野生罂粟RNAi表达载体的构建及遗传转化

通过PCR方法从质粒pGEM-bc中克隆野生罂粟BBE-COR融合基因片段约760 bp,以pHANNIBAL和植物表达载体pCAMBIA3300为基础,将克隆到的BBE-COR融合基因正向和反向片段分别插入pdk内含子的两边,经酶切、PCR鉴定及序列分析表明,特异性RNAi表达载体p3300-pHR构建成功.采用直接转化法,将重组子导入根癌农杆茵AGL1中.以野生罂粟茎尖生长点为转化受体,用农杆茵介导法将目的基因转入野生罂粟中.经卡那霉素和除草剂筛选后,共获得53株转基因植株,PCR检测后,其中14株表现阳性,可初步确定目的基因已经整合到野生罂粟基因组中.     

野生罂粟COR、BBE基因片段融合及其RNAi载体构建

可待因酮还原酶(COR)与小檗碱桥酶(BBE)是吗啡合成代谢途径的关键酶,其活性大小直接影响着吗啡合成途径中生物碱的代谢合成。采用RT-PCR从罂粟幼叶克隆出COR和BBE基因全序列,同源性比较结果显示,它们与GenBank上已报道的COR和BBE基因高度同源。利用blast及分子生物学软件DNAStar对COR和BBE基因的cDNA序列同源性进行分析比较,分别从各基因中筛选和克隆了一段同源性极低、约400～500 bp的片段;并应用重叠PCR法将其拼接成744 bp的融合基因BC,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有“正向BC融合片段- pdk内含子-反向BC融合片段”的ihRNAi植物表达载体,通过转化野生罂粟,初步研究了以COR和BBE基因为靶标的RNAi对内源吗啡合成的抑制效果,为进一步培育低吗啡高蒂巴因的罂粟种质提供了依据。     

亚麻4CL基因克隆及RNAi遗传转化

该实验以前期克隆的亚麻4CL基因片段为靶序列,利用RACE方法克隆其全长cDNA序列(1 957bp),GenBank登录号为KC832864,该序列含有1 650bp完整的开放阅读框。系统进化树分析表明,亚麻4CL基因与盐芥4CL基因亲缘关系较近,而与禾本科的水稻(Oryza sativa)等亲缘关系最远。其编码蛋白预测分析结果显示,亚麻4CL基因由549个氨基酸组成,相对分子量为60kD,等电点为5.3,蛋白质二级结构以无规则卷曲比例最多,其次是α-螺旋。以亚麻4CL基因编码区413bp靶标序列作为干扰区段,扩增其正反向基因片段,构建植物干扰表达载体p1301M-4CL。通过农杆菌介导转入亚麻,DNA及RNA水平上分子检测发现,RNAi结构已经转入亚麻中,并显著降低了其4CL基因的表达量。     

桃蚜MpAChE基因RNAi表达载体构建及转化

通过害虫取食植物表达害虫发育关键基因dsRNA的转基因植株,分析能否通过抑制害虫特定基因的表达来防控害虫。本研究利用RT-PCR技术从桃蚜中克隆乙酰胆碱酯酶基因383 bp cDNA片段,命名为MpAChE。进一步利用该MpAChE基因片段构建植物RNAi表达载体RNAi-MpAChE,并通过浸花法转化野生型拟南芥,通过卡那霉素抗性筛选转化植株,PCR及Southern杂交进一步鉴定转基因植株。结果表明:克隆的cDNA片段与桃蚜中已克隆的乙酰胆碱酯酶(GenBank登录号AY147797)cDNA序列核苷酸一致性为99%。卡那霉素抗性初步筛选和PCR进一步鉴定,获得25株阳性转基因植株。从25株中随机选择的5株阳性植株,Southern杂交均为阳性。经接种桃蚜初步鉴定,转基因植株对蚜虫的抗性效果不显著。     

百合查尔酮合成酶基因克隆及其转化烟草的花色表达分析

以‘西伯利亚’百合为试材,利用PCR技术克隆了查尔酮合成酶基因(CHS),构建了CHS基因的正义和反义植物表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草叶盘,获得了转正义CHS基因的本明烟草18株,转反义CHS基因的普通烟草21株,总转化率为26.0%。高效液相色谱法(HPLC)检测结果显示,正义CHS转基因的本明烟草类黄酮含量升高14.0%～59.7%,反义CHS转基因的普通烟草类黄酮含量降低44.5%～76.4%。花色观察结果显示,正义转基因烟草的花瓣颜色未见变化,反义转基因烟草部分植株的花瓣颜色变浅。研究表明,CHS基因遗传转化是进行花色调控的有效手段之一。     

木霉几丁质酶基因克隆及植物转化载体构建

利用PCR技术从绿色木霉LTR-2(Trichoderma virede)基因组DNA中扩增到一段序列,测序结果表明,该编码基因片段大小为 1 508 bp,其中包括一个 1 459 bp的开放阅读框,起始密码子位于 45 bp,终止密码子位于 1 501 bp,共编码氨基酸 424 个.在Genbank中进行序列比对,发现该序列同已发表的Trichoderma viride 42 ku几丁质酶氨基酸序列具有99%的同源性.将该片段同pCAMBIA1300中的35S启动子和35S-polyA终止子连接后,插入载体pCAMBIA1302多克隆位点中,构建成植物转化载体,最后将构建好的载体pCHI1302-42通过转化导入根癌农杆菌LBA4404中,为进一步构建转基因植物奠定了基础.     

双抗(抗病毒及抗虫)植物表达载体的构建及番茄的转化鉴定

将抗病毒的ＣＭＶ－ｃｐ 基因和抗虫的Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ 基因依次插入到植物表达载体ｐＥ３ 的ＨｉｎｄⅢ和ＫｐｎⅠ位点,通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定,然后以土壤农杆菌ＧＶ３１１－ＳＥ介导转化番茄,胭脂碱检测,染色体ＤＮＡ 的点杂交及ＰＣＲ扩增证明ＣＭＶ－ｃｐ 基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ 基因已同时导入转化再生的番茄植株。ＲＮＡ 点杂交证明ＣＭＶ－ｃｐ 基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ 基因已在转基因番茄植株中同时获得表达。     

几丁质酶基因表达载体构建及转化烟草的研究

构建了一个含有多个调控序列的带有几丁质酶基因的植物表达载体,通过发根农杆菌的Ri质粒介导转化烟草的三个品种：K326,RG11,VA116,在卡那霉素抗性培养基上筛选,获得了7株再生植株,以PCR检测、DNA斑点杂交证明表达载体构建成功,几丁质酶基因导入烟草并整合到烟草基因组中。     

梅PGIP基因超表达载体的构建及遗传转化

运用已克隆的梅PGIP基因构建植物超表达载体,将PGIP插入带有启动子super-promoter和终止子nos的中间载体P-Super1300 中,酶切鉴定表明,目的基因已正确地插入载体中.用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得25株潮霉素抗性苗,对其中的13株进行PCR检测,有12株扩增出了目的条带;进一步对其中的7株进行Southern杂交检测和RT-PCR检测,发现7个株系均有杂交带出现,且均发生了基因转录,说明已成功获得了能够表达PGIP基因的转基因烟草.     

二氢黄酮还原酶基因的克隆与转基因烟草的获得

以蒺藜苜蓿(Medicagotrunctulacv.5160)幼果总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到二氢黄酮还原酶(DFR)基因的cDNA序列,所获得的cDNA序列全长1018 bp,具有完整的ORF,编码337个氨基酸。Blast分析表明,该片段与GenBank中注册的DFR基因同源性为99.80%。以植物表达载体pBI121为基础,构建了Ca MV35S启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR;采用直接转化法将pBIDFR导入根癌农杆菌EHA105,用该菌株对普通烟草进行遗传转化获得6株转基因植株。     

AtAAPT1基因RNAi的植物表达载体的构建

以拟南芥中氨基乙醇磷酸转移酶基因AAPT1作为RNA i的靶向序列,采用RT-PCR的方法获得目的DNA片段。然后以pBS-T-AAPT1载体为基础,构建了由35 s启动子调控的AAPT1基因RNA i的植物表达载体pART27-AAPT1(1,2),并通过电击法将重组质粒导入根癌农杆菌C58中。AtAAPT1基因RNA i的植物表达载体的构建对于研究AAPT1基因的功能和应用具有重要的理论价值。     

AGPase基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

将大肠杆菌BL21的AGPase基因定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,从而构建植物表达载体,转化烟草获得了转基因植株。经GUS组织化学染色、PCR、Southern blot以及RT-PCR鉴定证实,该基因已导入烟草基因组中。淀粉含量测定结果显示,转基因植株比非转基因植株淀粉含量平均增加了13.1%,由此验证了该载体构建的成功与可用性,为下一阶段用该载体转化木薯主栽品种提高块根淀粉含量的研究奠定了基础。     

辣椒ML基因植物表达载体的构建及其转化

为分析辣椒ML基因在抗辣椒疫病方面的作用,构建了ML基因的植物表达载体pBI121-ML,采用快速冻融法将表达载体导入农杆菌EHA105,并用农杆菌介导法转化辣椒感病品种B12,对得到的转化植株经PCR和RT-PCR分子检测,结果显示,获得了4个辣椒转基因株系.     

云南普通野生稻和地方稻WRKY45基因的克隆及转化

以云南地方稻‘三磅七十箩’(SB70)和景洪普通野生稻为材料,根据GenBank中水稻WRKY45基因序列设计引物,进行PCR扩增。结果表明,经测序得到目的基因长约1.3kb,推导的氨基酸具有WRKY蛋白典型的保守区域WRKYGQK。经BLAST分析,与GenBank中不同栽培稻WRKY45基因的相似性在85%以上,但也存在一些核苷酸差异,这些差异可能导致其调控抗逆能力更强。构建该基因的表达载体pCAMBIA1300,重组克隆后通过农杆菌介导法转入云南栽培粳稻‘云资粳41号’中,经PCR鉴定获得24株转基因阳性植株。     

10kD玉米醇溶蛋白基因的克隆与植物表达载体构建

由于紫花苜蓿中的含硫氨基酸水平很低,采用基因工程手段将富硫蛋白基因-10kD玉米醇溶蛋白(zein)基因转入苜蓿中以提高其水平。根据该基因的保守序列设计引物,并在下游引物终止密码子前引入内质网驻留蛋白信号序列(KDEL),通过PCR技术从玉米(Zea mays L.)黄化幼苗基因组中扩增目的基因的开放阅读框(ORF)。序列测序得到全长为465bp的目的片断,该片段编码154个氨基酸,其中甲硫氨酸(M)31个占20.13%,半胱氨酸(C)6个占3.90%,含硫氨基酸共占24.03%。该基因与报道的10kD玉米醇溶蛋基因具有很高的同源性。将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA13011上,以转化紫花苜蓿提高其含硫氨基酸的水平。     

蝴蝶兰LFY基因克隆及高效植物表达载体的构建

根据NCBI中蝴蝶兰LFY花序分生组织基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从蝴蝶兰花芽中扩增出LFY基因,对扩增产物进行克隆和测序.结果表明,获得的蝴蝶兰LFY基因约为1500 bp,与报道序列同源性达98.71％.将LFY基因插入pRI101-ON载体中,经PCR、双酶切及测序鉴定,证实重组表达质粒中含有目的片段,表明成功构建了高效植物表达载体pRI1O1-LFY.     

海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建

以担子菌灰树花的菌丝体中提取总ＲＮＡ,并纯化出ｍＲＮＡ,ｍＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ第一链,以ｃＤＮＡ第一链为模板经ＰＣＲ扩增海藻糖合酶（Ｔｓａｓｅ）基因,获得一长约２．２ｋｂ的片段,把该片段连接一ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ上进行测序,其全长共２１９９ｂｐ。随后将此片段以正向插入植物表达载体ｐＢＩ１２１的ＨｉｎｄⅢ＋Ｘｂａｌ位点构建ｐＵＢ,再把海藻糖合酶基因以正向插入载体ｐＵＢ的ＢａｍＨ     

大白菜orf224基因植物表达载体的构建及遗传转化

为了创制新的大白菜雄性不育材料,双酶切重组质粒pMD18-T-CMS7311-orf224和表达载体pWR306后,将CMS7311-orf224基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因CMS7311-orf224的植物表达载体pWR-CMS7311-orf224,通过酶切和PCR验证pWR-CMS7311-orf224载体构建正确.采用快速冻融法,将表达载体导入农杆菌EHA105,转化大白菜材料06J28,对转化植株的GUS、PCR和RT-PCR检测表明,获得了2个大白菜转基因植株.