炭疽活疫苗家兔免疫力与血清抗芽胞IgG关系的研究

炭疽疫苗是预防炭疽流行和炭疽生物恐怖的重要手段。已有动物实验表明,炭疽活疫苗的保护力优于以保护性抗原为主要成份的无细胞疫苗,但两类现行疫苗都有待重新评价和改进。炭疽疫苗的效力必须用适当的实验室方法进行检测与分析才能了解其性质和细节。试验中力图探寻炭疽活疫苗家兔免疫力与血清抗芽胞抗体水平的关系。用“皮上划痕人用炭疽活疫苗”免疫家兔,以特定制备的炭疽芽胞抗原用ELISA法检测血清抗炭疽芽胞IgG抗体水平,并用强毒炭疽杆菌攻击进行效力试验。免疫家兔血清几何平均抗芽胞IgG滴度在免疫后一个月内持续升高,14d达到206,28d时达到776,这时其抵抗20MLD毒菌攻击的保护率为80％,符合中国生物制品规程要求的保护力。一个月后抗体水平开始下降,42d时滴度降至223。实验所揭示的炭疽减毒活疫苗诱导的家兔抗芽胞IgG抗体与抗炭疽保护力之间的关系,既为评价现行疫苗提供了资料,也为研制新型疫苗建立了参考性指标。     

炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建

为制备炭疽芽胞杆菌的基因芯片探针文库,以炭疽芽胞杆菌毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02为原材料,用Sau3A I酶切pX01和pX02质粒DNA,Taq DNA聚合酶72℃补平加A,经AT克隆,PCR初步鉴定筛选出炭疽质粒片段的阳性克隆．DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定;用生物信息学方法对其片段进行同源性分析;并将克隆的探针打印于玻片上,制备成炭疽芽胞杆茵基因芯片,与炭疽杆茵质粒DNA样品进行初步芯片杂交的实验,杂交实验的阳性率达到了90％以上,证明大部分克隆探针属于炭疽芽胞杆菌．炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建为基因芯片探针的制备摸索出一条简便、高效、可行的方法．     

炭疽灭活和裂解芽胞抗原免疫家兔后血清中的IgG抗体应答

炭疽杆菌芽胞在炭疽免疫中发挥基本作用。实验中以炭疽活芽胞疫苗为原形,建立了制备灭活和裂解炭疽芽胞的方法,研究了各种灭活和裂解炭疽芽胞疫苗不同浓度、不同剂次免疫家兔的抗芽胞和毒素IgG应答,总结分析了各种灭活和裂解炭疽芽胞疫苗用于新疫苗成分之一的可能性。甲醛灭活炭疽芽胞疫苗设芽胞浓度2.5×108剂量组、5×108剂量组、1×109剂量组,于0、4、8周时3次免疫。在3剂免疫后血清抗炭疽芽胞IgG水平持续升高,首次免疫后4、8、12周时家兔血清中抗芽胞IgG几何平均滴度可达到600～16000。裂解炭疽芽胞疫苗的制备和动物免疫中,只采取了2.5×108芽胞浓度,两剂免疫,免疫时间为0、4周。在首次免疫后4、8、12周时家兔血清中抗芽胞IgG几何平均滴度分别为362、776和388。各时间点采集的家兔血清未能测出或只测出极微量的抗炭疽毒素IgG。通过上述研究认为,以裂解炭疽芽胞抗原作为炭疽疫苗成分之一,其抗原性和免疫原性是适宜的;免疫剂量可以设定为2.5×108芽胞浓度上下;免疫次数可定为2剂间隔1个月。     

炭疽杆菌检测方法的研究现状与展望

炭疽是严重威胁人类健康的烈性传染病,其病原体为炭疽芽孢杆菌。炭疽芽孢杆菌在我国公布的《人间传染的病原微生物名录》中被列为第二类病原微生物(高致病性病原微生物),其芽孢可作为生物战剂和生物恐怖的原材料,因此,发展灵敏、高效的炭疽杆菌检测方法十分重要和紧迫。按检测的靶标分类,针对炭疽杆菌的检测方法主要有四大类:针对炭疽杆菌芽孢的检测方法,针对细菌繁殖体的检测方法,针对炭疽杆菌基因的检测方法和针对炭疽毒素蛋白的检测方法。其中,针对炭疽杆菌芽孢和细菌繁殖体的检测已经有比较成熟的方法,但其在特异性以及临床的实用性方面难以令人满意;针对炭疽杆菌基因的检测技术在特异性和灵敏度上有较大的提高,但在临床诊断等方面还有欠缺;而针对炭疽毒素蛋白的检测技术的发展,使得直接对炭疽杆菌的主要致病因子的检测成为可能,这对于临床诊断以及流行病学研究具有重要意义。本文对当前炭疽杆菌检测方法的最新进展做了简要的归纳,关注了不同检测方法的适用范围和检测能力,并展望了相关领域的发展趋势,希望能为从事炭疽杆菌检测方法研究的同行提供参考和帮助。     

制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的初步研究

建立制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的技术,并探讨研制检测炭疽芽胞杆菌基因芯片的方法。酶切炭疽芽胞杆菌的毒素质粒和荚膜质粒,通过建立质粒DNA文库的方法获取探针,并打印在经过氨基化修饰的玻片上,制成用于炭疽芽胞杆菌检测的基因芯片。收集了290个阳性克隆探针,制备了检测炭疽芽胞杆菌的基因芯片。提取炭疽芽胞杆菌质粒DNA与基因芯片杂交,经ScanArray Lite芯片阅读仪扫描得到初步的杂交荧光图像。通过分析探针的杂交信号初步筛选出273个基因片段作为芯片下一步研究的探针。     

炭疽芽胞杆菌A16D2株BA2380基因缺失突变株的构建

本课题组早期研究结果表明,炭疽芽胞杆菌BA2380蛋白可能与炭疽芽胞杆菌毒力有关,因而有必要对其功能进行深入研究。选取炭疽芽胞杆菌A16D2株为出发菌株,以其BA2380基因为目的缺失基因,参照A16D2株基因组序列及质粒pSET4s序列,利用软件设计上下游同源臂及抗性基因引物,用本实验室改造的“Golden Gate”克隆方法将3个片段同时连入温敏型穿梭载体pKMBK中(本实验室构建的受体质粒),从而构建基因打靶质粒。将该基因打靶质粒导入炭疽芽胞杆菌A16D2感受态细胞中,利用同源重组原理,筛选获得炭疽芽胞杆菌A16D2 BA2380基因缺失突变株,并对其进行验证。结果验证了本课题组构建的“Golden Gate”克隆体系进行多片段克隆的高效性,也为后续探索其基因功能奠定了基础。     

炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)检测质粒的构建及其应用

根据炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)毒性质粒pX01和pX02上的2个毒力相关基因cya和capA的序列特点,以pIJ2925为出发载体,采用一步重叠延伸PCR技术(One-step Overlap Extension PCR,简称OOE-PCR)构建了包含cya基因和capA基因保守区DNA片段的炭疽检测质粒pBIB2006。采用复合PCR对模拟炭疽危险品进行分析,结果表明pBIB2006可以为炭疽芽胞杆菌的检测提供准确、安全和方便的阳性参照品,从而为检测炭疽芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌灭活疫苗提供了便利。     

炭疽芽胞杆菌BslA(260－652)蛋白的表达纯化与黏附功能鉴定

【目的】克隆表达炭疽芽胞杆菌BlsA的功能区片段并对其生物学功能进行鉴定。【方法】以炭疽芽胞杆菌A16R基因组DNA为模板PCR扩增bslA(260-652)基因片段,克隆至pET-28a(+)载体。将成功构建的重组质粒转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,诱导表达后收集菌体经超声破碎后,对可溶表达部分用镍柱进行亲和层析纯化。以纯化后的蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠制备该蛋白的多抗,用ELISA和Western blot检测抗血清;使用间接免疫荧光实验和细菌黏附实验研究目标蛋白及其抗体的生物学功能。【结果】BslA(260-652)获得了可溶性表达,纯化后纯度约为87.4%。以纯化蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠制备的抗血清ELISA效价可达1∶20000。将BslA(260-652)蛋白与Hela细胞共孵育后,能够直接和Hela的细胞膜结合。细菌黏附实验表明BslA(260-652)蛋白及其相应的多抗血清都能够显著地抑制炭疽芽胞杆菌A16R对Hela细胞的黏附。【结论】大肠杆菌表达得到的炭疽芽胞杆菌BslA(260-652)蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性,为深入研究BslA蛋白在炭疽芽胞杆菌致病过程中的作用奠定实验基础。     

抗炭疽保护性抗原单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

目的:克隆并分析抗重组炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)单克隆抗体4B2、5E1和2A8轻、重链可变区基因。方法:从分泌抗rPA特异性单抗的杂交瘤细胞株4B2、5E1和2A8中提取总RNA;利用RT-PCR技术克隆抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,并将其连入pMD18-T载体中进行测序分析。结果:4B2VL基因全长378bp,VH基因全长414bp;5E1VL基因全长420bp,VH基因全长426bp;2A8VL基因全长384bp,VH基因全长342bp。通过分析,这些基因均符合小鼠IgGV区基因的特征,含有4个框架区、3个抗原互补决定区,而且抗体特征性的半胱氨酸残基的数量和位置也正确。结论:克隆了抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。     

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracis AP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水甲和蛋白质水半进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在B.anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.     

炭疽芽胞杆菌mntA基因缺失突变株的构建及鉴定

目的:通过同源重组的方法敲除炭疽芽胞杆菌减毒AP422株的mntA基因,使菌株进一步减毒,用于构建新的疫苗候选株。方法:利用PCR方法扩增mntA基因上下游同源臂后与温敏质粒连接,构建打靶载体,并转化炭疽芽胞杆菌减毒AP422株;利用抗生素和温度2种选择压力实现同源重组,敲除目标基因mntA,然后利用Cre-LoxP系统去除抗性筛选标记,得到无抗性标记的缺失突变株,并利用PCR和Western印迹等方法对重组菌进行系统鉴定,最后分析突变株的生物学性状。结果:敲除了AP422株的mntA基因,获得了无抗性标记的缺失突变株,突变株的生存竞争能力比原始菌株明显减弱。结论:突变株获得了进一步减毒,可用于构建新的疫苗候选株。     

炭疽杆菌保护性抗原（PA）重组腺病毒的构建及免疫效果分析

探讨利用腺病毒载体作为炭疽杆菌基因工程疫苗载体的可行性。从载体pcDNA3.1-PA上PCR扩增PA片断,将该片断克隆入质粒pAdTrack-CMV,得到阳性克隆pAdTrack-PA。PmeI线性化的阳性克隆转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组后得到重组腺病毒vAd-PA。vAd-PA经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,经Western-blot检测表明PA在293细胞中得到表达。重组病毒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法检测血清中产生了特异性抗体,抗体滴度计算几何均数为1:2800。该研究为进一步研究以腺病毒为活载体的疫苗奠定了基础。     

炭疽杆菌保护性抗原(PA)重组腺病毒的构建及免疫效果分析

探讨利用腺病毒载体作为炭疽杆菌基因工程疫苗载体的可行性.从载体pcDNA3.1-PA上PCR扩增PA片断,将该片断克隆入质粒pAdTrack-CMV,得到阳性克隆pAdTrack-PA.PmeI线性化的阳性克隆转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组后得到重组腺病毒vAd-PA.vAd-PA经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,经Western- blot检测表明PA在293细胞中得到表达.重组病毒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法检测血清中产生了特异性抗体,抗体滴度计算几何均数为12800.该研究为进一步研究以腺病毒为活载体的疫苗奠定了基础.     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化简

目的：构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到厅sE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果：构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0．1mmol/LIPTG诱导3h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论：实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

炭疽芽胞杆菌染色体特异序列的筛选及实时定量检测

筛选117条炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis)特异序列,经双重特异性验证后得到19条理想的特异序列(genomicsignatures),其中6条符合设计TaqMan探针建立实时定量PCR的要求,根据常规PCR检测结果选择其中C04片段与炭疽芽胞杆菌毒性质粒pX01、pX02上的pagA、capB基因建立实时定量PCR检测体系。经试验证实这一体系检测灵敏度达到每PCR反应10~100个拷贝。利用12种相关菌株评价后获得100%特异性,对10份模拟污染标本和20份对照标本检测,所有污染标本均被检出,所有对照标本均为阴性。此方法特异、灵敏、高效,在炭疽芽胞杆菌感染的诊断和环境污染的检测等领域有潜在的应用前景。     

携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性

用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP,用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白。同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体．pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133．3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高。生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的。