PES1蛋白与雄激素受体的相互作用及定位

目的:研究PES1蛋白与雄激素受体(AR)之间的相互作用。方法:利用免疫共沉淀实验检测PES1蛋白与AR之间的相互作用,并进行相互作用定位;利用Western印迹研究PES1对乳腺癌细胞内AR表达水平的影响。结果:免疫共沉淀实验显示PES1蛋白与AR存在相互作用;PES1蛋白的1~110、111~220、221~320和311~588氨基酸残基(aa)区域均能与AR结合,415~588 aa不能结合AR;AR的651~918 aa区域与PES1结合。PES1不能调节乳腺癌细胞AR的表达水平。结论:PES1多个区域均能与AR相互作用,并且主要结合在AR的转录激活结构域2,为进一步探讨PES1对AR功能的调节奠定了基础。     

人酪蛋白激酶1激酶区真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建带Flag标签的酪蛋白激酶1α(CK1α)激酶区截短突变体CK1α(1-285aa)的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶区与已知相互作用蛋白Myc-Cdc25A之间的相互作用。方法:用PCR技术从人全长CK1α真核表达载体中扩增CK1α(1-285aa),将其克隆到Flag载体中,将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达情况,免疫共沉淀分别检测Flag-CK1α全长、Flag-CK1α(1-285aa)与Myc-Cdc25A的相互作用。结果:双酶切和基因测序鉴定显示Flag-CK1α(1-285aa)真核表达载体克隆构建成功;Western印迹结果表明Flag-CK1α(1-285aa)转染人胚肾细胞293T细胞后获得表达;免疫共沉淀结果显示Flag-CK1α全长、Flag-CK1α(1-285aa)与Myc-Cdc25A在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论:构建了Flag-CK1α(1-285aa)的真核表达载体,为进一步探讨Flag-CK1α激酶区对细胞信号通路的调节作用奠定了实验基础。     

PINK1与α-synuclein相互作用结构域鉴定

目的: 确定PINK1与α-synuclein相互作用的结构域。方法: 将PINK1不同结构域质粒(pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1^WT, pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(G309D),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔN35),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔC145),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(156~509), pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(Δ156~581), pcDNA3.1-3xFlag-vector)分别和pCMV-Myc-α-synuclein质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)技术验证PINK1与α-synuclein相互作用的结构域;同时进行免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的共定位关系。结果: Co-IP实验结果表明PINK1与α-synuclein相互作用的结构域为PINK1的激酶结构域。免疫细胞化学实验也证实α-synuclein只与含激酶结构域的PINK1蛋白在细胞中存在共定位关系。结论: PINK1与α-synuclein相互作用的结构域位于其激酶结构域。     

Robo1 与Nek9相互作用并影响胃癌细胞迁移

目的:筛选与Robo1分子相互作用的蛋白质,为揭示Robo1调节胃癌细胞迁移能力的机制提供线索。方法:通过Transwell迁移实验检测下调Robo1对胃癌细胞SGC7901迁移能力的影响,并对胃癌细胞SGC7901利用Robo1抗体和lgG分别进行免疫沉淀,再经质谱检测及生物信息学分析筛选与Robo1分子特异性结合的蛋白质,通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)验证蛋白质相互作用。结果:(1)转染Robo1小干扰RNA(si RNA)的SGC7901细胞较转染阴性对照RNA的迁移能力显著降低。(2)通过免疫沉淀、质谱检测和生物信息学分析的两次生物学重复得到一系列与Robo1相互作用的蛋白,筛选出丰度高、重复性好且功能相关的Nek9蛋白。(3)Co-IP实验结果显示与对照抗体相比,Robo1抗体可特异性地将Nek9沉淀下来,同时Nek9抗体也可特异性地将Robo1共沉淀下来,确证了Robo1-Nek9的相互作用。结论:Nek9是与Robo1相互作用的蛋白质,Robo1下调影响人胃癌细胞系SGC7901的迁移能力,可能通过Nek9起作用。Robo1-Nek9的相互作用为进一步研究Robo1在胃癌细胞中的功能及机制提供了有利的线索。     

CCCTC-结合因子与输入蛋白13存在蛋白间相互作用

目的:研究CCCTC-结合因子(CTCF)是否与输入蛋白13(IPO13)存在相互作用。方法:采用GST pull-down及免疫共沉淀实验研究二者的相互作用。结果与结论:实验表明CTCF与IPO13之间存在相互作用     

乙肝病毒X与Tab1蛋白相互作用的体内外验证

目的:借助实验室前期质谱分析技术和数据分析研究基础,采用免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白质沉降实验(GST pull-down)验证HBV X蛋白与Tab1蛋白的相互作用,为进一步研究HBx在HBV慢性感染致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法:成功构建pGEX-2TK-GST-HBx质粒,对GST-HBx融合蛋白进行诱导表达,与GST-beads结合孵育,构建pcDNA3.1/myc-His(-)BTab1,转染293T细胞使其表达,然后GST pull-down体外试验验证二者的相互作用;构建pcDNA3.1/myc-His(-)B-Tab1和pcDNA3.1-3×flag-HBx真核表达质粒,共转染293T和HepG2细胞使其表达,通过Co-IP实验验证抗Myc抗体可以将HBx从细胞裂解液中沉淀下来,证实了它们在两种细胞系中存在相互作用。结果:显示了HBx和Tab1在体内外条件下能够发生相互作用,为进一步明确HBV X蛋白功能及作用机制奠定基础。     

四苯基卟啉氯化锰与ctDNA的相互作用

目的:探究非水溶性的四苯基卟啉氯化锰[(TPP)MnCl]与小牛胸腺DNA(ctDNA)的相互作用方式及机理.方法:借助紫外-可见光谱、荧光光谱和电化学等手段研究了(TPP)MnCl与ctDNA相互作用的过程.结果:两者作用后,(TPP)MnCl的紫外-可见光谱在Soret带减色30%;EB-DNA体系的荧光猝灭;(TPP)MnCl的循环伏安也明显变化.实验测得(TPP)MnCl与ctDNA的表观结合常数为9.3×105L·moL-1.结论:在实验条件下,(TPP)MnCl与ctDNA以静电结合方式相互作用.     

酵母双杂交筛选与甲状旁腺素1型受体相互作用的蛋白

目的:采用Clontech公司第3套酵母双杂交系统,筛选与甲状旁腺素1型受体(PTH1R)相互作用的蛋白。方法:将全长PTH1R基因克隆到载体pGBKT7作为诱饵,用LiAc介导将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PTH1R和人肾cDNA文库质粒转化到酵母菌AH109中,检测Mel1报告基因的表达,并进行相互作用的验证。结果:测序和相互作用验证结果表明SNAPIN在酵母系统中能特异地与PTH1R相互作用;根据对SNAPIN基因的功能分析,其可能与细胞内钙稳态的调控有关。结论:为进一步研究PTH1R促进骨肉瘤进展的机制提供了一定的线索。     

hnRNPK与Nef相互作用并有利于细胞表面CD4的表达

目的:前期不同的研究分别证明HIV蛋白Nef下调宿主细胞表面受体CD4的表达,以及Nef与宿主细胞蛋白heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K(hnRNPK)存在相互作用。因此提出了两个值得研究探讨的重要问题:(1)hnRNPK是否参与调节细胞表面CD4的表达?(2)Nef是否通过hnRNPK调节细胞表面CD4的表达?方法:利用半体外GST-pulldown技术验证Nef与hnRNPK存在相互作用。通过瞬时转染的方式将HIV-1Nef表达在He La-CD4细胞里,同时利用siRNA干扰技术敲低hnRNPK,最后运用流式细胞技术检测细胞表面CD4的表达水平。结果:(1)GST-pulldown结果验证了Nef与hnRNPK存在相互作用;(2)Nef的表达使细胞表面CD4水平下降约75%;(3)不管是否有Nef,hnRNPK的敲低都使细胞表面CD4表达水平明显下降(50%);同样的,Nef下调CD4的作用也不受hnRNPK敲低的影响。结论:(1)hnRNPK与Nef相互作用;(2)hnRNPK有利于细胞表面CD4的表达,其与Nef的下调作用的关系尚不明确,Nef对CD4的下调作用可能涉及有其他因素参与的复杂调控。     

PinX1的原核表达、纯化及其与hTERT的相互作用

目的:原核表达人Pin2/TRF1结合蛋白X1(PinX1),确定该蛋白与人端粒酶逆转录酶(hTERT)催化亚基的相互作用。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增PinX1基因的编码序列,克隆至pET-32a载体构建重组质粒pHisPinX1,经双酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测His-PinX1的表达;用His磁珠纯化His-PinX1,在人肾胚细胞293T内检测His-PinX1与hTERT的相互作用。结果:扩增得到980 bp的PinX1基因;Western印迹检测表明,相对分子质量约57×103的His-PinX1获得表达,且纯化的His-PinX1与hTERT具有相互作用。结论:表达并纯化得到了与hTERT相互作用的His-PinX1,为深入研究PinX1的功能奠定了基础。     

杆状病毒经口感染因子之间相互作用分析

昆虫杆状病毒包涵体衍生型病毒(Occlusion-derived virus,ODV)被幼虫食下后通过感染中肠上皮细胞引发全身感染,这个过程被称为经口感染。多种ODV囊膜蛋白在经口感染中发挥关键作用,它们被称为经口感染因子(PIFs)。研究表明7种PIFs:P74、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF6、P95(Ac83)和2种ODV特异性蛋白,Ac5和Ac108,与ODV表面复合物相关,该复合物被称为PIF复合物。阐明杆状病毒PIFs之间,尤其是复合物各个成分之间的相互作用特点是了解经口感染因子功能的关键。本研究以杆状病毒模式种-苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,Ac MNPV)为研究对象,利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术探究了与PIF复合物相关的9种蛋白之间相互作用的特点。我们鉴定到了6对相互作用,分别为PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF1-P95、PIF2-PIF3和PIF3-PIF4,但是没有鉴定到P74、PIF6、Ac5和Ac108参与相互作用。其中PIF1-PIF3、PIF2-PIF3和PIF1-P95为强相互作用,其他相互作用为中等强度相互作用。根据这些结果我们推测PIF1是PIF复合物的中心,其他成分都和PIF1存在相互作用。最后,我们对目前为止已报道的PIF之间相互作用进行了总结,包括10对不同蛋白之间的相互作用:PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF1-P95、PIF2-PIF3、PIF3-PIF4、ODV-E56-PIF1、ODV-E56-PIF2、ODV-E56-PIF3和ODV-E56-P74,以及2对自相互作用:PIF3-PIF3和ODV-E56-ODV-E56。总之,本研究探索了PIF复合物中蛋白质的相互作用特点,揭示了复合物中各成分如何通过相互作用有机地结合在一起,推进了对该复合物的认识。     

人Trim5α嵌合体蛋白与HIV-1gag蛋白体外分子间相互作用的鉴定

目的:表达和纯化人TRIM5α嵌合体蛋白［TRIM5α-H(R328-332)］,并探讨该蛋白和HIV-1gag间的相互作用。方法:将构建的TRIM5α嵌合体pET-28a-TRIM5α-H(R328-332),转化大肠杆菌BL21(DE3) ,获得重组表达质粒pETTRIM5α-H(R328-332),30℃下经IPTG诱导,该融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。获得的重组的蛋白再经过纯化,SDS-PAGE分析重组蛋白,并用免疫共沉淀技术和ELISA等检测重组蛋白与HIV-1 gag间的相互作用。结果:构建的重组质粒在大肠杆菌中获得表达,重组TRIM5α-H(R328-332)蛋白经纯化复性后,通过免疫共沉淀和ELISA等技术,证明TRIM5α-H(R328-332)蛋白能够与HIV-1gag间的相互作用。 结论:在大肠杆菌表达系统中成功表达了重组TRIM5α-H(R328-332)蛋白,并且证实其在体外与HIV-1gag有结合作用。[摘要]　目的:表达和纯化人Trim5α嵌合体蛋白[Trim5α H(R328-332)],并探讨该蛋白和HIV-1gag间的相互作用。方法:将构建的Trim5α嵌合体pET 28a Trim5α H(R328-332),转化大肠杆菌BL21(DE3) ,获得重组表达质粒pETTrim5α H(R328-332),30℃下经IPTG诱导,该融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。获得的重组的蛋白再经过纯化,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白,并用免疫共沉淀技术、His pull down和ELISA等检测重组蛋白与HIV-1gag间的相互作用。结果:构建的重组质粒在大肠杆菌中获得表达,经纯化后的重组Trim5α H(R328-332)蛋白纯度可达90%以上。通过免疫共沉淀、GST pull down和ELISA等技术,证明Trim5α H(R328-332)蛋白能够与HIV-1gag间的相互作用。 结论:本实验在大肠杆菌表达系统中成功表达了重组Trim5α H(R328-332)蛋白,并且证实其在体外与HIV-1gag有结合作用。     

与雌激素受体β相互作用的蛋白的分离及鉴定

目的:从乳腺文库中分离与雌激素受体β(ERβ)相互作用的蛋白质。方法:将ERβ基因克隆入酵母表达载体pGBKT7中,利用酵母双杂交筛选技术,从乳腺文库中分离与ERβ相互作用的蛋白质。结果:分离到与ERβ相互作用的蛋白质FBLN1,并进一步确定了ERβ与FBLN1作用的结构域为AF1及DBD结构域。结论:FBLN1可能参与ERβ信号途径并共同调节细胞的增殖。ERβ与FBLN1相互作用的发现为进一步研究ERβ与FBLN1在生理及病理中的作用奠定了基础。     

植物邻体间的正相互作用

植物间的正负相互作用是构建植被群落的重要因素,也是群落生态学研究的中心内容之一。近20a来,植物间正相互作用的研究得到快速发展。综述了正相互作用的定义,不同植物群落中的直接、间接正相互作用及其发生机制,正相互作用研究的实验和模型方法,正负相互作用随胁迫梯度的变化及正相互作用对群落构建的影响。探讨了正相互作用研究前景:(1)进一步理解正负相互作用的平衡及其对群落构建的影响;(2)加深对全球变暖背景下的正相互作用的认识;(3)需把正相互作用研究同进化联系起来;(4)充分发挥正相互作用在生态系统中的推动力作用,把正相互作用应用到生态恢复中,为恢复退化生态系统服务。     

胰高血糖素样肽-1与受体相互作用研究进展

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)具有促胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、刺激胰岛β细胞的增殖和分化、抑制β细胞凋亡、抑制胃排空等作用,近年来成为治疗糖尿病药物研究中的热点。GLP-1与受体的相互作用一直备受关注,我们从4个方面对GLP-1与受体相互作用的研究进行了综述:GLP-1的二级结构、GLP-1单个残基改变及残基间的相互作用、GLP-1不同残基片段对GLP-1结合并激活受体的影响和GLP-1受体的相互作用模式。     

冠状病毒核衣壳蛋白与延伸因子-1α的相互作用

目的:分析SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)和229E冠状病毒(HCoV-229E)核衣壳蛋白与细胞延伸因子(EF)-1α的相互作用、翻译抑制效应及与多核细胞形成的关系。方法:构建、表达及纯化SARS-N蛋白和229E-N蛋白的GST融合蛋白,用GST-pull down方法分析其与过表达的EF-1α及内源EF-1α之间的相互作用;构建和表达SARS-N蛋白和229E-N蛋白的GFP融合表达载体,转染293T细胞,通过共聚焦显微镜分析SARS-N蛋白和229E-N蛋白的亚细胞定位及多核细胞的形成;在293T细胞中过表达SARS-N蛋白或229E-N蛋白,通过Co-IP分析其与EF-1α的相互作用。分别在细胞内和体外翻译系统中分析二者抑制报告基因翻译的程度。结果:SARS-N蛋白和229E-N蛋白都定位于细胞质,并不像其他冠状病毒的N蛋白那样定位到细胞核;二者都能诱导形成多核细胞,但229E-N蛋白导致细胞形成多核细胞的时间要晚;二者都能与EF-1α相互作用并且共定位于细胞质,二者都能导致EF-1α形成多聚体;二者在细胞内及细胞外对报告基因都有抑制翻译效应。结论:SARS冠状病毒和229E冠状病毒的核衣壳蛋白均定位于细胞胞质,可与EF-1α相互作用,导致EF-1α形成多聚体,抑制报告基因翻译及导致细胞形成多核。     

以番茄斑萎病毒核蛋白为靶点的荧光偏振药物筛选体系的建立及应用

目的:基于荧光偏振技术建立靶向番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)核蛋白(NP)与核酸相互作用的药物筛选体系,并应用该体系展开药物筛选。方法:将目的基因克隆到pGEX-6p-1表达载体上,并采用大肠杆菌表达系统进行目的蛋白的异源表达。建立靶向TSWV NP与核酸相互作用的荧光偏振药物筛选体系,对体系的结合时间、DMSO耐受、变异性和稳定性进行研究,并展开药物筛选。结果:成功构建重组质粒pGEX-6p-1-NP,在大肠杆菌中表达并分离纯化出高质量的核蛋白。基于荧光偏振技术建立了信噪比为8∶1,Z因子为0. 82的稳定的靶向TSWV NP与核酸相互作用的药物筛选体系,并对化合物库中1 000种化合物展开药物筛选,经过初步筛选获得了1种IC_(50)为4. 15μmol/L的化合物。结论:建立了稳定的荧光偏振筛选体系,适用于靶向NP与核酸相互作用的药物的筛选。筛选到的化合物为番茄斑萎病毒的预防和控制提供参考。     

蛋白质相互作用数据库北大核心CSCD

随着"蛋白质组学"的蓬勃发展和人类对生物大分子功能机制的知识积累,涌现出海量的蛋白质相互作用数据。随之,研究者开发了300多个蛋白质相互作用数据库,用于存储、展示和数据的重利用。蛋白质相互作用数据库是系统生物学、分子生物学和临床药物研究的宝贵资源。本文将数据库分为3类:(1)综合蛋白质相互作用数据库;(2)特定物种的蛋白质相互作用数据库;(3)生物学通路数据库。重点介绍常用的蛋白质相互作用数据库,包括BioGRID、STRING、IntAct、MINT、DIP、IMEx、HPRD、Reactome和KEGG等。     

降脂中药复方的转运性相互作用——体外MDR1转运研究

目的:药物相互作用是影响药物安全和药效的重大因素之一。本文旨在通过体外MDR1研究方法——ATP酶法,评价降脂中药复方(Fang-2)及其单方6个饮片水提物与P-gp的相互作用,为临床中西药转运性相互作用提供参考。方法:应用标准化制备技术,制备降脂中药复方及其6个饮片水提物。利用基于MDR1膜的ATP酶法,计算MDR1细胞膜的ATP酶活性,考察药物与P-gp的相互作用。结果:1 mg·mL-1、10 mg·mL-1两个浓度中药复方的ATP酶活性分别为27.2、40.0 nmol Pi·min-1·mg-1protein,呈浓度依赖性。6个单方中,泽泻、厚朴、夏枯草与P-gp作用显著,其强弱顺序为:泽泻夏枯草厚朴(50.642.640.0 nmol Pi·min-1·mg-1protein)。泽泻单体23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇A均与P-gp有较强的相互作用,ATP酶动力学研究显示其Km值和Vmax值分别为0.79±0.28μM,2.01±0.67μM和50.57±3.72 nmol Pi·min-1·mg-1protein,56.28±29.6 nmol Pi·min-1·mg-1protein。结论:Fang-2与MDR1存在相互作用,其中泽泻为主要被MDR1转运的饮片,泽泻的有效组分23-乙酰泽泻醇B和24-乙酰泽泻醇A均是MDR1底物。表明该降脂中药与临床上其他降脂药物的联用时应充分考虑MDR1介导的转运行相互作用,为临床用降脂药物提供参考和依据。     

MDM2与端粒保护蛋白1的相互作用及其功能

目的:探究鼠双微体2同源体(MDM2)与端粒保护蛋白1(POT1)在细胞水平是否有相互作用,及其是否发挥E3泛素化连接酶的功能。方法:首先,用蛋白酶体抑制剂MG132处理稳定表达Flag-POT1的HeLa细胞,Western印迹检测Flag-POT1的表达情况;其次,在HeLa细胞中转入外源的Myc-MDM2和Flag-POT1质粒,48 h后收集细胞,通过免疫共沉淀方法验证Myc-MDM2和Flag-POT1是否具有相互作用;再次,在稳定表达Flag-POT1的HeLa细胞中转入Myc-MDM2或MDM2 siRNA,48 h后收集细胞,Western印迹检测Flag-POT1的表达水平。结果:MG132处理后,Flag-POT1的表达量明显升高且有拖尾现象,免疫共沉淀显示Myc-MDM2和Flag-POT1具有相互作用,但无论转入Myc-MDM2还是MDM2 siRNA,Flag-POT1的表达水平没有明显变化。结论:POT1通过泛素化途径降解,MDM2与POT1具有相互作用,但MDM2不是POT1主要的E3泛素化连接酶。