新城疫病毒包膜糖蛋白的结构与功能

新城疫是一种禽类传染病,可对养禽业带来严重的经济损失。其病原新城疫病毒具有包膜,基因组是单股、负链、不分节段的RNA,具有溶瘤活性,编码NP、P、M、F、HN和L六种结构蛋白,其中位于病毒包膜上的融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)两种糖蛋白对NDV的人侵及毒力有着重要的作用。本文首先总结了两种包膜糖蛋白结构与功能的基本情况,在此基础上,整合了近年来国内外的研究,发现一些矛盾点,并且将HN蛋白的其他功能进行概述,为NDV包膜糖蛋白的研究提供了新的视角。     

新城疫病毒HN蛋白促细胞融合机制研究进展

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)可导致急性和高度致死性禽类传染病,严重危害世界养禽业。膜融合是NDV发挥毒力的第一步,血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)发挥促细胞融合作用,协助融合蛋白(Fusion protein,F)介导完成膜融合这一过程。本文从HN蛋白的结构和功能入手,对HN蛋白头部、头-颈连接区及颈部在促细胞融合机制中的作用进行综述与讨论,以期为深入研究NDV的致病机制,进一步研发新型药物和疫苗提供新的思路。     

人呼吸道合胞病毒小疏水蛋白研究进展

人呼吸道合胞病毒是人呼吸道感染病原中的重要病原。SH蛋白是人呼吸道合胞病毒粒子表面的一种小分子糖蛋白,可形成五聚体的离子通道结构。SH蛋白是人呼吸道合胞病毒复制的非必需蛋白,但可以影响病毒融合蛋白介导的细胞融合,近年研究发现SH蛋白胞外区与血蓝蛋白形成的复合物可作为人呼吸道合胞病毒疫苗的抗原,产生的抗体在体内能清除病毒感染的细胞。本综述旨在对人呼吸道合胞病毒SH蛋白最新研究成果进行总结和讨论,并对未来针对SH蛋白的研究方向加以展望。     

尼帕病毒包膜糖蛋白及细胞融合机制研究进展

尼帕病毒(Nipah virus,NiV)是一种新发人兽共患病病原体,其传染性强,致死率高,不仅严重危害当地人群的生命财产,也对全球公共卫生安全构成严重威胁。本文从尼帕病毒包膜表面两种重要糖蛋白——附着蛋白G和融合蛋白F入手,简要介绍其结构形态和生理学功能,并联系尼帕病毒的组织趋向性,重点阐述G蛋白与其蛋白受体eB2/eB3(ephrin-B2/ephrin-B3)之间、G蛋白与F蛋白之间的相互作用机制,对近几年来国内外研究的最新进展进行回顾与展望。     

副粘病毒包膜糖蛋白分子生物学研究进展

副粘病毒是一类重要的人和动物致病病毒。其中包括副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV)、流行性腮腺炎病毒(Mumpsvirus,MuV)和新城疫病毒(Newcatle disease virus．NDV)。这些病毒在中性pH条件下,可以通过膜融合而感染宿主细胞。整个病毒由包膜、衣壳和核酸组成。其基因组为15kb左右的单股负链RNA,主要包括6组基因,用于编码6种病毒结构蛋白。     

副粘病毒HN蛋白颈部与F相互作用区功能的研究

副粘病毒(Paramyxovirus)包膜上镶嵌着两种糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(Fusion protein,F),两者的相互作用是决定病毒宿主范围、毒力和传播的关键。为探讨HN颈部与F相互作用区(Fusion interaction region,FIR)在膜融合机制中的作用,选取新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)与人副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3,hPIV3)为研究对象,通过片段置换及同源重组技术构建嵌合体C1、C2,进一步将NDV及hPIV3 HN的FIR内第51位丝氨酸(Serine,S)、第55位天冬氨酸(Aspartic acid,D)定点突变为丙氨酸(Alanine,A),获得突变体NDVS51A、NDVD55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A,对嵌合体及突变体蛋白的细胞表面表达效率、受体识别活性、神经氨酸酶活性、促细胞融合活性及半融合活性进行检测。结果:各嵌合体C1、C2及突变体NDV S51A、NDV D55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A的细胞表达效率、神经氨酸酶活性(Neuraminidase,NA)与野生型相比差异不显著(P0.05),但促细胞融合活性均有不同程度的降低(P0.05),C1、C2、NDV S51A、NDV D55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A分别为野生型的7%、9%、27%、19%、17%和21%;C1、C2、NDV S51A、NDV D55A、hPIV3 S51A、hPIV3 D55A的受体识别活性分别为14.7%、22.3%、35.5%、28.8%、33.9%和40.2%,与野生型相比差异显著(P0.05)。结果表明:副粘病毒HN蛋白颈部与F相互作用区的突变及置换使HN蛋白的促细胞融合活性、受体识别活性降低,其中第51位丝氨酸(S51)及第55位天冬氨酸(D55)发挥重要作用。     

人偏肺病毒F蛋白与细胞融合机制研究进展

人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)是一种新发呼吸道病毒。hMPV感染可引起广泛的呼吸道疾病,目前已越来越受到人们的重视。多数副粘病毒与宿主细胞膜的融合过程依赖吸附蛋白和融合蛋白的共同参与。hMPV的特别之处在于其融合蛋白(F)既可以结合受体,又可以介导膜融合。本文从hMPV包膜表面具有双重功能的F蛋白入手,简要介绍F蛋白的结构和生理功能,重点阐述F蛋白介导的细胞融合机制和特性,对近几年来国内外研究进展进行了回顾与展望。     

副粘病毒附着蛋白在病毒融合过程中的作用*

副粘病毒附着蛋白 (AP)是病毒表面的一种主要糖蛋白 ,它能够诱导机体产生中和抗体。近年来的研究表明附着蛋白在病毒融合过程中的作用不仅限于其对受体的识别和结合 ,它还促进融合蛋白 (F)介导病毒与宿主细胞的融合。由此可见 ,副粘病毒具有其特有的融合机理 ,因此研究附着蛋白在病毒融合过程中的作用是揭示副粘病毒融合机理的前提 ,同时也会为新型抑制药物的研究提供思路。     

小反刍兽疫病毒H和F蛋白在细胞融合中的作用

【目的】研究小反刍兽疫病毒囊膜糖蛋白(血凝素蛋白和融合蛋白)在病毒囊膜和宿主细胞膜融合过程中所发挥的作用。【方法】制备构建成功的小反刍兽疫病毒囊膜糖蛋白和病毒受体SLAM、Nectin4的真核表达质粒pCMV-HA-H、pCAGGS-Flag-F、pCMV-Myc-SLAM和pCMV-Myc-Nectin 4,将其组合转染至CHO-K1细胞,通过显微观察和间接免疫荧光技术分析小反刍兽疫病毒H和F蛋白在病毒融合过程中的功能。【结果】除空白对照组和重组质粒单独转染组细胞中没有发现合胞体外,其余组细胞中均出现了合胞体,而且F和H蛋白共转染组合胞体的数目明显较多;并在共表达H、F蛋白的细胞中观察到了蛋白分布极化的帽子现象。【结论】PPRV F蛋白是病毒囊膜和细胞膜融合的必需蛋白,但需要与PPRV H共同作用才能使病毒成功入侵靶细胞。     

禽副粘病毒-2 膜融合相关多肽基因的构建与表达

囊膜病毒与宿主细胞的膜融合是病毒入侵宿主细胞的第一步 . 禽副粘病毒 -2 (APMV-2) 囊膜表面糖蛋白有 2 种,与宿主受体结合的血凝素神经氨酸酶 (HN) 及介导膜融合的融合糖蛋白 (F). HN 蛋白的茎部区域 (stalk region) 与球状头部区域 (globular head region) ,以及 F 蛋白的 3 段七肽重复区域 (heptad repeat , HR) 都可能与膜融合直接相关,将 5 段多肽进行基因的构建与表达研究 . 根据已发表的禽副粘病毒 -1 (APMV-1) 氨基酸序列,应用 BLAST 程序进行同源性分析,以确定 APMV-2 相应区域,使用搭桥 PCR 或普通 PCR 方法构建基因,分别克隆入表达载体 pGEX-6p- Ⅰ获得重组质粒,阳性重组质粒转化入大肠杆菌 BL21 (DE₃) ,表达后获得可溶性融合蛋白, 3C 蛋白酶酶切后的蛋白质混合物经 Glutathione-Sepharose 4B 亲和层析纯化,最终获得可溶性、高纯度的 5 段多肽 . 应用 LearnCoil-VMF 软件与 ExPASy 系列软件对蛋白质结构与功能进行预测与分析 . 分子筛实验结果表明, F 蛋白的 HR1 与 HR2 可形成六聚体结构,圆二色谱实验结果则表明,六聚体蛋白富含 α 琢螺旋结构 .     

副粘病毒附着蛋白在病毒融合过程中的作用

副粘病毒附着蛋白（AP）是病毒表面的一种主要糖蛋白,它能够诱导机体产生中和抗体。近年来的研究表明附着蛋白在病毒融合过程中的作用不公限于其对受体的识别和结合,它还促进融合蛋白（F）介导病毒与宿主细胞的融合。由此可见,副粘病毒具有其特有的融合机理,因此研究附着蛋白在病毒融合过程中的作用是揭示副粘病毒融合机理的前提,同时也会为新型抑制药物的研究提供思路。     

置换HN基因对新城疫病毒LaSota株致病力的影响

[目的]新城疫病毒的血凝素.神经氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)在病毒装配、出芽、释放及侵入宿主细胞的过程中发挥关键作用,但HN对病毒致病力的影响程度尚不完全清楚.[方法]为探讨这一问题,本研究以中等毒力毒株Mukteswar的HN基因替换我国广泛应用的LaSota疫苗株HN基因,通过反向遗传操作技术拯救出嵌合病毒(rL-MuHN).[结果]rL-MuHN红细胞吸附能力较亲本株rLaSota无显著升高,具有相似的细胞融合活性;嵌合病毒ICPI由rLaSota株的0.36降为0,MDT≥90,IVPI=0与rLaSota株相同,保持典型低致病力缓发型特点不变.进一步以Mukteswar株F基因替换rL-MuHN的F基因,拯救出F和HN双基因替换嵌合病毒rL-MuFHN,尽管该病毒的细胞融合能力显著提高,但其MDT、ICPI和IVPI分别为98 h,0.59和0,显示F和HN双基因替换仍未能使嵌合新城疫病毒rL-MuFHN的致病力达到中等毒力毒株Mukteswar(MDT、ICPI及IVPI分别为46 h、1.32和0.64)的水平.[结论]试验结果表明,F及HN囊膜蛋白基因之外的病毒基因组骨架背景对病毒的致病性同样具有重要的决定性意义,不同HN蛋白对嵌合病毒的致病能力的影响不同,与供体毒株毒力无关;以流行野毒株HN替代rLaSota疫苗株构建抗原针对性更强的弱毒疫苗株存在技术可行性.     

稳定性改善的呼吸道合胞病毒融合糖蛋白疫苗的设计和特性鉴定

呼吸道合胞病毒(RSV)感染是幼儿和老年人下呼吸道感染的主要原因。目前,还没有能用的上市疫苗并且治疗这种疾病的选择相当有限。感染性RSV颗粒用I型病毒融合蛋白(F)糖蛋白修饰,其在结构上从亚稳态的融合前形态重排成高度稳定的融合后形态。在自然感染RSV的人群中,中和抗体主要识别病毒融合前构象。因此,基因工程制备的其融合前构象稳定的经RSV F蛋白一直是开发RSV F疫苗抗原的有前景的方向。在4 ℃或更高温度下长期稳定性是RSV F亚单位疫苗抗原的理想属性。     

基于融合前F蛋白呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染(lower respiratory tract infection, LRTI)的主要原因,尚无可用于预防的疫苗。目前,WHO已将研发RSV疫苗确定为其疫苗研发和生物标准化倡议的优先事项之一。RSV融合蛋白(fusion protein, F)是病毒表面的主要保护性抗原,主要介导病毒包膜和靶细胞膜的融合。在感染过程中,F蛋白从亚稳态的融合前F蛋白(prefusion fusion protein, PreF)转变为稳定的融合后F蛋白(postfusion fusion protein, PostF)。近年来,研究发现PreF在体内诱导产生RSV中和抗体能力更强,适合作为免疫原用于RSV疫苗的研发。现就RSV PreF的结构、稳定策略及其作为疫苗候选抗原的应用作一概述。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白表达研究

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国2010年新发现的新布尼亚病毒,可导致人类严重发热伴血小板减少综合征。SFTS新布尼亚病毒全基因组已解析,但病毒分子生物学结构蛋白特征及功能尚需更多研究。本文通过蔗糖密度梯度离心确定发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(HB29株)病毒颗粒的沉降密度及超离纯化条件,得出该病毒颗粒在蔗糖中的沉降密度为1.135g/mL。利用PCR方法扩增SFTSV病毒株HB29株病毒RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白前体蛋白(M)、包膜糖蛋白(Gn)、包膜糖蛋白(Gc)、核蛋白(NP)及非结构蛋白(NSs)的编码区基因片段,分别克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT或VR1012,在293T细胞上获得上述基因表达。通过SDS-PAGE分析纯化病毒颗粒和重组蛋白,并通过免疫印迹(Western blotting)和间接免疫荧光(IFA)确定蛋白活性和分子量。本研究结果将有利于对新布尼亚病毒分子生物学特征的认识,为后期研究提供基础。     

纤维顶球改造增强了人5型腺病毒载体对造血细胞的感染

基于人5型腺病毒(Human adenovirus type 5,HAdV-5)的腺病毒载体对造血细胞的基因转导效率低,将病毒fiber基因替换为HAdV-11p的同源基因F11p后,载体对造血细胞的感染效率增强.本研究拟在F11p纤维顶球(knob)结构域添加RGD4C多肽或HIV包膜糖蛋白(gp120)的V3结构域,观察重组HAdV-5对造血细胞感染效率的变化.在前期构建的pKAd5f11p153R-EPG腺病毒质粒基础上,结合限制性酶切和DNA组装技术,在F11p 153 aa后(knob AB loop,153位)、228位(FG loop)以及300位(IJ loop)插入 RGD4C 肽或者 gp120的 V3肽,构建了共6种重组腺病毒载体(F153RGD-EG、F228RGD-EG、F300RGD-EG、F153CV-EG、F228CV-EG和 F300CV-EG),以fiber未改造的HAdV5-EG和改造为F11p的F11p-EG病毒作对照,观察了其对4种造血细胞系U937、K562、Jurkat和HL60以及人原代T细胞的感染效率.结果显示,对于U937细胞,当感染复数(MOI,vp/cell)为100时,HAdV5-EG感染效率最低,为2％;其次为F228CV-EG,感染率为45％;F300RGD-EG、F153CV-EG和F300CV-EG感染率为85％～90％;F153RGD-EG、F228RGD-EG高于阳性对照病毒F11p-EG,三者分别为99％、99％、95％.各病毒对于Jurkat细胞的感染率均较高,但HAdV5-EG明显低于F11p-EG、F153RGD-EG和F228RGD-EG,当MOI为100时分别为75％、93％、93％和96％.感染K562细胞的情况与U937细胞类似.各病毒对于HL60细胞感染效率最低,MOI为500时,F300RGD-EG和F300CV-EG的转导效率为28％和33％,是F11p-EG的10倍.对于人原代T细胞,F153RGD-EG和F228RGD-EG优于F11p-EG,当MOI为1000时,感染率分别为87％、90％和84％.研究结果表明,F11p knob插入RGD4C比单独F11p替换的HAdV-5对造血细胞的感染效率高,同时,本研究还发现HAdV-11p fiber knob的AB、FG或IJ loop可插入外源多肽,为腺病毒嗜向性改造增加了新靶点.     

表达RSVF或G蛋白的单剂重组副流感病毒5型载体疫苗使棉鼠和非洲绿猴抵抗了RSV的攻击

正人呼吸道合胞病毒(RSV)是在婴幼儿、免疫功能低下者和老年人中引起严重呼吸系统疾病的常见病因。目前没有可用疫苗。在此研究中,作者用棉鼠和非洲绿猴模型评估了表达RSV F(PIV5/F)或G(PIV5/G)蛋白的两种副流感病毒5型(PIV5)-载体疫苗的复制、免疫原性和抗RSV攻击的保护功效。经过单次鼻内接种后,两种动物短期排泄了疫苗的病毒但没有明显的临床症状。     

SARS 冠状病毒 S 蛋白受体结合结构域的表达及其表位作图

严重急性呼吸综合征 (SARS) 是一种新出现的人类传染病,该病的病原是 SARS 冠状病毒 (SARS-CoV). S 蛋白是 SARS 冠状病毒的一种主要结构蛋白,它在病毒与宿主细胞受体结合以及诱导机体产生中和抗体中起重要作用 . 研究表明 S 蛋白与受体结合的核心区域为第 318 ~ 510 氨基酸残基的片段 . 首先克隆并用 pGEX-6p-1 载体融合表达了该受体结合结构域,并且通过蛋白质印迹分析表明,该受体结合结构域融合蛋白能被 SARS 康复患者血清和 S 蛋白特异的单克隆抗体所识别 . 为了对这一区域进行抗原表位作图,进一步设计了一套 23 个覆盖受体结合结构域的长 16 个氨基酸残基的部分重叠短肽,并进行了 GST 融合表达 . 用免疫动物血清和单克隆抗体 D3D1 对 23 个融合蛋白进行蛋白质印迹和 ELISA 免疫反应性分析,结果鉴定出两个抗原表位 SRBD3(F334PSVYAWERKKISNCV349) 和表位 D3D1 (K447LRPFERDI455). 其结果对进一步分析 S 蛋白结构与功能以及诊断试剂和基因工程疫苗的研究有一定意义 .     

副粘病毒F1蛋白胞外非保守区对其特异性膜融合的影响

为了解融合蛋白F1分子的胞外非保守区在融合蛋白(F)与血凝素．神经氨酸酶(HN)的特异性膜融合中的作用,采用基因定点突变方法,在新城疫病毒(NDV)F1与人副流感病毒(hPIV)F1基因的胞外非保守区进行定点突变,创造酶切位点,得到分别含3个相同酶切位点的突变株NDV-M和hPIV-M。经检测,突变体的细胞融合功能与野毒株相同。然后用3个限制性内切酶分别从NDV-M与hPIV-M中切出两个片段NDVF-1、F-2及hPIVF-1、F-2。NDV-M和hPIV-M相互交换对应的F-1片段后进行基因重组,得到2个嵌合体(Chimera),即NDV-C1和hPIV-C1;同样方法交换F-2片段后又得到2个嵌合体NDV-C2和hPIV-C2。将各种嵌合体DNA与同源及异源HN基因共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率。结果表明,突变体：NDV-M和hPIV-M的细胞融合功能与野毒株相同,可用于构建嵌合体。NDV-1C和NDV—C2分别与NDV HN共表达后,融合功能达到野毒株的76．34％和96．2％,与hPIV HN共表达后均无细胞融合发生;hPIV-C1和hPIV—C2分别与hPIV HN共表达后,融合功能达到野毒株的65．82％和93．78％,与NDV HN共表达后无细胞融合发生。FACS分析表明,突变体及所有嵌合体蛋白F的表达效率与野毒株相比均没有明显变化。实验结果说明在F1蛋白的胞外非保守区中,NDV F-1和hPIV F-1这两个片段对于NDV和hPIV的特异性膜融合具有重要作用;而NDV F-2和hPIV F-2这两个片段对于NDV和hPIV的膜融合来讲,则特异性较低。     

人呼吸道合胞病毒亚单位疫苗的研究进展

呼吸道合胞病毒(RSV)是在世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病毒之一,WHO要求对RSV要严加监控。RSV是副粘病毒科肺炎病毒属的单股负链非节段性RNA病毒。RSV疫苗的研制已有40多年的历史,但至今未被批准使用其疫苗。RSV膜表面融合蛋白F和黏附蛋白G两种糖蛋白,是激发机体产生保护性抗体的最主要的病毒抗原,亚单位疫苗的开发主要针对这两个蛋白。目前研究的有纯化的F糖蛋白(PFP)、BBG2Na、嵌合型F-G糖蛋白及纯化的F、G和基质蛋白M。本文就目前国内外所研究的RSV亚单位疫苗作一综述。