重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2 α亚基     

人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定

通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒 (命名为pTCKA′) .将其转化BL2 1(DE3)菌 ,IPTG诱导后未见高效特异表达 .然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体 ,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达 .Western印迹结果证明 :该蛋白能与兔抗人CK2α′3 3 3 3 50 肽段抗血清发生特异性免疫反应 .采用GSH Sepharose 4B柱纯化 ,凝血酶酶切 ,最后从 4g细菌获 4 4mg纯化重组蛋白 .通过性质鉴定和酶动力学分析证明 :克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基 .     

酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白——泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶. 为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验. 以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因（UBA52）的cDNA序列有高度同源性（100％）. GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用. 本实验证明,人泛素-52氨基酸（UBA52）融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白, 它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中.     

重组人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与测序

蛋白激酶ＣＫ２是一种存在的信使非依赖性丝／苏氨酸蛋白激酶．它是由两个催化亚基（α或α′）和两个调节亚基（β）组成的不均一四聚体．用反转录ＰＣＲ从ＨＬ－６０细胞中获得了人蛋白激酶ＣＫ２β亚基编码区ｃＤＮＡ,将ＮｄｅⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切ＰＣＲ产物连接到表达载体ｐＴ７－７的ＮｄｅⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切位点中．转化感受态细菌ＤＨ５α获得转化子,阳性筛选率为７２％．限制性酶切分析结果表明,插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符．随机挑选４个阳性质粒测定其插入片段ＤＮＡ序列,结果显示有２个含有正确插入的人蛋白激酶ＣＫ２βｃＤＮＡ,命名为ｐＴＣＫＢ．其余２个克隆分别存在１个和２个点突变,即在其编码区ｃｏｎｄｏｎ１４８的ＴＣＡ→ＴＴＡ,结果Ｓｅｒ→Ｌｅｕ;另一个则在Ｃｏｎｄｏｎ１４３ＧＴＧ→ＡＴＧ,Ｖａｌ→Ｍｅｔ;Ｃｏｎｄｏｎ１７０ＧＴＧ→ＧＣＧ,Ｖａｌ→Ａｌａ．重组质粒（ｐＴＣＫＢ）克隆的成功,将为在原核细胞中表达蛋白激酶ＣＫ２β亚基以及利用ＣＫ２βｃＤＮＡ作为探针进行深入研究打下基础．并为利用ｐＴ７－７表达载体构建其他重组质粒建立了一套成功的方法     

蛋白激酶CK2α在人喉癌细胞Hep-2中的表达及意义

目的研究蛋白激酶CK2α(Protein kinase CK2α,PK-CK2α)在人喉癌细胞Hep-2中的表达,探讨其与喉癌之间的关系。方法体外培养Hep-2细胞和Hacat细胞,应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分别检测蛋白激酶CK2αmRNA在Hep-2细胞和Hacat细胞中的表达;应用免疫细胞化学技术分别检测蛋白激酶CK2α蛋白在Hep-2细胞和Hacat细胞中的表达。结果蛋白激酶CK2αmRNA在Hep-2细胞中高表达,在Hacat细胞中低表达,差异有统计学意义(P<0.01)。蛋白激酶CK2α蛋白在Hep-2细胞中高表达,在Hacat细胞中低表达,差异有统计学意义(P<0.01)。结论蛋白激酶CK2α过表达可能与喉癌的发生和发展有关。     

揭示蛋白激酶CK2生物学功能——亚基敲除/敲减

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,可催化细胞内多种蛋白质的磷酸化,由2个催化亚基CK2α或α′以及2个调节亚基CK2β组成的异源四聚体结构。为深入了解CK2的结构与功能,通过运用同源重组敲除、条件性敲除及RNAi引起的基因敲减技术分别对其3个亚基进行敲除与抑制,发现在CK2亚基敲除与抑制后,可对个体生殖、胚胎发育、肿瘤、代谢以及衰老造成重要的影响,说明CK2各亚基具有重要的生物学功能。本文就敲除与敲减蛋白激酶CK2任一亚基后其功能变化的进展作一综述。     

揭示蛋白激酶CK2生物学功能——亚基敲除/敲减北大核心CSCD

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,可催化细胞内多种蛋白质的磷酸化,由2个催化亚基CK2α或α'以及2个调节亚基CK2β组成的异源四聚体结构。为深入了解CK2的结构与功能,通过运用同源重组敲除、条件性敲除及RNAi引起的基因敲减技术分别对其3个亚基进行敲除与抑制,发现在CK2亚基敲除与抑制后,可对个体生殖、胚胎发育、肿瘤、代谢以及衰老造成重要的影响,说明CK2各亚基具有重要的生物学功能。本文就敲除与敲减蛋白激酶CK2任一亚基后其功能变化的进展作一综述。     

酵母RNA聚合酶ⅡRpb2和Rpb3两亚基间相互作用位点的定位

为研究S .pombeRNApolⅡ各亚基间体内装配成复合体的机制 ,本文首次用酵母双杂交系统鉴定了Rpb2和Rpb3两亚基间体内相互作用的位点。首先将Rpb2的 4个片段克隆至Gal4BD表达载体pAS2上 ,构建BD Rpb2片段融合蛋白重组质粒 ;同时将Rpb3克隆至Gal4AD表达载体pGADGH上 ,构建AD Rpb3融合蛋白重组质粒。其次 ,将pGADGHRpb3分别与pAS2Rpb2各片段重组质粒共转化到受体酵母菌Y1 90感受态细胞内 ,筛选并鉴定β gal活性阳性 (β gal+)的共转化子。最后 ,将β gal+共转化子中的Rpb2片段进行序列分析并进行同源序列比较确定其在Rpb2中的位置。结果表明 ,Rpb2与Rpb3相互作用的位点位于Rpb2的 90 2～ 989aa肽段内     

重组人CK2β亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的重组质粒, 转化大肠杆菌BL21 (DE3), 在IPTG诱导下表达. 表达蛋白大多数以不溶形式存在. 6L(约10.2 g)表达菌抽提得到约20 mg的可溶性表达产物, 通过P11磷酸纤维素一步层析分离, 得到6.8 mg纯化蛋白. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化的蛋白为一分子质量26 ku的单一蛋白带.蛋白质印迹结果证明：纯化的表达产物与抗人CK2β抗体可发生特异性免疫反应. CK2β亚基对CK2α有激活作用, 纯化的CK2α和β亚基在等摩尔混合时即可组成有最大生物活性的全酶. 实验结果有力地证明了克隆表达与纯化的重组蛋白是人蛋白激酶CK2β亚基.     

用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体ATP合酶CF1各亚基间的相互作用

将菠菜叶绿体ATP合酶CF1的5种亚基基因分别插入到质粒pGBT9和pGAD424,双转化入酵母菌株,用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体CF1各亚基间的相互作用.结果显示CF1的5种亚基中,γ与ε亚基有较强的相互作用;α与β,α与ε,β与ε,β与δ亚基间也有稳定的相互作用;γ与δ,δ与ε亚基间有微弱的或短暂的相互作用;而α与γ,α与δ,β与γ等亚基间在酵母双杂交系统中没有相互作用.这些结果有助于研究ATP合酶在催化过程中的结构变化和亚基间的相互关系.     

蛋白磷酸酶2A的亚基功能

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是一种由催化亚基C、结构亚基A和多种功能特异的调节亚基B组成的全酶复合物,其在基因表达、细胞增殖分化和信号转导等方面有重要调控作用.各种不同亚基组成功能各异的PP2A全酶,调控不同的细胞功能.各亚基在PP2A功能调控中均起关键作用.本文重点介绍PP2A各个亚基在PP2A生物学功能实现中的作用.     

蛋白激酶CK2与DNA断裂修复

蛋白激酶CK2（酪蛋白激酶Ⅱ）是真核细胞中普遍存在的一种信使非依赖的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,它底物众多,功能广泛。DNA断裂修复是一个涉及很多种酶和蛋白的过程,CK2在其中起着很重要的作用。     

蛋白激酶Cα相互作用蛋白的结构与功能

蛋白激酶Cα相互作用蛋白（protein interacting with Cα kinase,PICK1）是蛋白激酶Cox（protein kinase Cα,PKCα）的靶蛋白之一,也是在PKCα和突触后膜受体蛋白间起重要作用的衔接蛋白。PICK1分别由PDZ结构域、BAR结构域以及卷曲螺旋区和酸性氨基酸区组成。PICK1中的PDZ结构域和受体蛋白、转运蛋白、衔接蛋白的相互作用报道较多,BAR结构域则与支架蛋白、质膜等相互作用。PICK1在突触可塑性、神经递质传递、外周神经感觉、细胞生长和黏连等方面发挥重要作用。本文对PICK1的结构和功能进行综述。     

中科院上海生命科学研究院揭示端粒酶蛋白亚基与RNA亚基的相互作用

<正>2014年5月4日,Nature Structural and Molecular Biology在线发表中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所/国家蛋白质科学中心·上海(筹)雷鸣研究组的研究成果,揭示了端粒酶催化蛋白亚基与RNA亚基识别机制在进化上的保守性。这是目前相关研究领域关于端粒酶中蛋白-RNA复合物的首次晶体结构报道,其在分子水平上所提供的信息解决了长期困扰人们的端粒酶蛋白亚基与RNA亚基之间是如何相互作用的难题,为治疗端粒相关疾病的新型药物的研发开辟     

NLS-RARα蛋白相互作用蛋白的筛选与验证

急性早幼粒细胞白血病(APL)具有特征性染色体易位,产生的PML-RARα融合基因在其发生发展中有重要作用．PML-RARα融合蛋白在细胞内被中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)切割为PML突变蛋白(核定位信号NLS缺失)和RARα突变体 (NLS-RARα,包含有PML的核定位信号),这两段蛋白质在APL的发生中可能具有重要作用．为进一步研究NLS-RARα的生物学功能,运用酵母双杂交技术在白血病cDNA文库中筛选与其作用的蛋白质．首先PCR技术扩增NLS-RARα编码序列,克隆至诱饵载体pGBKT7,测序鉴定后将其转化酵母AH109．免疫印迹检测到诱饵蛋白表达后,将含有诱饵载体的AH109与含有白血病cDNA文库的酵母Y187交配,在含有X-α-gal的营养缺陷性培养基上选择和筛选二倍体酵母．经回转实验和测序分析验证得到8个与NLS-RARα相互作用的蛋白质．为进一步验证这些相互作用,克隆其中的JTV-1蛋白,利用间接免疫荧光,GST pull-down和免疫共沉淀技术成功验证了它与NLS-RARα的相互作用．为进一步探讨APL的发生机制提供了新的线索．     

Tyrphostin AG213对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制动力学

利用基因工程克隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和 β亚基 ,在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组人CK2全酶 .以重组人CK2全酶为分子靶点 ,研究tyrphostinAG2 13对该全酶的直接作用及其抑制动力学 .通过测定转移到CK2底物上的 [γ 3 2 P]GTP的 [3 2 P]放射活度 ,检测CK2活性 .结果表明 :重组人CK2是一种Ca2 + 、cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶 ,与天然CK2的性质一致 .AG2 13对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用 ,IC50 为 1 1μmol L ,抑制作用远大于已知CK2的抑制剂 5 ,6 二氯 1 β 呋喃糖苯并咪唑 (DRB)和N (2 氨乙基 ) 5 氯萘 1 硫胺 (A3) .AG2 13对重组人CK2全酶的动力学研究表明 :它与GTP呈现非竞争 竞争性混合型抑制作用 ,抑制常数Ki 和Ki′值分别为 0 6 μmol L与 1 4 μmol L ;与酪蛋白呈非竞争性抑制作用 ,Ki 值为 0 9μmol L .结果说明 ,tyrphostinAG2 13不仅是酪氨酸蛋白激酶的抑制剂 ,而且是一种十分有效的蛋白激酶CK2的抑制剂 .重组人蛋白激酶CK2可作为一种较为简便筛选和开发有效的CK2抑制剂的分子靶点 .     

环指蛋白RING1与A型核纤层蛋白的细胞内相互作用

环指蛋白RING1能结合DNA并抑制基因的转录.采用酵母双杂交方法从人骨骼肌文库中筛选出了与A型核纤层蛋白(lamin A)结合的RING1蛋白,回复杂交酵母能在缺陷培养基上生长.RING1与绿色荧光蛋白融合载体转染HEK293细胞,激光共聚焦显微观察发现RING1能与带红色荧光蛋白的lamin A蛋白在细胞核周围共定位.免疫共沉淀结果证明RING1与lamin A能够相互作用.结果证明了一个新的lamin A结合蛋白,为揭示lamin A影响基因表达乃至细胞衰老提供了依据.     

黄色黄素抑制人白血病HL-60细胞内蛋白激酶CK2的实验研究

蛋白激酶CK2在寻找抗肿瘤及抗病毒药物方面是一个具有吸引力的分子靶点,其特异性抑制剂具有潜在的临床应用价值.通过测定药物作用后转移到CK2底物上[γ-32P]ATP的放射性活度,探讨黄色黄素对重组人CK2全酶以及细胞内CK2活性的影响;采用多重RT-PCR检测CK2α、α'和β亚基的mRNA表达水平;Lineweaver-Burk作图法分析CK2的酶动力学机制.发现黄色黄素能显著抑制重组人CK2全酶(IC50=0.86μmol/L)以及HL-60细胞内的CK2活性,其作用效果均强于阳性对照TBB.另外,黄色黄素作用2h可使CK2α和α'亚基的mRNA表达下降,对β亚基则无明显的影响.酶动力学分析表明,黄色黄素与ATP呈竞争性抑制CK2的活性,与酪蛋白则呈混合性抑制CK2的活性.研究说明,黄色黄素是一种有效的细胞内蛋白激酶CK2抑制剂.     

疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b

目的采用疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b,去除干扰素样品中的二聚体,得到高纯度的干扰素用于进一步的研究。方法首先采用阳离子交换层析纯化复性重组人干扰素α2b,去除了大部分的杂蛋白,然后采用疏水相互作用层析纯化重组人干扰素α2b,去除复性过程中产生的错误折叠体和二聚体,并考察盐浓度、pH值、流速和洗脱液中尿素对疏水相互作用层析纯化效果的影响。结果硫酸铵初始浓度1.2 mol/L、缓冲液pH值6.0、流速2.5 mL/min、洗脱液中添加尿素浓度为2 mol/L时疏水相互作用层析纯化效果最佳。最终得到的重组人干扰素α2b非还原型SDS-PAGE电泳均呈单一条带。结论确定了疏水层析纯化重组人干扰素α2b的最优条件,成功提取到具有高活性、高纯度的重组人干扰素α2b纯品。