本研究中制备的sV抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为检测实验小鼠中sv病原的标准化质控血清。     

小鼠仙台病毒ELISA抗体检测规范化试剂盒的研制与应用

目的按照实验动物国家标准和农业部对于兽医诊断制品的要求研制小鼠仙台病毒抗体检测试剂盒,并在临床检测中分析其适用性。方法建立仙台病毒的种子批和BHK-21细胞的细胞库;标化仙台病毒生产工艺、抗原蛋白纯化工艺;优化ELISA反应板体系;标化质控血清。使用规范化的ELISA试剂盒对我单位672份送检血清样品进行检测,使用IFA和Western blot方法进行复检。结果病毒的种子批检验表明在-80℃保存半年以上毒力稳定;病毒生产和抗原纯化工艺的标准化提高了抗原生产的稳定性;对照体系的设定降低了环境等变量对于结果判定的影响。在对临床样本的检测过程中发现3种方法的灵敏度ELISA高于Western blot高于IFA。结论规范化的小鼠仙台病毒ELISA抗体检测试剂盒能对小鼠仙台病毒感染状况作出准确判断,具有一定的稳定性和结果可重复性。     

大鼠仙台病毒ELISA、间接免疫荧光和免疫印迹三种检测方法比较

目的比较ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）、IFA（immuno-fluorescence assay）和WB（Western blot）三种方法在大鼠仙台病毒血清学检测中的差异。方法仙台病毒蛋白抗原经凝胶电泳分离转移后用于血清学检测的WB方法;使用IFA、ELISA方法对20份无菌大鼠、227份SPF大鼠以及63份清洁级大鼠送检血清样品进行检测,阳性及可疑样品用WB方法进行了验证。结果 20份无菌大鼠血清样品被3种方法检测为仙台病毒抗体阴性;SPF级大鼠样品被IFA方法判定为阴性,1.32%（3/227）被ELISA方法判定为阳性,其中有2/3被WB确认为阳性;ELISA、IFA和WB在清洁级大鼠样品中检出仙台病毒的阳性率分别为为18.12%、11.34%和15.87%。结论三种检测方法灵敏度从高到低依次为ELISA、WB和IFA。WB方法可作为IFA和ELISA难以确定结果的替代方法。     

小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型标准化血清制备及ELISA检测方法的建立

目的制备标准化小鼠呼肠孤病毒III型（reovirus 3,Reo-3）免疫血清,建立小鼠Reo-3抗体ELISA检测方法。方法使用动物来源的Reo-3病毒感染BALB/c小鼠,获得高效价免疫血清;以BHK-21细胞制备Reo-3病毒抗原,同时制备做正常对照抗原。滴定抗原和标准化小鼠Reo-3血清的最佳工作浓度,进行特异性、敏感性、重复性、稳定性等实验。结果制备18 mL抗Reo-3血清,经检测,IFA效价达1∶640,IEA效价达1∶160;Reo-3抗原和标准化小鼠Reo-3免疫血清最佳工作浓度分别为5μg/mL和1∶2400;该ELISA检测体系Reo-3特异抗原批内变异系数为3.8%,批间变异系数为4.0%;检测灵敏度〉1∶4400;与仙台病毒（SV）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠腺病毒（Mad）、小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）、小鼠多瘤病毒（POLY）均无交叉反应。经37℃破坏性试验,2 d稳定性试验相对偏差〈27%。结论本研究制备的Reo-3抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为检测实验小鼠Reo-3病原的标准化质控血清。本研究建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。该体系可用于大、小鼠等实验动物Reo-3抗体的检测。     

用固相放射免疫方法分析流行性乙型脑炎病毒抗原

用固相放射免疫方法对3株流行性乙型脑炎病毒(JEV)进行了抗原分析,其中日本分离的2株(中山予研株,Mie 44-1株),中国分离的1株(A_2株)。为了纯化抗原,先将3株病毒的小鼠免疫血清分别加入到聚脂纤维柱,进行免疫亲合层析,对照抗原同样处理。固相放射免疫测定是将纯化病毒抗原与对照抗原先用超声波(10kc30秒)处理,使之均质化。铁珠(直径为4.2mm)计数后,放入4单位抗原悬液中,4℃下作用60分钟,然后将抗原包被的铁珠加入稀释的小鼠抗血清中,4℃下作用60分钟,用磁性     

六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白抗原性初步研究

初步研究六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白(Nucleocapsid protein,NP)抗原的抗原性,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据。利用原核表达系统表达纯化六种致病性白蛉病毒核蛋白,并分别免疫新西兰白兔。通过间接ELISA方法及Western-blotting方法对所获得的兔免疫血清进行交叉反应检测,确定其抗体ELISA滴度。此外,分别用上述六种致病性白蛉病毒NP抗原包被ELISA反应板并对发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)病人血清进行间接ELISA检测,确定其血清学交叉反应及IgG抗体滴度。通过原核表达系统表达并纯化的六种白蛉病毒NP抗原浓度及纯度均达到免疫和检测要求。ELISA及Western-blotting检测结果显示六种病毒NP抗原兔免疫血清中的每种血清与其余五种病毒NP抗原可能存在血清学交叉反应。SFTSV病人血清与除SFTSV-NP以外的五种NP抗原亦可能存在部分交叉反应。本研究初步评价了原核表达的六种致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性和免疫反应性,为相应诊断试剂的研制奠定了基础。     

新型布尼亚病毒抗体检测方法的建立及初步应用

目的:建立新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法。方法:用基因工程重组表达的新型布尼亚病毒NP抗原包被酶联板,建立间接ELISA法检测新型布尼亚病毒IgG抗体,并进行特异性和灵敏度评价,健康人群中检测结果计算临界值(均值+3标准差)。检测70例发热伴血小板减少综合征患者恢复血清和69份健康人血清样品。结果:在70份患者血清样品中,检测出新型布尼亚病毒IgG抗体阳性51例,阳性率为72.14%(51/70);69份健康人血清样品中,检测出1份阳性,特异性为98.6%(1/69)。结论:建立的新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法特异性强、灵敏度高,可用于新型布尼亚病毒感染的检测及流行病学调查。     

猴B病毒抗体ELISA检测方法的建立和应用研究

目的　建立猴B病毒抗体ELISA检测方法。方法　采用方阵滴定法 ,比较不同血清稀释度、3种酶结合物、2种抗原对检测结果的影响 ,与国外同类参比实验室进行检测结果的比较 ,确定ELISA法的最佳实验条件。结果　HSV抗原包被浓度 10 μg ml,抗人IgG HRP为 1∶2 0 0 0时 ;或B病毒抗原包被浓度 10 μg ml,抗人IgG HRP为1∶4 0 0 0时 ,阴性血清和阳性血清的A值差距最大。与国外B病毒检测专业实验室的检测结果符合率分别为98 0 2 %和 97 5 2 %。结论　建立了猴B病毒抗体的ELISA检测方法 ,提高了检测方法的准确性。     

猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA方法的建立

以猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA建立为目的,以猪细小病毒基因组DNA为模板,扩增获得PPVNS1主要抗原表位基因,将其插入到真核表达载体pPICZα-A中,获得重组质粒pPICZα-A-NS1。电转化后将重组毕赤酵母菌株诱导表达,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot实验表明表达产物具有良好的反应原性。将纯化后的重组蛋白包被酶标板,经棋盘法优化,初步建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为1.9μg/mL,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判断标准定为OD待检血清>0.4且OD待检血清/OD标准阴性值>2.0。用该方法对猪血清样品进行检测,结果显示本方法与HI试验的符合率达91.2%,与国外同类试剂盒的符合率为92.1%,该间接ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于猪细小病毒病感染抗体的检测。     

丙型肝炎病毒抗体化学发光免疫检测方法的建立及其临床应用简

目的：建立丙型肝炎病毒（rmv）抗体化学发光免疫检测方法,并分析其临床应用价值。方法：应用基因工程重组的HCV抗原包被微孔板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为二抗,并结合鲁米诺化学发光底物系统,建立HCV抗体化学发光免疫检测方法;应用HCV抗体诊断试剂国家参考品分析所建立方法的特异性、灵敏度、稳定性和精密性,并-9北京万泰公司的ELISA试剂盒同时检测临床血清样本350份,比较检测结果。结果：检测结果符合国家参考品质量标准。批内变异系数5．1％。6．6％,批间变异系数9-5％;试剂盒置37℃考核3d,其稳定性良好;与万泰公司的ELISA检测结果对照,阳性符合率分别为99．0％,阴性符合率分别为100％,总符合率为99．4％;Kappa值为0．986,一致性强度最强。结论：建立了特异、敏感和稳定的HCV抗体化学发光免疫检测方法,适用于HCV感染的批量筛查,具有较大的临床应用价值。     

两种方法对上海及周边地区实验大小鼠螺杆菌携带情况的调查

目的了解上海及周边地区实验小鼠、大鼠螺杆菌携带情况,为我国实验动物等级及监测标准的制定提供参考和依据。方法PCR法共检测了352只小鼠（清洁级101只,SPF级251只）,101只大鼠（清洁级69只,SPF级32只）;ELISA法共检测了88只小鼠（清洁级26只,SPF级62只）,165只大鼠（清洁级84只,SPF级81只）;并对其中88只小鼠、101只大鼠的PCR和ELISA法阳性检测率进行比较。结果PCR法检测小鼠平均阳性率为35．8％（126／352）,清洁级阳性率为51．5％（52／101）,SPF级阳性率为29．5％（74／251）;大鼠平均阳性率为70．3％（71／101）,清洁级阳性率为69．6％（48／69）,SPF级阳性率为71．9％（23／32）;ELISA法检测小鼠平均阳性率为15．9％（14／88）,清洁级阳性率为19．2％（5／26）,SPF级阳性率为14．5％（9／62）;大鼠平均阳性率为52．7％（87／165）,清洁级53．6％（45／84）,SPF级51．9％（42／81）;88只小鼠PCR法阳性检测率为72．7％（64／88）,ELISA法阳性检测率为15．9％（14／88）;101只大鼠PCR法阳性检测率为70．3％（71／101）,ELISA法阳性检测率为49．5％（50／101）。结论上海及周边地区实验大鼠、小鼠中皆存在着不同程度的螺杆菌感染,两种方法阳性检出率比较结果表明回盲部内容物PCR法较检测血清中抗螺杆菌抗体ELISA法更为敏感。     

Detection of antibodies to Sendai virus in mouse sera by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for diagnosis of Sendai virus infection in mice was evaluated. A large-scale survey of infected mice showed that ELISA is approximately 100 times more sensitive than the hemagglutination-inhibition or complement-fixation test. Although a few SPF mice showed false-positive reactions at a serum dilution of 1:40, further dilution to 1:80 eliminated the non-specific reaction. It was shown that ELISA is a highly satisfactory method for examination of Sendai virus infection in mice.     

五种国产与进口小鼠病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较研究

目的评价国产小鼠病毒抗体ELISA检测试剂盒。方法选择国产与进口小鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、肝炎病毒（MHV）、仙台病毒（SV）、腺病毒（MAV）、细小病毒（MPV）ELISA抗体检测试剂盒,进行敏感性、特异性、精密性、稳定性、可信度试验比较。结果国产与进口试剂盒：同种试剂盒之间灵敏度相差最低为2倍,差异显著（P〈0.05）,最高为16倍,差异极显著（P〈0.01）;特异性试验显示每种试剂盒,与其他4种病毒均无交叉反应;精密性试验显示5种试剂盒批内平均变异系数均小于10%;稳定性试验显示5种试剂盒相对偏差均小于25%;分别选择已知36份小鼠血清进行检测,国产和进口LCMV、MHV、SV、MPV符合率均为100%;国产MAV符合率为86.1%,进口MAV符合率均为100%,二者之间差异极显著（P〈0.01）。结论除国产MAV试剂盒敏感性、可信度低于进口外,国产LCMV、MHV、SV、MPV试剂盒与进口同种试剂盒相比,在敏感性、特异性、精密性、稳定性和可信度方面均良好。     

HBV Pre-S1与DNA及其他血清学标志物的相关性研究

目的研究乙型肝炎病毒血清前S1抗原、HBV-DNA与其他乙型肝炎血清标志物HBs-Ag、HBeAg的相关性。方法采用实时聚合酶链反应(Real-Time PCR)技术检测血清中HBV-DNA的含量,用酶联免疫法(ELISA)检测PreS1Ag、HBsAg和HBeAg。采用SPSS 13.0统计软件进行分析,成组设计资料,率比较采用配对的χ2检验,结果的关联性采用独立性的χ2检验。结果以HBV-DNA1.000E+03Copy/ml为阴性组;HBV-DNA≥1.000E+03Copy/ml为阳性组。600例HBsAg阳性的乙型肝炎患者中241例HBV-DNA阳性,283例Pre-S1阳性。其中241例HBV-DNA阳性患者中,Pre-S1阳性222例,阳性率为92.12%。显著高于HBV-DNA阴性组的Pre-S1阳性率(16.99%)。经配对的差异性检验P=0.000(确切概率)。经独立性检验,χ2=326.573,P=0.000。241例HBsAg、HBV-DNA阳性组,HBeAg阳性191例,Pre-S1阳性222例,其中191例HBeAg阳性患者中,Pre-S1Ag阳性185例,阳性率为96.86%。显著高于HBeAg阴性组的Pre-S1Ag阳性率(61.67%)。经配对的差异性检验P=0.000(确切概率)。经独立性检验,χ2=28.511,P=0.000。结论 Pre-S1Ag与HBV-DNA阳性高度相关,有好的一致性和互补性,较HBeAg更敏感。可作为乙肝病毒存在和复制的可靠标志,是反映HBV是否具有传染性的观察指标。     

乙型脑炎病毒（JEV）ELISA检测方法的建立

目的建立猪乙型脑炎病毒（JEV）抗体ELISA检测方法。方法培养BHK21细胞,接种JEV病毒,制备BHK21正常抗原和JEV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0.2μg/mL、10μg/mL和1∶20000;正常、特异抗原批内变异系数分别为8.3%和6.4%,批间平均变异系数分别为9.7%和11.5%;检测灵敏度为1∶1280;与猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于猪JEV抗体的检测。