多孔硅Bragg反射镜适配子生物传感器检测心肌肌钙蛋白Ⅰ

通过脉冲腐蚀法制备多孔硅Bragg反射镜,将心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)适配子共价固定到多孔硅Bragg反射镜的孔洞中,发现适配子能与cTnⅠ分子特异性结合.定量分析不同浓度的cTnⅠ与适配子结合后多孔硅Bragg反射镜的反射谱峰位的红移情况.结果表明:基于多孔硅Bragg反射镜适配子生物传感器的光学检测具有良好的特异性,且具有免标记及检测时间短等优异性能.传感器的线性检测范围0.05～4 nmol/L,最低检测限为0.05 nmol/L.     

适配子生物传感器对青霉素的快速检测

将玻碳电极进行阳极氧化和氨基化修饰,通过碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化作用将青霉素适配子结合在电极表面。该适配子电化学生物传感器分子识别能力强、无放射性标记、检测速率快,青霉素类的最佳检测范围是2.81~281 nmol/L,最低检测限为2.81 nmol/L,检测时间为5 m in。     

多孔硅适配子生物传感器的电化学研究

构建1种用于快速检测四环素的新型电化学纳米多孔硅(PS)生物传感器。通过脉冲腐蚀法制得多孔硅基片,将适配子固定于其上,这种四环素适配子能够特异性识别四环素分子,并引起阻抗值的变化。利用电化学交流阻抗法比较固定适配子前后硅片表面阻抗值的变化,以及在体系中加入不同浓度四环素后阻抗谱的变化。选择1个合适的等效电路对测得的阻抗数据进行拟合,获得了四环素浓度与阻抗值的变化规律。传感器的线性检测范围为2.079~62.37 nmol/L,检测限为2.079 7 nmol/L。     

细胞酶联反应法 (cell-ELA) 测定特异结合U87-EGFRvⅢ细胞的适配子的亲和力

通过细胞-指数级富集的配基系统进化(Cell based systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,cell-SELEX)方法从随机文库中筛选得到与稳定过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(Epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)的胶质瘤细胞U87细胞株(U87-EGFRvⅢ)特异结合的DNA适配子。以U87-EGFRvⅢ细胞作为检测对象,筛选到的适配子A15作为检测分子,建立一种细胞酶联反应(Cell enzyme-linked assay,cell-ELA)方法测定适配子的亲和力,并用EGFR抗体作为对照来比较此种DNA适配子的亲和力。结果显示,所测定的DNA适配子A15的解离平衡常数(Equilibrium dissociation constants,Kd)小于100 nmol/L,对U87-EGFRvⅢ细胞的结合能力与抗体相似。Cell-ELA法可较方便地用于cell-SELEX中适配子亲和力的测定。     

多孔硅Bragg反射镜适配子生物传感器检测心肌肌钙蛋白I

通过脉冲腐蚀法制备多孔硅Bragg反射镜,将心肌肌钙蛋白I（cTnI）适配子共价固定到多孔硅Bragg反射镜的孔洞中,发现适配子能与cTnI分子特异性结合。定量分析不同浓度的cTnI与适配子结合后多孔硅Bragg反射镜的反射谱峰位的红移情况。结果表明：基于多孔硅Bragg反射镜适配子生物传感器的光学检测具有良好的特异性,且具有免标记及检测时间短等优异性能。传感器的线性检测范围0．05-4nmol／L,最低检测限为0．05nmol／L。     

血清标志物联合检测在急性冠状动脉综合征诊断中的应用

目的:探讨血清cTnⅠ、CK-MB、MYO及BNP联合检测在急性冠状动脉综合征诊断中的临床价值。方法:选择临床及冠状动脉造影明确诊断的ACS患者76例,稳定性心绞痛患者32例,同期选择35例健康体检者作实验对照组;应用免疫化学发光法分别检测患者血清中cTnⅠ、CK-MB、MYO及BNP水平,采用受试者工作特征曲线(ROC)评价各指标的敏感度、特异度,并分析4项指标联合检测的诊断价值。结果:ACS组血清cTnⅠ、CK-MB、MYO及BNP水平分别为(9.27±7.25)μg/L、(239.50±213.27)ng/ml、(37.06±21.60)ng/ml、(632.11±293.20)pg/ml;AS组分别为(1.32±0.57)μg/L、(63.34±31.02)ng/ml、(19.48±8.04)ng/ml、(125.20±6.57)pg/ml;对照组为(0.17±0.06)μg/L、(30.02±15.23)ng/ml、(14.06±3.19)ng/ml、(47.52±21.30)pg/ml;ACS组患者血清cTnⅠ、CK-MB、MYO及BNP水平及阳性率均高于SA组和健康对照组,组间差异有统计学意义(P0.05);cTnⅠ的ROC曲线下面积(AUC)为(0.917±0.025),高于BNP曲线下面积(0.823±0.031)(P=0.037);4项指标联合检测ACS患者的敏感度(92.3%),高于单项检测86.0%(P0.05)。结论:检测血清cTnⅠ、CK-MB、MYO及BNP对于判定心肌缺血和损伤程度有重要价值,各项指标之间有互补作用,联合检测可为ACS早期诊断提供参考依据。     

哈维氏弧菌适配子的SELEX筛选及其亲和特异性研究

哈维氏弧菌是水产养殖中的重要条件致病菌,对其进行快速、准确地检测和鉴定是相关病害防治的基础和关键.适配子具有亲和力高、特异性强、稳定性好等优点,在微生物的检测和鉴定方面呈现出广泛的应用前景.本研究以哈维氏弧菌为靶目标,采用SELEX技术,即指数级富集配体的系统进化技术,筛选其特异性适配子.经15轮筛选后,随机ssDNA文库的亲和力从3.51上升到58.95,提高了15.8倍.筛选出的适配子富集库经克隆、测序后得到52条不同序列,根据同源性将这些序列分成8个家族,其中第1和第2家族的适配子数量最多,超过总数的50%.通过深入分析,筛选出6个对哈维氏弧菌有显著亲和特异性(P0.01)的高频适配子,其中5个高频适配子(S1、S25、S26、S27、S35)对哈维氏弧菌有较高的亲和力,相应的亲和常数Kd值分别为(32.6±7.1)、(45.3±10.1)、(24.7±5.8)、(34.8±5.6)、(12.9±4.0)nmol/L.本文还对高频适配子的产生机制及其应用价值进行了探讨.本文首次筛选出了对哈维氏弧菌具有较高亲和特异性的适配子,为后续利用适配子进行哈维氏弧菌的检测和鉴定奠定了基础.     

庆大霉素特异性单链DNA适配体的筛选、表征和应用

庆大霉素是一种常用的氨基糖苷类抗生素,对细菌尤其是革兰氏阴性菌有显著的抑菌作用,但其本身具有较强的毒副作用,而不规范的使用会对环境和人体健康产生危害.因此,建立一种高灵敏的快速检测庆大霉素的方法对于加强食品市场监管和环境监控具有重要意义.本文利用基于Sepharose亲和层析的指数富集的配体系统进化技术,经过九轮筛选和克隆测序,从体外合成的全长为79个核苷酸的随机单链DNA文库中筛选得到34条与庆大霉素有亲和力的适配体序列.通过同源性分析将这些序列分为6个家族,利用Mfold软件分析这些序列的二级结构及其稳定性,从中选出结构稳定性最高的序列进行解离常数(K_d)测定,最后得到一条与庆大霉素具有极高亲和力的适配体Ap-26,其解离常数(K_d)为14.00±3.34 nmol/L.通过Autodock 4.0软件对Ap-26与庆大霉素进行分子对接模拟,结果表明Ap-26与庆大霉素主要的结合位点是17～20, 54～56位核苷酸.在此基础上,利用适配体Ap-26为识别元件构建了基于金纳米粒子(gold nanoparticles, AuNPs)比色检测庆大霉素的方法,验证了该适配体的应用潜力.当庆大霉素的浓度在50～700 nmol/L范围内时, AuNPs溶液在520 nm处的吸光值与庆大霉素的浓度存在良好的线性关系,检测限为11.50 nmol/L.将该方法应用于牛奶样品中庆大霉素的检测时发现牛奶基质成分对检测结果的影响很小,庆大霉素的回收率均超过90%.以上结果表明本文筛选得到的庆大霉素适配体能有效应用于庆大霉素检测方法的构建.     

适配子纳米生物传感器在青霉素检测中的应用

通过脉冲腐蚀法对硅片进行多孔硅的制备,利用玻片通过对共价法、离子吸附法和APTES修饰的戊二醛交联法3种固定适配子方法的对比,以确定较好的固定青霉素适配子的方法。将适配子固定在多孔硅上后,利用交流阻抗法对加入青霉素前后传感器阻抗值进行测定、对比,构建等效电路并进行阻抗拟合。对多孔硅传感器的Nyqu ist谱图进行分析以确定多孔硅表面成功固定了青霉素适配子,从而证明构建纳米生物传感器成功。传感器的线性检测范围为0.05~0.2 mg/L,检测限为0.05 mg/L。     

适配子纤维蛋白靶向性验证及其抗凝活性测定

目的:验证适配子G81的纤维蛋白靶向性,评估适配子对凝血系统的影响。方法:以复钙法制备鼠源、人源体外纤维蛋白,将不同浓度Cy5.5标记的适配子溶液与之孵育,置于激光共聚焦显微镜下以固定的参数成像,用ImageJ软件进行相对荧光强度分析;将适配子G81溶液加入血浆中,通过倍比稀释法得到含浓度梯度适配子的血浆,采用SYSMEX CS-5100全自动血凝仪检测PT、APTT、TT,评估适配子G81对凝血功能的影响。结果:激光共聚焦显微镜显示适配子能与纤维蛋白结合,随着加入适配子量的增加其相对荧光强度逐渐增强,表明适配子可与纤维蛋白结合,统计分析提示荧光强度与适配子存在量效关系;人源、鼠源纤维蛋白结合的荧光强度无统计学差异(P0.05)。在抗凝活性检测中,血浆中适配子G81浓度达到200 pmoL/mL时,各浓度统计分析结果均显示P0.05,表明适配子对PT、APTT、TT的测量均没有统计学差异上的影响。结论:适配子G81具有纤维蛋白靶向性,且当加入的适配子剂量低于200 pmol/mL时对内、外源性凝血功能、凝血酶时间均无明显影响。     

细胞SELEX技术用于胰腺癌细胞特异性适配体的筛选及鉴定

细胞SELEX是目前常用的筛选细胞特异性适配体的技术。胰腺癌细胞特异性适配体在胰腺癌的诊断和治疗中有巨大的应用潜力。本研究拟通过该技术获得特异性识别胰腺癌PANC-1细胞的适配体,并对所筛选的适配体进行功能鉴定。本研究以胰腺癌PANC-1细胞为正筛细胞,正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7为负筛细胞,通过磁珠法细胞SELEX技术进行筛选。经过12轮筛选,对筛选文库进行PCR扩增、质粒转染、单克隆挑选及测序,获得2条适配体Apt-5和Apt-12。流式细胞术检测发现,适配体Apt-5和Apt-12可特异性识别PANC-1细胞,其Kd值分别为8.27±2.10 nmol/L和8.88±2.51 nmol/L,Kd值均处于纳摩尔级别。通过RNA结构预测,2条适配体的二级结构均为茎-环结构。细胞免疫荧光验证了适配体的结合部位为细胞膜表面。本研究表明,通过磁珠法细胞SELEX技术,成功获得可特异性识别胰腺癌PANC-1细胞的适配体。该适配体有望成为胰腺癌诊断和治疗中的特异性分子靶向剂。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体及多克隆抗体的制备

目的:以重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)为抗原制备鼠源单克隆抗体(McAb)及兔源多克隆抗体,并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的重组人cTnⅠ为抗原免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞同Sp2/0骨髓瘤细胞融合,利用选择培养基筛选融合的杂交瘤细胞,用有限稀释法分离获得能够稳定分泌抗cTnⅠ的McAb阳性克隆,并利用体内诱生法大规模制备McAb,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体;兔多抗制备以cTnⅠ为抗原常规免疫后取其血清;用间接ELISA和Western印迹鉴定抗体的性质。结果:经ELISA鉴定,筛选出5株能分泌cTnⅠMcAb的杂交瘤细胞株,即C5B2、C5B3、C5B4、C5B1、B1A6,效价最高的B1A6株分泌的McAb为IgG3型,纯化后效价为1∶10000,亲和常数为1.08×10-9mol/L,Western印迹鉴定表明cTnⅠMcAb有良好的特异性;兔多抗纯化后的效价为1∶8000。结论:制备了具有良好特性的cTnⅠMcAb和多克隆抗体。     

抑制RANKL诱导破骨细胞分化的DNA适配子的筛选

目的:筛选能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白并有效抑制RANKL对破骨细胞诱导分化作用的DNA适配子。方法:首先,采用原核系统表达并纯化RANKL蛋白,通过SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential)技术从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中筛选能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白的DNA适配子。然后,用RNAfolding sever software分析适配子空间结构,以ELISA检测DNA适配子和RANKL亲和力大小并筛选出亲和力最高的一组DNA适配子用以验证DNA适配子对RANKL诱导破骨细胞分化的抑制作用。结果:(1)成功在原核系统表达并纯化RANKL蛋白;(2)筛选出能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白的12个DNA适配子。(3)与对照组相比,不同浓度DNA适配子能明显抑制TRAP阳性破骨细胞数量(P0.05),且浓度越高抑制效果越明显。结论:成功筛选出的DNA适配子能特异性结合RANKL蛋白并有效抑制RANKL对破骨细胞的诱导分化功能。     

分子印迹技术应用于血清中地高辛的快速检测

应用分子印迹的方法制备对地高辛有特异性吸附性能的印迹聚合物颗粒,再将颗粒与琼脂糖混合并固定于玻碳电极上制备成地高辛分子印迹聚合膜传感器,传感器可以特异性地结合模板分子地高辛且其电化学信号与模板浓度相关,再用它来检测血清中地高辛的含量。结果表明:分子印迹传感器具有制作简便、成本低、检测快速、特异性高、稳定性好等优点,检测下限为1.28 nmol/L,检测时间为5 min。     

基于石墨烯和功能核酸的Ag~+荧光检测方法

基于核酸适配体错配结合Ag~+的原理,利用石墨烯对单链DNA和双链DNA结合力的不同,设计开发了C-Ag~+-C和石墨烯结合的新型荧光传感器,并建立了一种高灵敏度、快速、便捷的荧光检测方法,实现了turn on形式的Ag~+检测。在优化条件下,检测Ag~+的线性范围为150-400 nmol/L,检出限为23 nmol/L。该方法在饮用水的实验样品中Ag~+加标检测的回收率达到96.6%,具备用于实际样品分析的能力。     

大鼠成骨细胞特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别大鼠成骨细胞的单链DNA(ssDNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用完整细胞为靶标的消减细胞SELEX技术筛选大鼠成骨细胞特异ssDNA适配体,通过荧光显微镜、流式细胞术、基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure分析软件,分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过6轮消减细胞SELEX筛选,荧光显微镜鉴定文库已富集;通过流式细胞术检测及测序分析,得到2条适配体L54和L66与大鼠成骨细胞特异结合,其平衡解离常数分别为494.4±133.3和511.4±160.7 nmol/L。结论:筛选获得特异识别大鼠成骨细胞的ssDNA适配体。     

Vasorin蛋白特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别vasorin(VASN)蛋白的单链DNA(ss DNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用SPRSELEX技术筛选VASN蛋白特异ss DNA适配体,通过基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure软件分析富集文库序列并挑选出候选适配体序列,利用EMSA、ELISA、流式细胞术对候选适配体进行特异性与亲和力鉴定。结果:经过5轮SELEX筛选,获得了与VASN蛋白特异结合的ss DNA适配体富集文库,合成候选适配体,经EMSA和ELISA检测分析,证实适配体V4-2能与VASN蛋白特异结合,而不与无关对照牛血清白蛋白结合,其平衡解离常数为281.3±103.7 nmol/L;流式细胞术证实V4-2能够特异识别高表达VASN蛋白的Hep G2细胞。结论:筛选获得特异识别VASN蛋白的ss DNA适配体V4-2。     

川楝素诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡及其机制

目的: 本研究旨在探讨川楝素诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡及其机制。方法: 将人胃癌MGC-803细胞分为5组,每组3个复孔,采用氟尿嘧啶(5-FU)和0 nmol/L川楝素(TSN)分别作为阳性对照和阴性对照。其余3组分别加入终浓度为30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素。川楝素处理细胞48 h后,利用激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构变化;流式细胞术检测线粒体膜电位变化;酶标法检测Caspase-3和Caspase-9活性;利用qRT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Cyt c和APAF-1 mRNA和蛋白水平。结果: 与0 nmol/L TSN组相比,30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素作用于人胃癌MGC-803细胞48 h,可见细胞体积缩小,细胞核裂解,部分染色质凝集等形态学变化;Caspase-3和Caspase-9活性升高(P＜0.05);而线粒体膜电位明显下降(P＜ 0.05);Bax、Cyt c和APAF-1 基因mRNA及蛋白表达量显著升高(P＜0.05),Bcl-2 基因mRNA及蛋白表达量显著降低(P＜0.05)。结论: 川楝素通过上调Bax、Cyt c和APAF-1的表达,下调Bcl-2基因表达,增强Caspase-3、Caspase-9活性诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡。     

瘦素(Leptin )对猪前体脂肪细胞分化及PGC-1α和UCPs mRNA表达的影响

 以体外培养的猪前体脂肪细胞为研究对象,分析瘦素(leptin )对前体脂肪细胞分化及能量代谢相关基因PGC- 1α和UCPs mRNA表达的影响.油红O染色提取结果显示,10～90nmol/L的leptin对猪前体脂肪细胞甘油三酯合成均无显著影响(P>0.05).RT-PCR检测结果表明,30　nmol/L和100nmol/L leptin可显著促进LPL mRNA表达,处理24 h较12 h 作用效果明显(P<0.05);两个浓度的leptin对脂肪细胞分化转录因子C/EBPα和PPARγ2在mRNA水平上均没有明显的影响(P>0.05).对能量代谢相关基因的RT-PCR检测结果表明,30 nmol/L 和100nmol/L leptin 可显著促进PGC-1α和UCP3转录 (P<0.05),30nmol/L leptin可明显提高前脂肪细胞中UCP2 mRNA水平(P<0.05),且作用24h促进效果明显优于12h处理(P<0.05).研究结果提示,leptin不影响猪前体脂肪细胞分化,但可能通过上调PGC-1α和UCPs转录,促进能量消耗.