运用数字差异展示方法克隆一个人类新的锌指蛋白基因ZNF474

运用数字差异展示方法,克隆一个与生精相关的睾丸高表达基因。借助公共ESTs数据库,利用DDD软件比较分析各种睾丸文库与其他组织或细胞系文库有差异表达的ESTs,成功克隆到一个在人类睾丸中高表达的新基因。结合实验获得新基因cDNA全长,该基因被国际人类基因命名委员会命名为ZNF474(GeneBank登陆号AY461732)。ZNF474的cDNA全长为1 972 bp,定位在5 q23.2。通过RT-PCR及测序验证,其开放阅读框的位置在377 bp~1 471 bp处,编码364个氨基酸,在氨基酸水平与小鼠同源基因有66%的一致性,而与其他已知蛋白质无明显同源性。Northern杂交分析显示ZNF474在成体睾丸组织特异高表达,卵巢组织弱表达,在多种其他组织中不表达,为单一转录本。原位杂交显示ZNF474基因在正常成人睾丸组织各级生精细胞、隐睾组织以及精原细胞癌组织中均有较高表达。综上考虑,推测ZNF474作为生殖细胞中特异的转录因子,对人类的精子发生和卵母细胞的发育可能起重要作用。     

mRNA差异展示研究胃癌差异表达基因

以胃癌细胞株GC7901与胃粘膜细胞株GES-1为对比材料,利用mRNA差异展示技术,研究胃粘膜至胃癌过程的差异表达基因,为建立胃癌预警系统打下基础.获得8个未知的与胃癌相关的cDNA,命名为GCYS-1,2,3,4,5,6,7,20,完成其克隆及序列分析,RNA印迹证实GCYS-1至7片段与GCYS-20基因在GC7901细胞株中呈高表达,在GES-1细胞株中呈低表达.此8个序列在GenBank数据库中登录,接受号为AF054162～AF056168及AF219140.     

运用差异展示分离特异性表达的基因

在高等生物中含有约100000个不同的基因,其中仅有15％的基因在任何个体细胞中均表达．因此分离特异的目的基因便显得十分重要.差异展示是通过部分扩增mRNA的逆转录产物、经测序胶电泳,分离到差异性表达的基因.它与消减杂交相比是分离特异表达基因的更有效的手段．虽然这种方法在实际运用中存在着这样或那样的困难,但随着对这种技术的不断改进,它将会有越来越广泛的用途．     

应用改良的mRNA差异展示法克隆人鼻咽上皮特异性表达的cDNA

本文对ｍＲＮＡ差异展示法进行了改良,利用一组随机引物与来源于ｍＲＮＡ翻译起始位点区域的引物组合进行ＲＴ－ＰＣＲ,使差异展示的片段来源于蛋白编码区,并对差异展示的条件进行了优化。应用此法对人鼻咽上皮与软腭口腔粘膜上皮扔基因表达进行了比较研究。得到了１０个在鼻咽上皮特异表达的ｃＤＮＡ片段,并对其中的５个片段进行了亚克隆和序列分析。通过与ＧｅｎｅＢａｎｋ数据库中的序列进行同源性比较,确定其中两个片段为未     

小鼠睾丸特异表达基因TSEG-1的克隆及序列分析

从表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)数据库ZooDDD中获得小鼠正常睾丸表达的EST, 通过dbEST数据库检索出与其高度同源的EST序列, 构建EST叠加群(contigs), Biolign软件拼接, GeneScan软件预测contigs对应的基因组序列中的外显子、内含子; 针对开放阅读框设计引物序列, 采用RT-PCR从小鼠睾丸组织中克隆新基因的cDNA, 分析该基因在小鼠各脏器中的mRNA表达, 并对测序结果进行生物信息学分析。结果表明: 在小鼠X染色体的1 668~2 011 kb间克隆出一新基因TSEG-1, 全长为510 bp, 开放阅读框为336 bp, 编码111氨基酸, 分子量12.84258 kDa, 等电点11.4000。RT-PCR证实该基因开放阅读框正确, 在小鼠睾丸组织中特异性表达, 且与小鼠其他cDNA 无同源性, 获得GenBank 登录号EU079024。功能区分析发现TSEG-1蛋白可能为一种跨膜蛋白, 跨膜区位于第41~61氨基酸残基。TSEG-1基因与人类睾丸特异性组蛋白2a变异体基因有较高同源性, 在TSEG-1基因5′-端非编码侧翼预测发现存在1个启动子区域, 范围为680 bp。 TSEG-1蛋白可能有4个抗原性位点, 2个特异性蛋白激酶的磷酸化位点, 其亚细胞定位可能位于线粒体。小鼠睾丸特异性基因TSEG-1的克隆为进一步研究其生物学功能和表达调控奠定了基础。     

小鼠睾丸凋亡基因MSRG-11的人类同源基因SPATA17的克隆

利用生物信息学方法结合实验手段克隆了一个在睾丸组织中特异高表达的小鼠生精细胞凋亡相关基因Spata17的人类同源基因SPATA17（GenBank登录号为AY963797）。应用生物信息学分析显示该基因定位在染色体1q41,包含11个外显子,内含子和外显子交界区均符合gt—ag规则;该基因开放阅读框为1083bp编码一个由361个氨基酸组成的、分子量为43．49kD、等电点为9．71、含有三个保守IQ功能域的蛋白;对SPATA17编码蛋白质进行生物信息学分析,无跨膜区,无信号肽序列,推测为一非分泌性蛋白。多组织和Northern blot结果显示该基因只在睾丸组织中特异高表达,转录本大小为2．0kb。总之,研究表明SPATA17在睾丸组织生精细胞凋亡起重要作用。     

绵羊睾丸发育相关基因在不同组织中的表达差异

本研究旨在筛选与绵羊睾丸发育的相关基因,检测其在绵羊同品种不同组织及不同品种睾丸组织中表达水平的差异,从而为研究这些基因在绵羊睾丸发育中的作用提供科学依据.以阿勒泰羊和巴什拜羊为材料,采用RT-qPCR技术探究其差异性表达.结果 显示,筛选出的基因DGCR6L、DDX24、ATP1A4、GPS2、PITRM1、KIF20B和Artn在阿勒泰羊附睾组织中高度表达,在巴什拜羊上除了GPS2和Artn在睾丸上高度表达,其余5个基因均在附睾组织中表达量最高.初步证明7个基因影响绵羊睾丸发育,对提高公羊繁殖力、为睾丸发育不完全综合征等疾病的遗传机制提供数据参考,同时为牛羊等优秀种公畜的早期选育提供参考依据.     

葡萄基因电子表达分析平台的验证与应用

为了验证作者建立的葡萄(Vitis vinifera L.)基因电子表达分析平台在葡萄果实发育相关基因的表达预测及特定序列快速检索等方面的应用效果,利用NCBI上公布的大量葡萄EST序列及半定量PCR和RT-PCR技术,对葡萄不同器官中VvANR、VvCHI、VvCHS2和VvDFR基因的表达分析预测结果进行验证,并对该平台具有的特定序列快速检索功能进行了简介.预测结果表明:葡萄各器官中VvANR、VvCHI、VvCHS2和VvDFR基因的无冗余EST序列数量均较多,分别为33条、36条、55条和46条;4个基因的表达量有一定差异,VvANR在花序和芽中表达量较高,VvCHI在花序、果实和芽中表达量较高,VvCHS2在果实、芽、花序和花中表达量较高,VvDFR在花序、芽、花、果实和根中表达量均较高.半定量PCR和RT-PCR实验结果显示:VvANR主要在花序、花和小果中表达;VvCHI主要在小果、花、茎和花序中表达;VvCHS2主要在茎、花序、花和小果中表达;VvDFR在各组织中表达量从高至低依次排序为花、花序、茎、叶、小果、中果、大果.验证结果表明:采用葡萄基因电子表达分析平台识别表达量较高的组织时,平台的预测结果与实验结果基本一致;而在预测一些表达量较低的组织时效果较差.应用该平台、通过5个步骤,可以简便、快速检索出特定组织或特定状况下的特定cDNA文库信息.     

应用改良的mRNA差异展示法克隆人鼻咽上皮特异性表达的cDNA片段

本文对ｍＲＮＡ差异展示法进行了改良．利用一组随机引物与来源于ｍＲＮＡ翻译起始位点区域的引物组合进行ＲＴ－ＰＣＲ,使差异展示的片段来源于蛋白编码区,并对差异展示的条件进行了优化．应用此法对人鼻咽上皮与软腭口腔粘膜上皮的基因表达进行了比较研究,得到了１０个在鼻咽上皮特异表达的ｃＤＮＡ片段,并对其中的５个片段进行了亚克隆和序列分析．通过与ＧｅｎｅＢａｎｋ数据库中的序列进行同源性比较,确定其中两个片段为未知新序列,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实其中一个片段ＮＥＳ１为鼻咽上皮特异性表达片段．     

小鼠睾丸和卵巢特异表达基因Zfp474的克隆与特征分析

运用NCBI中的数据库消减杂交(Digital Differential Display,DDD)分析方法,从小鼠睾丸组织中分离了一个含有C2HC／C3H结构的新型锌指蛋白基因——ZIM74(GenBank登录号：AY350709)。通过推导和进一步的RT-PCR实验证实：该基因含4个外显子,gDNA在染色体上跨度29869bp,定位于小鼠染色体18D1。cDNA编码一个含347个氨基酸的新蛋白,带有C2HC／C3H结构域。Northern杂交结果显示：该基因含有2．37kb大小的唯一转录本,主要在睾丸中强表达,卵巢中有表达,而在其他组织中该基因无表达。结果提示：Zfp474基因对精于发生和卵母细胞的发育可能起重要作用。     

一个新的人类锌指蛋白基因ZNF474的cDNA克隆和表达分析

数据库消减杂交就是利用NCBI中的Unigene数据库中大量的数据资源,收集各种细胞或组织的基因表达谱进行两两比较或多重比较,获得两组文库间有统计学意义的差异表达基因。运用NCBI中的数据库消减杂交分析方法,从人睾丸组织中分离了一个含有C2H2结构的新型锌指蛋白基因-ZNF474(GenBank登录号：AY461732)．通过推导和进一步的RT—PCR实验证实：该基因含2个外显子,gDNA在染色体上跨度30065bp,定位于人染色体5q23．1-q23。2．cDNA编码一个含364个氨基酸的新蛋白,分子质量是40．3kDa,等电点为9．59。Northem杂交结果显示：该基因含有2．37kb大小的唯一转录本,主要在睾丸中很强表达,卵巢中有弱表达,而其他组织中该基因无表达．结果提示：ZNF474基因对精子发生和卵母细胞的发育可能起重要作用、     

一个新的猪肌肉组织EST的分离、定位与表达

利用mRNA差异显示技术,从猪骨骼肌组织中分离到一个新的表达序我标签（expressed sequence tag ,EST)ESThp9-1(其GenBan登录号：BI596262）,其序列长196bp,经BLAST程序与GenBank中存在的序列比对后,发现与猪的所有序列无同源性,但与大鼠的U3A核内小RNA基因及小鼠的U3B．4核内小RNA基因同源性分别为87％（93个碱基）和85％（96个碱基）。半定量RT－PCR表明,此EST在猪的多数组织中均有表达。通过体细胞杂种板（somatic cell hybrid panel,SCHP)及辐射杂种板（radiation hybrid panel,RH)分析,EST hp9-1被定位于猪的12号染色体长臂,与微卫星标记S0090连锁。根据同源性比对和物理定痊结果,推测EST hp9-1为猪的U3基因家族中一员。     

一个新的睾丸特异表达基因的克隆及功能的初步分析

运用“数据库消减杂交”(digital differential display)方法来筛选人类睾丸特异表达新基因,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群。挑选其中一个克隆重叠群HS．326528进行多组织RT—PCR,初步获得该重叠群在人睾丸中有高表达。从该重叠群的IMAGE出发,采用生物信息学的方法快速克隆了一个人类新基因的全长cDNA序列,其全长1044bp,开放阅读框为214～529bp,定位于15q26．2,编码由105个氨基酸组成、分子量为11．7kD、等电点为10．09的一个碱性蛋白,该蛋白与已知蛋白无明显的同源性,克隆实验证明该基因的阅读框完全正确,RT—PCR和Northern blot显示该基因在人类睾丸中特异表达,实时PCR结果表明：该基因在成人睾丸中高表达,在精子中有中度表达,在胚胎睾丸中低表达,推测该基因与精子的生成有关,命名为SRG8(homo sapiens spermatogenesis—related gene 8)(GenBank登录号：AY489187),该基因编码的蛋白定位于细胞核。流式结果分析表明,SRG8基因能够促使HeLa细胞由S期向G2期的转变,从而加速细胞的分裂。这些结果表明SRG8基因可能在睾丸的发育及精子的形成过程中起重要的作用。     

利用巢式PCR技术和人类基因组草图搜索法快速获得人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG2

从已获得的在隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段 (BE6 44 5 42 )入手 ,设计了基因特异性引物和载体特异性引物进行巢式PCR扩增 ,结合人类基因组草图搜索法 ,从睾丸cDNA文库中快速分离出人类睾丸凋亡相关基因TSARG2的 5′末端而获得全长cDNA ,GenBank登录号为AY0 40 2 0 4(保密期为 1年 ) ,同时应用生物信息学的方法克隆了该基因在小鼠中的同源基因 ,GenBank登录号为AF395 0 83。TSARG2基因的cDNA全长为 12 33bp ,包含 6个外显子 ,基因组跨越 115kb ,编码由 30 5个氨基酸组成的、分子量为 34 75 1的蛋白质 ,与已知蛋白质无明显同源性。查询最新的人类基因组工作草图 ,该基因定位在染色体 4q33～ 34 .1。     

表达序列标签数据库搜索鉴定小鼠UBAP1基因及其数字化表达分析

UBAP1(ubiquitin associated protein 1)基因是最近克隆的一个定位于人类染色体9p21-22鼻咽癌杂合性丢失高频区的泛肽相关蛋白家族新成员.为了深入研究UBAP1基因的功能,利用计算机对表达序列标签(expressed sequence tag, EST)、UniGene等数据库进行综合搜索分析,结合cDNA克隆测序的方法, 成功地获得了UBAP1基因在小鼠中的同源基因.小鼠UBAP1基因cDNA全长为2 676 bp,编码一个由441个氨基酸组成的蛋白质,在其蛋白质C端只有一个泛肽相关功能域（UBA domain）.与人UBAP1基因相比,两者编码的氨基酸序列有89%相同.基于EST的数字化表达分析显示UBAP1基因在小鼠正常组织中广泛高表达.     

Isolation of a Gene Greatly Expressed in Kluyveromyces Marxianus at High Temperature

Summary This research provides insight into the expression of thermotolerance-related genes in Kluyveromyces marxianus by differential display polymerase chain reaction (DD-PCR) techniques. Fourteen differential expressed sequence tags (ESTs) were observed and one of them, SHWBY10 was confirmed to be positive by reverse Northern blot analysis. The sequence has the GenBank Accession ID No. CD374838. DNA sequencing showed that it encoded a 279 bp ORF containing 92 amino acids. Analysis of protein sequence indicated that it has significant sequence homology with a peroxisomal protein product (gi 50309315) from Kluyveromyces lactis. This discovery suggests this gene may be related to yeast thermotolerance.