利用CRISPR/Cas9技术构建VPS34基因敲除的A549/293T细胞系

该研究利用CRISPR/Cas9策略构建敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,并初步将其用于自噬功能研究。应用在线工具设计了针对VPS34基因的3条sgRNA,并克隆至pX459载体。将重组质粒转染A549/293T细胞,嘌呤霉素初步筛选,通过PCR后测序和Western blot技术检测发现, sgRNA-1的敲除效果最好。将转染sgRNA-1的两种细胞单克隆化, PCR测序发现,存在碱基缺失, Western blot结果显示,对应的单克隆也未检测到VPS34蛋白,可见成功获得了VPS34敲除的A549/293T细胞系。由于VPS34参与自噬起始,实验结果显示, VPS34敲除后, LC3-I向LC3-II转化显著被抑制,自噬底物P62大量累积。结果表明,该方法成功获得稳定敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,且细胞中的自噬被显著抑制。同时,敲除VPS34能够降低人肺癌A549细胞的生长速率。该实验利用CRISPR/Cas9系统首次获得稳定敲除VPS34基因的哺乳动物细胞A549/293T细胞系,为后续自噬功能研究提供有力工具。     

基于慢病毒系统的双荧光标记多功能自噬流监测系统建立与应用

目的:构建能够用于稳定动态监测细胞自噬流变化和过表达基因的红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-鼠源LC3融合慢病毒多功能表达载体(PCDH-Duo-mRFP-eGFP_(ph)-LC3_(rat),PCDH-Duo),并构建小鼠腹腔巨噬细胞Raw264. 7稳转株观察自噬流变化。方法:应用基于PCR精确合成mRFP-eGFP_(ph)-LC3_(rat)融合全基因,将其克隆至慢病毒表达载体PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP中,重组质粒经菌落PCR、酶切及测序分析正确无误后,包装慢病毒,转染Raw264. 7细胞,并利用流式分选术获取稳转株,经氯喹抑制自噬模型及Western blot鉴定eGFP蛋白表达确认其可靠性。结果:成功构建了PCDH-Duo重组慢病毒质粒,包被慢病毒并获得Raw264. 7稳定细胞系(Raw264. 7-PCDHDuo),可稳定表达双荧光蛋白,经3mmol/L氯喹作用6h后,能够稳定准确指示自噬流变化。结论:成功构建了基于慢病毒系统的双荧光标记多功能自噬流监测系统,为研究细胞自噬与编码基因及非编码基因之间的关系提供了方便有力的工具。     

293T细胞中SQSTM1/p62-GFP的表达及其与LC3在诱导自噬状态下的定位分布

为探究SQSTM1/p62蛋白在细胞发生自噬时的定位,以人肺腺癌A549细胞的cDNA为模板,PCR扩增SQSTM1基因(编码p62蛋白)并将其插入pEGFP-N1真核表达质粒.将重组质粒转染进入人胚肾293T细胞中表达p62绿色荧光融合蛋白(GFP-p62),利用Earle's盐平衡溶液饥饿诱导细胞自噬,Wester...     

自噬标志分子MAP1LC3的重组载体构建及表达分析

目的:为深入研究细胞自噬的发生过程及机制,克隆人微管相关蛋白1轻链3-β(microtubule associated protein 1 light chain 3,MAP1LC3,简称LC3)基因,并构建原核和真核重组质粒用于后续的研究.方法:首先RT-PCR方法从人食管癌9706细胞基因组中克隆LC3基因,并分别连接到pET-32a载体和pEGFP-N3载体上,形成重组质粒.前者用IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导表达,后者进行细胞转染实验.结果:IPTG诱导原核重组质粒在E.coli内实现表达,pEGFP-N3-LC3转染到A549人肺癌细胞36h和鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)后,均检测到明显的绿色荧光信号,且在细胞质和胞核内均有分布.结论:成功构建了人源LC3重组表达载体,为研究高等和低等脊椎动物细胞自噬机制及机理过程提供了很好的研究工具.     

慢病毒GV115-AIF siRNA 重组表达系统的构建及鉴定

目的:构建高效的慢病毒GV115-AIF si RNA重组表达系统。方法:根据目的基因AIF以及RNA干扰序列设计原则,利用设计软件设计了3个可能的AIF si RNA序列。应用全基因合成技术和亚克隆技术构建GV115-AIF si RNA重组质粒,并采用聚合酶链反应技术(PCR技术)和基因测序技术对GV115-AIF si RNA重组质粒鉴定。利用GV115病毒包装辅助p Helper 1.0质粒和p Helper 2.0质粒进行病毒包装。病毒包装后转染人胚肾293T细胞,通过应用逆转录定量PCR技术(RT-PCR技术)检测转染后对人胚肾293T细胞中AIF基因的敲减效率,筛选最高效的AIF si RNA基因序列。结果:GV115-AIF si RNA质粒PCR鉴定显示位于341bp附近的条带。测序结果与设计的基因序列完全吻合。3个可能的AIF si RNA序列中基因敲减效率最高的可达到88.3%。结论:成功构建高效的慢病毒GV115-AIF si RNA重组表达系统。     

应用CRISPR/Cas9系统构建MTHFD1基因敲除的HEK-293细胞系

目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1, MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系。方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sg RNA),然后合成sg RNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的m RNA和蛋白表达水平。结果:重组载体中含有正确的sg RNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在m RNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系。     

Parkin功能丧失增强细胞自噬

Parkin(PARK2)基因的突变与家族性帕金森综合症的发生密切相关,其蛋白Parkin是细胞内的E3泛素连接酶。当线粒体受到损伤时,Parkin会募集到线粒体上,介导线粒体自噬,在生理条件下,Parkin及Parkin突变体是否会引起细胞自噬还不清楚。本文研究了病理性Parkin突变体对细胞自噬的影响。通过构建一系列Parkin功能缺失的突变体,并转染到HeLa以及ATG5-/-MEF细胞中,利用免疫荧光技术和Western-blot分析这些突变体对细胞自噬的影响。结果表明,Parkin突变体的表达促进细胞自噬的标志分子LC3由LC3-Ⅰ型变为LC3-Ⅱ型。突变体R275W在细胞内形成蛋白聚集体,并与LC3共定位。当细胞自噬的关键基因ATG5被敲除后,Parkin突变体引起的细胞自噬受到显著抑制。我们的初步结果提示Parkin突变体通过Atg5影响细胞自噬,并可能与帕金森症的发生有一定的相关性。     

建立CRISPR/Cas9慢病毒系统高效敲除人源AIP1基因

旨在构建AIP1基因CRISPR/Cas9敲除体系,获得高效、稳定、永久性AIP1敲除的人胚肾细胞株(293T)。针对AIP1的外显子设计3个20 bp的sg RNA(sp1、sp2和sp3)。与PX458载体连接,构建PX458-sg RNA敲除表达载体。T7E1实验评估敲除效率。将敲除效率最高的sg RNA与lenti CRISPRv2慢病毒载体连接,构建lenti CRISPRv2-sg RNA敲除表达载体,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中,收集病毒上清液转染293T细胞。对敲除成功的293T细胞通过有限稀释法构建敲除AIP1基因的稳定细胞株。Western blot测定转染后293T细胞中AIP1蛋白的表达量。结果显示,测序证实AIP1的3个靶序列分别正确插入PX458表达载体中,T7E1实验证实AIP1sg RNAsp2靶向敲除效率最高;成功构建lenti CRISPRv2-sg RNAsp2 AIP1敲除表达载体,并包装病毒,感染293T细胞;Western blot证实获得稳定的AIP1基因表达缺失的293T细胞株。建立了能稳定敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得AIP1敲除的293T稳定细胞株。     

细胞病变型牛病毒性腹泻病毒对宿主细胞自噬作用的研究

细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物细胞内损伤的细胞器和长寿命蛋白通过双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体或液泡中进行降解并得以循环利用的高度保守的分解代谢过程。本研究旨在了解细胞病变型(CEP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV NM)对宿主细胞MDBK细胞自噬作用的影响。实验使用BVDV NM株感染宿主细胞MDBK,在不同时间点分别通过透射电镜观察自噬体形成、报告荧光GFP-LC3自噬底物检测以及Western blot方法鉴定细胞自噬标记物LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ和P62的表达等试验方法对自噬进行检测。结果显示,感染BVDV NM株的MDBK细胞出现了明显的细胞病变;透射电镜能观察到细胞中存在大量的双层膜结构的自噬泡;转染GFP-LC3荧光质粒后,在感染病毒的细胞内出现增多的聚集绿色荧光自噬小体;此外,随着BVDV NM株感染MDBK时间的延长可以发现LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白的量逐渐增加以及P62蛋白的降解。试验表明BVDV NM株感染MDBK可以促进细胞自噬的发生。     

运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

肺上皮细胞自噬体在结核分枝杆菌感染中保护作用的分子机制

目的：构建Atg5．真核表达载体并瞬时转染肺上皮细胞细胞株,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中保护作用的分子机制。方法：设计针对Atg5的RNAi序列,化学合成后经过变性,退火连接到pSilencerTM3．1-H1hygro真核表达载体,经测序验证其正确性。脂质体法瞬时转染真核细胞A549,免疫印迹法检测瞬时转染的效果。用结核分枝杆菌分别感染正常和自噬表达低下的A549细胞．通过检测LDH来观察细胞的坏死情况。结果：成功的构建了pSilencerTM3．1-H1hygro真核表达载体并建瞬时转染了A549细胞株,成功抑制了细胞的自噬功能。Atg5-细胞对结核杆菌的抵抗能力下降。结论：在自噬表达低下的细胞中,细胞对结核分枝杆菌的抵抗能力有明显下降。在结核分枝杆菌感染上皮细胞的过程中,自噬是一种保护机制。     

基于CRISPR/Cas9系统的人成神经瘤SK-N-SH细胞CAPNS1基因的靶向敲除

利用CRISPR/Cas9技术靶向构建CAPNS1基因敲除人成神经瘤细胞SK-N-SH细胞系。在NCBI数据库查找人CAPNS1基因,获得该基因CDS区,根据CRISPR/Cas9敲除靶位点设计原则即g RNA设计原则,设计3条sg RNAs,以p GK1.1为载体,构建人CAPNS1基因敲除载体,并运用共转染的方法转染到SK-N-SH细胞,构建CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系。结果发现,菌落PCR筛选均能扩增出100 bp大小的片段,单克隆为阳性,DNA测序显示sg RNA序列正确插入质粒,序列比对结果正确;质粒转染SK-N-SH细胞后,制备单克隆,CruiserTMEnzyme酶切后疑似为阳性克隆,进一步的单克隆测序结果显示CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功;此外,在CAPNS1-/-组,CAPNS1蛋白及calpain1和calpain2蛋白水平明显降低。以上结果表明CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功。     

利用CRISPR/Cas9n系统敲除人源SNF5基因

目的:建立敲除人源基因组中SNF5基因的CRISPR/Cas9n系统。方法:设计一对靶向人源SNF5基因第1个外显子的sg RNA,分别克隆至p X461、p X462表达载体后,转入人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测细胞株中SNF5基因的敲除效果。结果:测序证明构建的靶向SNF5基因CRISPR/Cas9n重组质粒与设计吻合。Western印迹结果显示,重组质粒p X461-h SNF5sg RNA转染293T细胞后24 h,细胞内SNF5表达水平明显降低;重组质粒p X462-h SNF5sg RNA转染293T细胞后48 h,细胞内SNF5表达水平显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9n系统获得了靶向SNF5基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除SNF5基因的表达。     

小鼠GP73敲低质粒的构建

目的:用p SUPER-NEO空载体构建可以敲低小鼠高尔基蛋白73(m GP73)表达的重组质粒p SUPER-m GP73-si RNA,并鉴定其功能。方法:合成靶向m GP73基因区的3条小干扰RNA(si RNA)m GP73-si RNA1、m GP73-si RNA2和m GP73-si RNA3,通过细胞实验挑选干扰效率大于60%的si RNA,用于合成能够敲低m GP73的重组质粒;重组载体经双酶切和测序鉴定正确后转染4T1细胞,检测转染质粒后细胞内m GP73的m RNA水平;将重组质粒p SUPER-m GP73-si RNA经尾部静脉注射小鼠体内,测定小鼠胃组织中m GP73的m RNA水平。结果:构建了p SUPER-m GP73-si RNA重组质粒;在转染该载体后,小鼠乳腺癌4T1细胞m GP73的m RNA表达下调43%;小鼠体内注射该载体后,胃组织中m GP73的m RNA表达受抑制率为33%。结论:构建了针对m GP73敲低的p SUPER-m GP73-si RNA质粒,可以较明显地下调鼠细胞系和小鼠胃组织m GP73的表达。     

敲除ESR1基因对人乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的:建立CRISPR/Cas9系统用于敲除人源雌激素受体α(ERα)基因(ESR1),并利用此细胞模型初步检测ESR1基因对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。方法:设计一个靶向人源ESR1基因第2外显子的单向导RNA(sg RNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人乳腺癌细胞株MCF-7,Western印迹检测MCF-7中ESR1基因的敲除效果,通过Transwell、反向侵袭试验观察ESR1基因敲除后对细胞侵袭能力的影响。结果:测序结果显示靶向ESR1基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;Western印迹显示Cas9-ERα组的MCF-7细胞内ERα表达水平较对照组显著降低;Tanswell、反向侵袭试验证实ESR1基因敲除能够促进乳腺癌细胞的侵袭能力。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向ESR1基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除ESR1基因;ERα能够抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。     

构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。     

利用CRISPR/Cas9系统构建ITGαV及ITGβ3敲除细胞系

本试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得整合素αV(Integrin αV,ITGαV)及整合素β3(Integrin β3,ITGβ3)基因敲除的猪睾丸(Swine testicle,ST)细胞系,进而在细胞水平上研究ITGαV及ITGβ3在猪δ冠状病毒(Porcine deltacorovirus,PDCoV)入侵过程中的作用及相互作用机制。根据GenBank上猪的ITGαV及ITGβ3基因序列分别设计三对引导RNA(sgRNA),并整合到LentiCRISPR‐V2载体上,与辅助质粒pSPA×2及pMD2.G共转染293 T细胞进行慢病毒包装,包装完成后感染ST细胞并用嘌呤霉素进行压力筛选。用T7酶进行酶切检测,选出编辑效率较高的细胞群体,进一步用有限稀释法筛选出单克隆敲除细胞系。对分离出的ST‐ITGαV^KO(敲除ITGαV基因的ST细胞)及ST‐ITGβ3^KO(敲除ITGβ3基因的ST细胞)的单克隆细胞系进行测序和Western Blotting鉴定,结果显示ITGαV与ITGβ3均被成功敲除。采用敲除细胞系进行PDCoV感染试...     

肺上皮细胞自噬体在结核分枝杆菌感染中保护作用的分子机制

目的:构建Atg5-真核表达载体并瞬时转染肺上皮细胞细胞株,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中保护作用的分子机制。方法:设计针对Atg5的RNAi序列,化学合成后经过变性,退火连接到pSilencerTM3.1-H1hygro真核表达载体,经测序验证其正确性。脂质体法瞬时转染真核细胞A549,免疫印迹法检测瞬时转染的效果。用结核分枝杆菌分别感染正常和自噬表达低下的A549细胞,通过检测LDH来观察细胞的坏死情况。结果:成功的构建了pSilencerTM 3.1-H1 hygro真核表达载体并建瞬时转染了A549细胞株,成功抑制了细胞的自噬功能。Atg5-细胞对结核杆菌的抵抗能力下降。结论:在自噬表达低下的细胞中,细胞对结核分枝杆菌的抵抗能力有明显下降。在结核分枝杆菌感染上皮细胞的过程中,自噬是一种保护机制。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因敲除的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因缺失的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对CDH1基因的sgRNA,以lentiCRISPR v2质粒为骨架构建能表达此sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒。测序鉴定后,将重组质粒与逆转录病毒包装质粒VSVG、PAX2在氯化钙介导下共同转入HEK293T细胞进行病毒包装,转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌MCF-7细胞。采用嘌呤霉素筛选CDH1缺失的乳腺癌MCF-7细胞,通过DNA测序、Western印迹及免疫荧光染色实验验证获得的MCF-7细胞。结果:构建了靶向CDH1的CRISPR/Cas9质粒;DNA测序和Western印迹实验结果表明获得了稳定敲除CDH1的人乳腺癌MCF-7细胞。免疫荧光染色结果显示,相比对照组,稳定敲除CDH1的MCF-7细胞中已无法明显观察到E-钙黏蛋白的表达分布。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了CDH1基因缺失的MCF7细胞系,为进一步研究CDH1在肿瘤免疫治疗中的作用提供了基础。     

鳞翅目昆虫中自噬相关分子Atg8的研究进展

自噬是细胞通过溶酶体自主降解以实现细胞内物质循环利用的过程,在昆虫细胞分化和个体发育中起着重要作用。鳞翅目昆虫属于完全变态昆虫,会通过自噬和凋亡完成蜕变重建过程,是研究自噬机制的模式生物。自噬相关蛋白Atg8是哺乳动物微管相关蛋白1轻链3的同系物,是自噬相关蛋白的核心蛋白家族,对自噬小体形成、膜的延伸、特定物质识别等具有重要意义。文中就鳞翅目昆虫Atg8在自噬信号通路中的作用、Atg8结构特点、Atg8表达分布及Atg8-PE/Atg8水平与自噬活性关系进行了综述。Atg8-PE是自噬信号通路中两个类泛素结合系统之一,在自噬中起着关键作用。序列分析表明,鳞翅目昆虫Atg8与其他真核生物同源蛋白的整体结构相似,尤其与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列高度一致,体现了Atg8的高度保守性。鳞翅目昆虫发育不同阶段,Atg8在中肠、唾液腺、卵巢、脂肪体、丝腺等器官中的表达分布各不相同。并且,Atg8在核质中分布也存在差异,Atg8在细胞核与细胞质之间的穿梭可能存在蛹化前阶段的某些细胞中。通过检测Atg8-PE在细胞内的表达水平或Atg8含量的变化,可以评价细胞自噬的发生程度。