miR-23b-3p通过靶向PDE4B基因调控山羊肌内前体脂肪细胞的分化

本研究旨在明确miR-23b-3p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响,并确定这种作用是通过靶向基因PDE4B来实现的。基于实验室前期转录组测序结果,以筛选得到的山羊肌内脂肪细胞分化前后差异表达的miR-23b-3p为切入点,利用实时荧光定量PCR (real-time quantitative-polymerase chain reaction, qPCR)技术检测miR-23b-3p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式,从形态学水平和分子水平确定miR-23b-3p对脂肪分化及脂肪分化标志基因的影响;利用生物信息学预测以及双荧光素酶报告基因试验确定miR-23b-3p的下游靶基因,明确miR-23b-3p与预测靶标基因的靶向关系。结果表明,过表达miR-23b-3p后山羊肌内脂肪细胞脂滴积聚减少,成脂标志基因AP2、C/EBPα、FASN、LPL表达水平极显著下调(P＜0.01),C/EBPβ、DGAT2、GLUT4和PPARγ的表达水平显著下调(P＜0.05)。干扰miR-23b-3p表达后,山羊肌内脂肪细胞中脂滴积聚增多,ACC、ATGL、AP2、DGAT2、GLUT4、FASN和SREBP1表达水平极显著上调(P＜0.01),C/EBPβ、LPL和PPARγ的表达水平显著上调(P＜0.05)。通过生物信息学分析预测,PDE4B可能为miR-23b-3p的靶标基因,且过表达miR-23b-3p后极显著降低PDE4B的mRNA表达水平(P＜0.01),干扰miR-23b-3p后PDE4B的mRNA水平得到了显著提升(P＜0.05)。双荧光素酶报告基因试验结果表明,miR-23b-3p与PDE4B基因存在靶向关系。miR-23b-3p通过靶向PDE4B基因调控山羊肌内前体脂肪细胞的分化。     

miR-301b对山羊肌内脂肪细胞分化的调控作用

旨在明确miR-301b对山羊肌内脂肪细胞分化的调控作用,探讨其发挥调控作用的可能机制。利用化学合成的miR-301b mimics和miR-301b siRNA,通过脂质体转染法在山羊肌内脂肪细胞过表达和干扰miR-301b,并通过油红O染色、qPCR和生物信息学分析等方法,从细胞形态学和mRNA水平明确miR-301b对山羊肌内脂肪细胞分化的调控作用,并初步探究其可能的作用机制。结果表明,过表达miR-301b效率约29 290倍,细胞形态学结果显示,过表达miR-301b后山羊肌内脂肪细胞脂滴积聚减少,甘油三酯合成降低。qPCR结果显示,过表达miR-301b后成脂标志基因CEBPα、PPARγ、SREBP1、LPL表达水平极显著下调(P<0.01)。miR-301b干扰效率约60%,干扰miR-301b表达后,细胞形态学结果显示,山羊肌内脂肪细胞脂滴积聚增加,甘油三酯合成升高。qPCR结果显示,干扰miR-301b后成脂标志基因AP2、CEBPα、CEBPβ、PPARγ、SREBP1、LPL表达水平极显著上调(P<0.01)。通过对miR-301b生物信息学分析,推...     

过表达Sirt2抑制猪前体脂肪细胞的分化

本文旨在利用过表达技术研究Sirt2在猪前体脂肪细胞分化中的作用.首先将Sirt2插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,并与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,重组体用Lipofectamine2000包装转染HEK293细胞系,成功获得重组腺病毒vAd-Sirt2.用vAd-Sirt2感染猪前体脂肪细胞,48h后油红O染色法观察脂肪细胞分化情况,RT-PCR检测脂肪细胞分化标志基因PPARγ和aP2的表达.结果显示,过表达Sirt2促使细胞中脂滴减少,同时标志基因PPARγ、aP2mRNA水平显著降低,说明Sirt2抑制猪前体脂肪细胞分化,这为控制猪体脂沉积提供依据以及为人类肥胖和相关疾病的治疗和预防奠定基础.     

Rheb过表达在前体脂肪细胞株3T3-L1分化中的作用

目的:利用前体脂肪细胞株3T3-L1细胞观察mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路中上游调控因子Rheb(Ras homolog enriched in brain)对其分化的影响。方法:利用高表达Rheb的基因重组质粒转染前体脂肪细胞株,3T3-L1。通过蛋白质免疫印迹实验鉴定质粒成功转染细胞后,诱导该细胞脂肪分化。予以分化第8天的3T3-L1细胞油红染色,并检测细胞内甘油三酯的含量。另外,我们用Western blot方法检测脂肪细胞特异性转录因子PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ)和C/EBP-α(CCAAT-enhancer-binding protein-α)的表达情况来研究Rheb在脂肪细胞分化过程中的作用。结果:我们成功构建了高表达Rheb的3T3-L1细胞株,发现高表达Rheb后可以促进脂滴的生成,油红O染色有显著区别,与对照组相比Rheb高表达组的三酰甘油含量明显升高(P0.05);C/EBP-α和PPAR-γ等脂肪细胞特异性的转录因子蛋白表达量与对照组相比也均有升高(P0.05)。结论:Rheb基因作为mTOR通路上游调控因子,可以促进脂肪细胞的分化。     

过表达miR-103促进猪前体脂肪细胞分化

为阐明miR-103在猪前体脂肪细胞分化过程中的调控作用,采用Real-time PCR检测猪前体脂肪细胞成脂分化过程中的miR-103表达谱,明确了其在分化过程中的表达趋势;使用miR-103的腺病毒超表达载体感染猪原代脂肪细胞,随后采用Real-time PCR和Western blotting分别检测成脂标记基因PPARγ、aP2的mRNA和蛋白表达量变化;油红O染色观察腺病毒miR-103侵染的前体脂肪细胞诱导分化第8天的成脂情况。结果显示,miR-103的表达量随着脂肪细胞分化而增加,在miR-103超表达的猪原代脂肪细胞的诱导分化过程中,成脂标记基因PPARγ、aP2的表达量与对照相比显著升高,分化第8天观察到明显的脂滴。说明miR-103能够促进猪前体脂肪细胞分化。     

过表达RBP4抑制体外培养的猪前体脂肪细胞分化

为研究视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4,RBP4)对猪前体脂肪细胞分化的影响,实验构建了RBP4重组腺病毒表达载体,包装并感染猪前体细胞,采用油红O染色和Real-time PCR等方法,检测了过表达RBP4对成脂分化的作用. 研究结果显示,重组腺病毒RBP4载体构建成功,转染猪前体脂肪细胞后,使RBP4的mRNA水平和蛋白水平分别增加了约400倍和20倍. 过表达RBP4能减少脂肪细胞的脂质积累,降低成脂关键基因过氧化物酶体增生物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)和脂肪酸结合蛋白2 (adipocyte protein 2, aP2)的表达. 结果表明,RBP4对猪前体脂肪细胞分化有抑制作用,为进一步研究RBP4对猪前体脂肪细胞分化的作用机制奠定基础.     

华丽龙胆GsF3′5′H和GsFNS基因的克隆及表达分析

该研究以华丽龙胆(Gentiana sino ornata)5个不同开放阶段(H₁~H₅)的蓝色花冠为试材,利用RT PCR技术克隆GsF3′5′H和GsFNS全长序列,并进行生物信息学分析,比较GsF3′5′H和GsFNS在不同组织和不同开放阶段的基因表达模式。结果显示：(1)所克隆的GsF3′5′H和GsFNS基因分别包含1 560 bp和1 590 bp开放阅读框(OFR),并分别编码520和529个氨基酸。(2)结构分析显示,GsF3′5′H和GsFNS均具有典型的F3′5′H和FNSⅡ蛋白保守结构域。(3)系统进化树分析表明,GsF3′5′H和GsFNS亲缘关系最近的物种是三花龙胆(Gentiana triflora)。(4)qRT PCR结果显示,GsF3′5′H和GsFNS基因在根、茎、叶和花冠中均表达,其中GsF3′5′H基因在花冠H₃阶段表达量最高。GsFNS在根中表达量最高,其次在花冠H₄阶段两基因的表达均较高。研究推测,GsF3′5′H基因表达产生的飞燕草素苷和GsFNS表达产生的黄酮共着色作用可能使华丽龙胆的花冠呈更稳定艳丽的蓝色,为蓝色花分子育种提供重要的基因资源。     

Knockdown of KLF9 promotes the differentiation of both intramuscular and subcutaneous preadipocytes in goat

ABSTRACT

KLF9 is reported to promote adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells and pigs. However, the roles of KLF9 in adipocytes differentiation of goat remain unknown. In this study, the expression profiles of KLF9 were different between subcutaneous and intramuscular preadipocytes of goat during differentiation process. After silencing KLF9 gene, the lipid droplets were increased in both two types of adipocytes. In subcutaneous preadipocyte with silencing KLF9, the expressions of C/EBPβ, PPARγ, LPL, KLF1-2, KLF5, and KLF17 genes were up-regulated, while KLF12, KLF4, and KLF13 genes were down-regulated in expression level. In intramuscular preadipocyte, aP2, C/EBPα, KLF2-3, KLF5, and KLF7 gene were up-regulated, and Pref-1 gene was down-regulated. In addition, the binding sites of KLF9 existed in the promoters of aP2, C/EBPα, C/EBPβ, LPL and Pref-1. Taken together, KLF9 play a negative role in the differentiation of both intramuscular and subcutaneous preadipocytes in goats, but the functional mechanism may be different.     

沙柳SpsLAS基因超表达对拟南芥营养生长的影响

用沙柳SpsLAS基因构建35S∷SpsLAS超表达载体并转化野生型拟南芥,对转基因拟南芥进行表型观察,利用荧光定量PCR,对分枝、生长素及细胞分裂素相关基因进行表达分析。结果显示:(1)成功构建35S∷SpsLAS超表达载体,并获得9株纯合转基因株系,且转基因株系的萌芽速率快于野生型(对照),生活周期也较长;其中7个株系表现为生长迅速、株高增加、莲座叶叶片增大、分枝增加,2个株系表现为矮化、分枝增加、育性降低等一系列变化。(2)荧光定量PCR显示,与对照相比24h时转基因株系幼苗生长素及细胞分裂素途径关键基因无明显变化,4d时各基因在各转基因株系呈上调趋势;30d时分枝相关基因RAX1、RAX3表达量均上调,而MAX1、MAX3、REV、AXR1无明显变化。研究表明,SpsLAS基因过表达对拟南芥株型、莲座叶有明显影响,该研究结果为进一步研究该基因对分枝调控机制奠定了基础。     

拟南芥GH3.9基因的过表达及其表型分析

为研究GH3.9基因在植物生长发育过程中的作用,利用RT-PCR成功克隆到GH3.9基因,该基因全长为1 750bp。通过构建pEGAD-GH3.9过表达载体转化拟南芥,获得过表达GH3.9基因纯系转基因株系GH3.9ox-3和GH3.9ox-7。对拟南芥野生型(WT)和转基因株系(GH3.9ox-3和GH3.9ox-7)幼苗用不同光强和光质进行处理,结果显示:在蓝光、红光、远红光等不同光照强度下培养,过表达株系幼苗下胚轴的生长均明显受到抑制,且较野生型明显;采用不同光周期处理拟南芥幼苗,过表达幼苗下胚轴的伸长明显低于野生型;对成年植株表型进行观察,发现过表达株系植株矮小、雄蕊变短、果荚短小。研究表明:GH3.9基因参与了拟南芥生长发育调控,过表达GH3.9基因对拟南芥生长有抑制作用。     

过表达腺苷生物合成正相关基因GlPNP提高灵芝腺苷的含量

【背景】灵芝被纳入我国“药食同源”试点名单,腺苷作为其主要活性物质之一,在免疫调节、抗炎、抗癌等方面发挥着重要作用。【目的】调控腺苷生物合成关键酶基因的表达来提高灵芝腺苷产量。【方法】将不同培养时间阶段腺苷合成酶基因(包括5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶GlATIC、嘌呤核苷磷酸化酶GlPNP、腺苷激酶GlADK)的表达量与腺苷含量相关联,筛选出与灵芝腺苷含量呈正相关的关键酶基因。克隆关键酶基因并在灵芝中过表达,探究关键酶基因过表达对灵芝腺苷积累的影响。【结果】GlPNP的表达与灵芝腺苷含量呈正相关。GlPNP的cDNA全长为969 bp,预测GlPNP蛋白的相对分子量为34.6 kDa,呈三聚体的四元结构。研究结果表明,过表达菌株中GlPNP的表达量在第4天比野生型菌株(WT)上调了2.9-3.9倍,与含空载体的菌株(CK)相比,腺苷含量分别提高了78%和63%。【结论】过表达嘌呤核苷磷酸化酶是提高灵芝腺苷产量的一种有效手段。     

同源过表达mhr2基因可提高嗜热毁丝霉纤维素酶活性

为寻找新型的与纤维素酶相关转录调控因子,以嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila ATCC42464)为研究材料,通过克隆嗜热毁丝霉mhr2基因序列,构建重组过表达载体,转化并筛选到转化子Mt O24中mhr2基因表达量比野生型菌株高204倍。蛋白浓度及酶活测定的结果显示,诱导培养72 h,转化子胞外蛋白浓度和滤纸酶活分别是野生菌的1.58和1.30倍;非诱导培养144 h,转化子胞外蛋白浓度和滤纸酶活分别是野生菌的1.87和1.49倍。实时荧光定量PCR的结果表明,转化子中主要纤维素酶基因egl1、egl3和cbh1、cbh2的表达量均有显著提高。研究初步证实了mhr2基因具有调控纤维素酶基因表达的功能。