胸腺素α原的研究进展

胸腺素α原(ProTα)是一种在哺乳动物细胞中广泛分布、结构保守的酸性小分子蛋白,是胸腺素α1(Tα1)的前体蛋白。目前在细胞内和细胞外均已发现了ProTα。在胞内,ProTα作为一种核蛋白,参与对细胞周期的调节,促进细胞增殖;在胞外,ProTα通过潜在的膜受体调节免疫应答,促进IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子的产生,进而增强细胞和体液免疫应答。但该蛋白的分泌机制、受体以及信号通路还有待研究。     

重组人胸腺素α原体外活性观察

以原核表达并纯化人胸腺素α原后,观察其体外活性,了解到胸腺素α原对胸腺细胞氢化考的松损伤有明显的保护作用,表现在它可明显提高氢化考的松损伤后细胞的数目和ＭＴＴ反应能力,氢化考的松引起胸腺细胞凋亡的发生,并显著降低ＣＤ４＋、ＣＤ８＋单阳性细胞和ＣＤ４－ＣＤ８－双阴性细胞的比例,胸腺素α原不能抑制胸腺细胞凋亡的发生,并可能对胸腺细胞凋亡有促进作用,与空白对照组比较,它也可明显降低ＣＤ４＋阳性细胞的比例,结果表明,胸腺素α原对胸腺细胞氢化考的松损伤的保护作用并非通过抑制凋亡而实现。     

apoaequorin-egfp融合基因对烟草的遗传转化及其分子检测

用钙离子报告基因非侵入式监测细胞内源钙离子实时变化是目前比较常用的钙离子监测方法。而基于传统荧光共振能量转移原理(FRET)的荧光探针具有较高的量子产率,则是目前应用于细胞或亚细胞水平钙离子检测的重要备选实验方案之一。然而,供体荧光基团的激发过程却经常给最终成像过程带来强的背景和荧光信号光漂白等干扰。水母发光蛋白(Aequorin)能够在底物存在的情况下和3个Ca~(2+)结合,通过氧化还原反应产生一个波长为469 nm的蓝光光量子,借助这一反应中蓝光光量子的产率与细胞中游离Ca~(2+)浓度间存在精确定量关系,研究者可以准确测量细胞内的钙离子浓度动态变化情况。但是由于蓝光的波长短,存在易于被散射而难于被检测等问题,造成了目前直接使用水母发光蛋白检测细胞内Ca~(2+)动态时,实验效率较低。为了解决上述这些问题,我们构建了一种将apoaequorin-egfp基因融合表达的植物双元表达载体,然后通过农杆菌介导的遗传转化法将这个融合基因整合到烟草的基因组中,建立了一个基于生物发光共振能量转移技术(BRET)技术,较为高效的植物细胞内源钙离子动态检测系统。     

胸腺素α原反义寡核苷酸对胃癌细胞生长的影响

目的:探讨反义胸腺素α原(Prothymosin alpha,ProTα)基因转染对胃癌细胞生长的影响,为以ProTα为靶向的胃癌基因治疗开辟新的途径.方法:人工合成ProTα反义寡核苷酸(ProTα-AS-ODN),以阳离子聚合物转染法转染体外培养的人胃癌细胞BGC-823,以正义寡核苷酸和未转染组为对照,应用RT-PCR及免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)法分析ProTα基因及其蛋白的表达,MTT法分析细胞生长抑制作用,Hoechst 33258检测细胞凋亡.结果:RT-PCR、ICC显示ProTα-AS-ODN转染组ProTα mRNA及其蛋白的表达显著减少,MTT检测表明ProTα-AS-ODN转染组活细胞数较其它各组均低(P＜0.05),Hoechst 33258则显示其凋亡细胞数较其它各纽明显增高(P＜0.01).结论:Proα-AS-ODN成功转染人胃癌细胞BGC-823,封闭了ProTα mRNA的翻译,使已转染的细胞ProTα蛋白的表达减少,且可抑制细胞的增殖并诱导细胞发生凋亡.     

烟碱对脑细胞内钙离子浓度的调控及其机制分析

神经肌肉接头及神经节N受体均可引起细胞外Ca~(2 )内流和细胞内Ca~(2 )释放,增加细胞内Ca~(2 )浓度。尚无资料证明脑N受体是否影响细胞内Ca~(2-)浓度。本实验观察烟碱对脑细胞内Ca~(2 )浓度的影响并探讨其可能的机理。 烟碱对大鼠脑突触体主动摄取~(45)Ca~(2 )的影响 本实验条件下钙通道激动剂Bay-k-8644(10~(-7)～10~(-4)～mol/L)浓度依赖性地增加突触体~(45)Ca~(2 )主动摄取量;钙通道拮抗剂异搏定(10~(-9)～10~(-5)mol/L)浓度依赖性地抑制~(45)Ca~(2 )摄取     

血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞中大电导钙激活钾通道的多重调节作用（英文）

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)是影响血管平滑肌细胞张力的重要因素。RAS主要活性物质血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)可通过激活血管紧张素Ⅱ-1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)升高胞内Ca~(2+)浓度,收缩平滑肌细胞。大电导钙激活钾(large-conductance Ca~(2+)-and voltage-activated potassium, BK)通道是血管平滑肌细胞中分布最广、表达最多的钾离子通道,在维持细胞膜电位和胞内钾钙平衡中发挥重要作用。血管平滑肌细胞上的BK通道主要包含α与β1两种亚基。其中功能亚基BKα上分布有膜电位及Ca~(2+)感受器。因此当膜电位或细胞内Ca~(2+)浓度升高时会反馈性引起BK通道开放。然而,越来越多的研究显示,尽管Ang Ⅱ可升高胞内Ca~(2+)浓度,但却通过激活PKC通路、促进AT1R与BKα通道形成的异源二聚体内吞、加快α与β1亚基解离等途径抑制BK通道的表达和功能。在一些情况下,Ang Ⅱ对BK通道也可表现出激活作用,但机制尚不完全明确。该综述总结了Ang Ⅱ对BK通道抑制或激活两方面效应的可能原因,为改善细胞内离子失衡提供理论依据。     

眼镜蛇毒直接溶解因子对人肝癌细胞株细胞内游离钙动态变化的影响

用荧光染料FIuo-3标记人肝癌细胞株H_(7402)细胞内游离钙,在粘附式细胞仪观察检测单个细胞内游离钙水平的动态变化,细胞在无钙环境中,直接溶解因子(DLF)刺激下细胞内游离钙迅速升高,达到峰值后下降;在细胞培养皿中加入1mmol/L CaCl_2,DLF使胞浆游离钙持续升高;加入10mmol/L CaCl_2,DLF刺激后胞浆游离钙水平无明显变化,表明DLF能引起胞内Ca~(2 )释放和胞外Ca~(2 )内流,细胞外高浓度Ca~(2 )能阻断DLF升高细胞内Ca~(2 )浓度的 作用。     

钙离子通道亚基Cacnb3对小鼠脂肪间充质干细胞成骨分化的促进作用

间充质干细胞在治疗骨相关疾病中具有重要意义,但其在成骨分化中的机制尚未完全阐明。该研究通过分析GEO数据库中有关组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)处理过的小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1 preosteoblasts)的生物芯片数据,筛选出22个在成骨分化中上调,在成脂分化中下调,且受HDACi紧密调控的基因。这22个基因中有6个基因(Cacnb3、Lpcat2、Cd248等)与Ca~(2+)调节功能相关,提示Ca~(2+)可能在MSCs分化中发挥重要作用。在后续实验中,我们观察到电压依赖性钙通道亚单位β3(calcium voltage-gated channel auxiliary subunit beta 3, Cacnb3)和磷脂酰基转移酶2(lysophosphatidylcholine acyltransferase 2, Lpcat2)在小鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)、人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)和小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)的成骨分化过程中上调,提示Cacnb3、Lpcat2可能参与ADSCs的体外成骨分化。此外,利用钙离子荧光探针检测方法,发现敲低Cacnb3后3T3-E1细胞内Ca~(2+)浓度明显低于对照组,同时,成骨相关基因(ALP、Runx2)表达显著下调,表明Cacnb3可能通过影响Ca~(2+)浓度调控细胞的成骨分化,该研究为进一步探索间充质干细胞成骨分化的机制奠定了基础。     

大鼠心肌线粒体Ca2+-ATP酶的制备及活性测定

Ca~(2 )在细胞内有许多重要的功能,它参与不同酶系和多种类型细胞活动的调节。细胞内Ca~(2 )的这些功能需很低的Ca~(2 )浓度(μmol/L或更低),维持细胞浆低Ca~(2 )浓度是与细胞Ca~(2 )调节装置有关,心肌细胞的这类装置包括肌膜、肌浆网、线粒体以及一些与Ca~(2 )结合的蛋白(如钙调素)和小分子物质,其中线粒体是重要的机构之一。Vasington等首次报道了肾脏线粒体对Ca~(2 )的摄取作用,并注意到这一过     

测定植物细胞胞质中游离Ca~(2 )浓度的荧光指示剂法

本文介绍测定胞质游离Ca~(2 )浓度最常用的荧光指示剂法在测定植物细胞胞质游离Ca~(2 )浓度上的应用。     

胸腺素α原作为乙型肝炎表面抗原佐剂的研究

目的：研究胸腺素α原（ProTα）作为佐剂对重组乙型肝炎表面抗原（HBsAg）诱导小鼠产生乙型肝炎表面抗体（抗-HBs）的影响。方法：以纯系BALB/c小鼠为免疫对象,分组情况为：①HBsAg组（1μgHBsAg）;②0.1μgProTα＋1μgHBsAg组;③0.5μgProTα＋1μgHBsAg组;④1μgProTα＋1μgHBsAg组;⑤铝佐剂组（1μgVacon疫苗）;⑥1μgPro-Tα＋1μgVacon疫苗组;每组10只小鼠,分别于0、2周各肌肉注射免疫1次。采用ELISA法检测血清抗-HBs滴度（即IgG亚类IgG1和IgG2a）。结果：与单独注射HBsAg组相比,1μgProTα＋1μgHBsAg组抗-HBs总抗体滴度明显增高（P〈0.05）,抗体持续时间更长,且ProTα可以平衡Th1和Th2免疫反应;2组间IgG1/IgG2a差异显著（P〈0.05）。与铝佐剂相比,ProTα增强了小鼠对HBsAg的反应性,提高抗-HBs阳转率。结论：ProTα在增强小鼠抗-HBs产生的同时,提高细胞免疫反应,提示ProTα是一种很有潜力的HBsAg佐剂。     

噻唑衍生物WSF-SN-10激活AMPK的机制研究

目的:在噻唑衍生物中筛选新型AMPK激活剂并探究其激活AMPK的分子机制,以期找到副作用少的II型糖尿病治疗药物。方法:用14种噻唑衍生物处理293T细胞,用Western Blot筛选能显著提高AMPK磷酸化水平的化合物;用HPLC和FACS分别检测该化合物对细胞内AMP/ATP比值和Ca~(2+)浓度的影响,探究其激活AMPK的分子机制。结果:WSF-SN-10(2-(2-(6,6-二甲基双环[3,1,1]庚-2-亚基)肼基)-4-(4-氰基苯基)噻唑)为14种噻唑衍生物中活性最强的AMPK激活剂;20μM下WSF-SN-10激活AMPK的活性最强;用20μM WSF-SN-10处理293T细胞后,细胞内的AMP/ATP比值和LKB1的磷酸化水平分别上升至空白对照的1.94和3.04倍,同时Ca~(2+)浓度无明显变化,说明WSF-SN-10通过增加细胞内的AMP/ATP比值来激活AMPK。结论:噻唑衍生物WSF-SN-10能抑制细胞内的ATP合成来间接激活AMPK,是治疗II型糖尿病和肥胖症的潜在药物。     

小鼠卵激活过程中胞质游离Ca~(2 )的变化及孤雌发育研究

乙醇和电刺激均可使小鼠MⅡ期卵母细胞激活并在体外孤雌发育至囊胚。小鼠卵对乙醇十分敏感。用7%—8%乙醇处理5min后95%以上的卵母细胞(卵龄为HCG注射后18—19h)内形成原核。3—4次电刺激后卵的激活率为71.58%;仅刺激1次卵的激活率为63.63%。乙醇刺激可诱导卵内游离Ca~(2 )浓度出现多次升高;单一电刺激仅能诱导卵内游离Ca~(2 )浓度出现1次升高;多次电刺激可诱导卵内游离Ca~(2 )浓度多次升高,而且电刺激次数与Ca~(2 )浓度升高成一一对应关系。对于电刺激,介质中足够量的Ca~(2 )对卵激活至关重要。在无Ca~(2 )的介质中,电刺激很难使卵激活。正常受精刺激诱导卵内游离Ca~(2 )浓度出现多次有规律的升高。实验结果表明,卵母细胞激活过程中胞质游离Ca~(2 )浓度重复多次升高可促使卵母细胞恢复成熟分裂。     

创伤后抑制性T细胞对活化T细胞内白介素2及白介素2受体α基因表达的影响

研究了创伤小鼠抑制性T细胞(Ts)对白介素2(IL-2)及IL-2受体(IL-2R)α基因表达的抑制作用。结果表明,创伤后Ts细胞对正常活化T细胞内IL-2 mRNA及IL-2 RαmRNA水平的抑制作用增强,以伤后4天最为明显,伤后10天仍未恢复正常。创伤后Ts细胞还可升高正常活化T细胞内cAMP含量,降低cGMP含量,增加cAMP/cGMP比值。且可降低三磷酸肌醇(IP_3)含量、游离钙(Ca~(2 ))浓度、钙调素(CaM)、钙调素依赖性蛋白激酶(CaM-PK)及蛋白激酶C(PKC)的活性。去除创伤小鼠活化T细胞中的Ts细胞,则可使其IL-2mRNA及IL-2RαmRNA水平明显升高。并可使cAMP、cGMP、IP_3含量、Ca~(2 )浓度、CaM、CaM-PK及PKC活性的变化发生逆转。表明创伤后Ts细胞可通过影响T细胞内环核苷酸含量及磷脂酰肌醇代谢途径,进而抑制IL-2及IL-2 Rα的基因表达。     

芍药苷对大鼠背根神经元细胞内Ca~(2+)的影响

目的建立一种评价芍药苷对大鼠背根神经节神经元细胞内游离Ca~(2+)浓度影响的方法。方法显微解剖获取大鼠背根神经节(DRG),通过胰蛋白酶消化,过筛,用DF-12和抗有丝分裂培养液交替培养纯化,获得原代大鼠DRG神经元细胞,并采用细胞免疫荧光技术测定DRG神经元细胞纯度;采用激光共聚焦显微成像技术,观察细胞内Ca~(2+)荧光强度的变化,并对Ca~(2+)荧光强度变化率进行分析,探讨芍药苷对DRG细胞内游离钙离子浓度及辣椒素受体的影响。结果采用上述方法分离得到的DRG细胞纯度可高达95%以上,辣椒平可通过阻断辣椒素激活的瞬时受体电位通道的作用而抑制细胞内Ca~(2+)的增加。芍药苷表现出与辣椒平类似的作用,可以阻断细胞外Ca~(2+)内流。结论芍药苷可能是通过作用于TRPV1通道,而抑制DRG细胞内Ca~(2+)大量增加,本方法可以用于评价药物对大鼠DRG细胞内Ca~(2+)浓度的影响。     

菹草类胡萝卜素提取物对人肝癌细胞QGY-7703凋亡的影响

分别用含10、20、40、60μmol/L的菹草类胡萝卜素提取物(CEPC)培养液处理人肝癌细胞(QGY-7703)48h、96h和144h,在这三个处理时间各剂量组对肝癌细胞的抑制率平均值范围分别为0.14%-23.07%、39.59%-70.61%和71.65%-87.01%。经10、20和40μmol/L的CEPC培养液处理肝癌细胞24h、48h和72h,用激光扫描共聚焦显微术(LSCM)观察细胞形态,出现了肝癌细胞数量明显减少,细胞体积缩小、皱缩变形,细胞核呈现“新月状”、条状甚至碎片状,细胞核中呈黄色的DNA面积较明显地减小等典型的凋亡细胞形态特征。以流式细胞术分析用CEPC处理肝癌细胞后各时相细胞的百分比,与对照组比较,用10μmol/L和20μmol/L浓度的CEPC处理肝癌细胞48h后,使细胞周期中的G_0/G_1期的细胞比例极显著增加(P<0.01),分别增加了23.8%和35.6%,而在G_2/M期没有明显的变化,在S期则相应减少。用LSCM测定了肝癌细胞内的Ca~(2 )浓度,与对照组比较,经20μmol/LCEPC处理48h后能引起细胞内Ca~(2 )浓度极显著上升(P<0.01),剂量组细胞内Ca~(2 )荧光强度为对照组的1.5倍。以上结果表明CEPC对人肝癌细胞QGY-7703的增殖具有明显的抑制作用,且在一定程度上呈时间-效应和剂量-效应依赖关系。在较短的时间内及使用较小的CEPC剂量能有效地诱导肝癌细胞凋亡,CEPC使肝癌细胞阻滞于G_0/G_1期发生凋亡。CEPC能极显著提高肝癌细胞内的Ca~(2 )浓度,提示Ca~(2 )浓度升高可能是CEPC诱导肝癌细胞发生调亡的重要原因。本项研究结果为进一步研究和开发菹草类胡萝卜素的功能和价值打下了重要基础。     

大肠杆菌N~α-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原N末端乙酰化修饰的影响

目的:研究大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原(ProTα)N末端乙酰化修饰的影响。方法:在大肠杆菌中共表达ProTα与大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI,同时设置只表达ProTα的对照菌,分别提取纯化ProTα,利用HPLC检测其发生乙酰化修饰的程度。结果:ProTα的乙酰化修饰发生在翻译后水平,有无RimI的过表达、诱导时间的长短以及这两个因素之间的交叉效应均对ProTα的乙酰化程度有影响,其F值分别为53.8、89.22及16.28,P值均小于0.0001;无论有无RimI过表达,乙酰化的ProTα所占比例在诱导6 h后逐渐升高(P<0.0001);在过表达Ri-mI的菌株中,乙酰化的ProTα在诱导12 h后占37.4%,而在无RimI过表达的菌株中占64.3%;RimI对ProTα乙酰化的抑制作用从诱导6 h后开始显现(P=0.0007)。结论:在大肠杆菌中,过量的Nα-乙酰基转移酶RimI可抑制人胸腺素α原的乙酰化修饰。     

肺炎衣原体抑制LXRα-ABCA1途径促进巨噬细胞脂质蓄积

为探讨肝X受体α(LXRα)-三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)途径在肺炎衣原体(C.pneumoniae)促巨噬细胞脂质蓄积中的作用和机制,以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为模型,采用高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量,液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出,RT-PCR检测ABCA1和LXRαm RNA的表达,蛋白质印迹检测ABCA1和LXRα的蛋白质表达;使用LXRα的特异性激动剂T0901317对细胞进行预处理,再观察上述指标的变化.结果显示,C.pneumoniae可促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量增加,抑制胆固醇外流,降低细胞ABCA1和LXRα的表达;使用ABCA1激动剂8-溴-环磷酸腺苷预处理细胞或LXR激动剂T0901317预处理细胞后,可明显减弱C.pneumoniae对THP-1细胞ABCA1的表达抑制,促进细胞胆固醇流出,降低细胞内胆固醇的含量.结果提示,C.pneumoniae促进巨噬细胞脂质蓄积及胆固醇流出障碍,其机制可能与LXRα-ABCA1途径有关.     

肿瘤坏死因子α和β对电离辐射诱导细胞凋亡的效应

为探讨肿瘤坏死因子(tumor necrosis foctor)α和β(TNFα和β)对电离辐射诱发细胞凋亡的效应及其机理,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和FACS分析等方法,观察了人肿瘤坏死因子α(hTNFα)和β(hTNFβ)对~(60)Co-γ射线诱发细胞凋亡的形态学,生化学变化。结果显示:hTNFα或hTNFβ均可明显抑制~(60)Co-γ射线诱发正常人胚肺二倍体细胞(2BS)的凋亡,而相同剂量的hTNFα能促进~(60)Co-γ射线诱发的人体肺腺癌细胞系A549细胞凋亡,而对另一株人体肺癌SPC细胞的效应比A549降低1倍;hTNFβ能分别增强A549和SPC的细胞凋亡频率。由此认为,hTNFα和hTNFβ均可通过调节细胞的生理生化反应来改变细胞对电离辐射的敏感性,可保护正常细胞免受辐射损伤,而增加某些肿瘤细胞对辐射的敏感性。     

心肌细胞核Ca2+库特点及其调节的离体研究

研究核外Ca~(2+)浓度对核Ca~(2+)的影响,及细胞核Ca~(2+)摄取和释放的关系,以探讨核Ca~(2+)转运的调节机制。采用差速离心和密度梯度离心法分离纯化心肌细胞核,以Fluo-4/AM荧光指示剂负载心肌细胞核,应用激光共聚焦扫描显微镜和荧光分光光度计进行观察和测定。结果显示,分离纯化的成年大鼠心肌细胞核内自由[Ca~(2+)]随着核外[Ca~(2+)]的增加而逐渐增加,孵育液[Ca~(2+)]为1000 nmol/L达高峰,但二者增加的程度并不一致,之后随核外[Ca~(2+)]浓度的增加而呈降低趋势。ATP和100—600nmol/L的核外游离Ca~(2+),使心肌细胞核显示核被膜腔Ca~(2+)荧光,ATP和1000nmol/L的核外游离Ca~(2+)则进一步引起核浆内的Ca~(2+)荧光强度升高。荧光染色观察可见IP_3受体染色主要位于核内膜,而钙泵和ryanodine受体染色主要位于核外膜。IP_3和Ryancodine使核Ca~(2+)短暂升高1.68倍和1.93倍(P<0.001),而钙泵抑制剂Thapsigargin和IP_3受体抑制剂Heparin则分别使核Ca~(2+)降低64%和35.6%(p<0.05)。ryanodine使IP_3升高的核Ca~(2+)显著回落至正常水平以下(p<0.001)。Thapsigargin不能阻断IP_3和Ryanodine所致的核Ca~(2+)释放增加(p<0.05),但事先采用钙泵抑制剂Thapsigargin预处理心肌细胞核,则能显著的阻断IP_3和Ryanodine所致的核Ca~(2+)升高作用(Ca~(2+)释放作用)(p<0.05)。结果提示大鼠心肌细胞核可能也是细胞内的钙库之一,心肌细胞核上存在Ca~(2+)-ATPase、ryanodine受体和IP_3受体等Ca~(2+)转运系统,可能参与核Ca~(2+)摄取和释放的调节。