酿酒酵母缺陷型原生质体的形成再生及融合条件的探讨

营养缺陷型作为酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)单倍体融合亲株的遗传标记。采用营养缺陷型LY—2和LY—4菌侏的对数生长前期的细胞,在0.5％的蜗牛酶作用时间40分钟,0.7MKCl高渗稳定剂的条件下,制备原生质体。两亲株的原生质体形成率分别为98.2％和91.0％。原生质体再生率为6.12％和2.13％。两亲株的原生质体在35％聚乙二醇(PEG, M.W.6000),50mMCaCl_2下诱导融合15分钟,在基本培养基上长出营养互补的融合菌株,融合频率为4.14x10_(-4)。本文就两亲株的原生质体形成和再生条件进行了初步的探讨,并进行了原生质体融合的尝试,     

酿酒酵母和产朊假丝酵母原生质体的形成、再生及属间融合

使用由亚硝基胍诱变所得到的营养缺陷型作为单倍体融合亲株的核基因标记,同时也采用线粒体球红霉素抗性突变株的小菌落形式作为融合亲株的线粒体基因标记。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和产朊假丝酵母(Candida utilis)两亲株原生质体的制备是用对数生长早期的细胞在蜗牛酶和0.7M KCl及β-巯基乙醇或二巯基苏糖醇的作用下完成的。二者的原生质体的形成率在30—60分钟内达到90—99％。原生质体再生率,酿酒酵母最高为29—35％,产朊假丝酵母为7.5％。两亲株的原生质体在35％PEG(M.W.6,000),10mM CaCl_2条件下被诱导融合。在基础培养基上,长出以营养互补为标记的融合菌株。融合频率为10~(-5)—10~(-6)。试验表明,这些融合菌株具有杂种的性质。其中一株杂合子在同化D-木糖、纤维二糖等的能力上比亲株明显增强。     

米曲霉原生质体的营养互补融合及二倍体的诱发分离

采用1％溶壁酶加1％蜗牛酶的混合液获得的原生质体,以30％聚乙二醇(MW=6,000)、0.01M CaCl_2、0.05M Gly做为融合剂,对米曲霉进行了原生质体的营养互补融合,融合频率为0.27—0.47％。自4个菌株的4对杂交组合中获得了异核体,并分离到97株绿色融合株。二倍体的孢子经PFA和UV诱发分离后,获得了二株生长速度快、蛋白酶活性高和产孢能力强的单倍体菌株。     

米曲霉原生质体的营养互补融合及二倍体的诱发分离*

采用1％溶壁酶加1％蜗牛酶的混合液获得的原生质体,以30％聚乙二醇(MW=6,000)、0.01M CaCl_2、0.05M Gly做为融合剂,对米曲霉进行了原生质体的营养互补融合,融合频率为0.27—0.47％。自4个菌株的4对杂交组合中获得了异核体,并分离到97株绿色融合株。二倍体的孢子经PFA和UV诱发分离后,获得了二株生长速度快、蛋白酶活性高和产孢能力强的单倍体菌株。     

蛹虫草原生质体紫外诱变选育胞外多糖高产菌株

蛹虫草是重要的药食兼用两用真菌,具有较高的医用及经济价值。本文通过单因素和正交试验的方法研究了不同酶系统、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂、菌龄对蛹虫草原生质体形成的影响,并对蛹虫草原生质体进行紫外诱变,以生物量和胞外多糖产量为指标选育胞外多糖高产菌株。结果表明：在30℃、1％溶壁酶＋0．5％蜗牛酶＋0．5％纤维素酶条件下,以甘露醇为渗透压稳定剂对4日龄蛹虫草菌丝酶解2h,原生质体产量可达到9．2×10^6个/mL。从150株诱变株中筛选出1株最佳正诱变株,编号为44#,经深层培养其生物量比出发菌株提高10％,胞外多糖产量提高84．3％,继代培养10代后,遗传稳定性良好。     

酿酒酵母W5及休哈塔假丝酵母20335原生质体制备条件的确定

确定了酿酒酵母W5及休哈塔假丝酵母20335原生质体制备的最佳条件。选取不同脱壁预处理时间及不同酶解时间,对酿酒酵母W5、休哈塔假丝酵母20335进行原生质体制备和再生,比较制备率和再生率。确定脱壁预处理30 min后,以终浓度2%的蜗牛酶,30℃、100 r/min酶解处理15 min为双亲株原生质体制备的最佳条件。利用原生质体融合的方法,以酿酒酵母W5和休哈塔假丝酵母20335为亲本株,构建可以利用木糖生产生物乙醇的新型酿酒酵母融合株,该前期工作为W5、20335原生质体融合工作奠定了重要的基础,对于将木质纤维素原料转化为生物乙醇的研究具有极其重要的意义。     

果胶酶CP-85211菌株的选育及其液体发酵条件的研究

黑曲霉(Aspergillus niger) CP-831经0.03％亚硝基呱在40℃处理30分钟,获得一株高产果胶酶突变株CP-85211。该突变株发酵滤液,当以果胶为底物时,酶活力为308u／m’;当以多聚半乳糖醛酸为底物时,酶活力为842u／ml。产酶活力水平约为出发菌种的5倍。产酶最适培养基组成为：8％麦麸,2％桔皮粉和2％硫酸铵。最适培养条件为：起始pH 3．5,如℃,72小时。     

自然定居青冈幼苗的亲本分析

采用遗传排除法和似然分析法进行青冈幼苗亲本分析。共采用了５个等位酶多态位点,累积排除概率为７１．５７％。采用遗传排除法仅能为１株幼苗确定唯一的亲本,其余幼苗均有多个亲本。似然分析揭示出各轩有１或２对亲本,分析表明由成体自交形成的幼苗占４１．１８％,与种群个体间酱的概率也较大,为１７．６５％。成体之间的繁殖成功率变化较大,有９个个体的繁殖成功率为０。个体２４的繁殖成功率最大,占总的３９．４％,种群外     

BMMYA’平板-Fast blue RR顶层琼脂法高效筛选高酶活脂肪酶

建立了一种高效筛选高酶活或高产脂肪酶茵株的平板方法。该方法以华根霉（Rhizopus chinensis CCTCCM201021）脂肪酶基因proRCL在毕赤酵母中构建的基因突变文库为筛选对象,利用BMMYA’平板-Fast blue RR顶层琼脂法对其中高酶活或高产的脂肪酶突变株进行筛选,将待筛茵株接种至含有2％甲醇的BMMYA’平板上,30℃生长并诱导4～5d后,平板经脂肪酶致死温度65℃处理1h,冰浴、室温平衡后,向平板中倾入Fast blue RR顸层琼脂。2min内周围显示出明显的黑褐色的菌株为高酶活或高产突变株。该方法简便,快速,高效而且准确,筛选阳性率可达到90％。     

利用酯酶同工酶技术检测香菇双单杂交后代

选用香菇的野生株Ｑ 与栽培株苏香的四种孢子单核体进行完全亲和双单杂交,运用拮抗试验并辅以液体出菇试验初步鉴定出１２ 个杂交后代,且对杂交后代酯酶同工酶进行了检测,并以聚类分析方法分析了菌株间酯酶同工酶酶谱的结果,较直观本质地反映了杂交后代及其与亲本之间的遗传差异,表明１ —１２ 号菌株是真正的双单杂交后代,认为菌株间酯酶同工酶酶相似系数值可以作为香菇遗传育种选择亲本的辅助的遗传标记     

树状多节孢的双亲灭活原生质体融合*

以紫杉醇产生菌树状多节孢HQD33的诱发突变株UL50-6和UL40-19 为出发菌株,将收集到的出发菌株UL50-6和UL40-19的菌丝体分别用pH5.5~6.0的0.7mol/L NaCl配制的3%溶壁酶、2%蜗牛酶、1%溶菌酶组成的复合酶系,30℃恒温酶解3~5h,制备原生质体。两菌株的原生质体经纯化后分别用热和紫外线灭活,其中UL50-6的原生质体在54℃热灭活5分钟,UL40-19的原生质体在30W紫外灯下,30cm,照射85秒进行紫外灭活,双亲株的原生质体存活再生率为零。同时对融合条件进行了初步探索,以含有Ca2 和Gly的35%~40%的PEG作为融合剂,融合时间为20分钟时,融合率可以达到4.44?0-2~6.92?0-2。对融合株TPF-1与双亲株的形态学、可溶性蛋白、过氧化物同工酶进行分析,确证其为双亲株的融合子。     

大肠杆菌与绿脓杆菌原生质球融合的研究

本实验利用在细菌学分类上不属同一科的大肠杆菌与绿脓杆菌原生质球的融合方法,使二种细菌发生融合和染色体重组,并通过重组体与亲本菌株遗传标记的差异来选育新重组菌株。实验中由于绿脓杆菌原生质球形成率低,适应性强,对多数抗菌素耐药。我们利用聚蔗糖—泛影葡胺分层液将活菌体与原生质球分开。并通过热处理使未与大肠杆菌杂交的绿脓杆菌原生质球在MD_3培养基中不能复原再生。为提高细菌细胞融合率及简化融合体筛选方法提供了有效的手段。通过实验结果证明所选育的二株融合体兼有二种亲本菌种的遗传性状,说明二种细菌细胞发生了融合和染色体重组。应用细菌原生质球的融合方法,使异种细菌进行杂交重组,组建一株兼备二株细菌性状的重组体,不仅为遗传育种提供一有效方法,也为异种细菌间传递质粒提供了新手段。     

人参皂苷F1转化菌株的原生质体诱变育种

菌核青霉2246(Penicillium sclerotiorum)能够将人参皂苷Rg1转化为人参皂苷F1.以此菌为出发菌株,进行原生质体制备和再生的研究,确定原生质体的最佳形成条件:菌丝体培养24 h,用5 mg/mL溶壁酶、5mg/mL纤维素酶和5 mg/mL蜗牛酶的混合酶液进行酶解,以0.8 mol/L的KCI作为渗透压稳定剂,31℃水浴振摇2h.并对形成的原生质体进行亚硝基胍复合紫外线照射诱变,结果得到1株转化率显著提高、遗传性能稳定的诱变株( NU-1),其转化率由16.7％提高到30.5％.     

粟长蠕孢菌的异核现象及异核体核型比影响因素的研究

本试验通过23株带有遗传标记的粟长蠕孢菌突变菌株,获得生理性状及生长势不同于亲本的异核体。利用营养缺陷型标记菌株研究的结果表明,粟长蠕孢菌异核体的形成及核型成分的变化受选择压力的影响。原生质体检测结果表明,在异核菌丝体中,异核细胞占46.7%,同核细胞占53.3%。分生孢子检测结果表明,只有0.06%的分生孢子保持异核状态。     

扩展青霉原生质体的形成、再生及其影响因素

本文比较了不同酶解温度、酶解pH、菌体浓度、过滤介质、氨基酸和菌体预处理方法等因素对扩展青霉(Penicllium expansun)原生质体形成再生的影响,研究了原生质体对紫外光的敏感性以及贮存和再生活性。采用0.5％纤维素酶加0.5％蜗牛酶,对用振荡培养23小时的菌丝体经30℃保温1小时酶解,可以得到4.7×10~5/ml的原生质体悬液,原生质体再生率可达30％左右。原生质体的平均体积为207μ~3。     

黄绿木霉原生质体诱变育种研究

利用正交实验方法研究了影响黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)原生质体形成的因素,并利用紫外线、硫酸二乙酯、氯化锂几种因素复合诱变原生质体筛选高产纤维素酶菌株。影响原生质体形成的因子顺序是酶系统>菌龄>酶解时间>酶解温度,原生质体形成的最佳条件是0.5%蜗牛酶 0.5%溶菌酶 1.0%纤维素酶,菌龄为18h,酶解时间为3.0h,酶解温度为32℃;在该条件下原生质体产量可达到4.25×106个mL-1。Ca2 和PEG对提高原生质体再生率的作用明显;复合诱变后得到酶活显著提高、遗传性能稳定的诱变株T-14,其EG酶活与BG酶活分别提高了58.43%、44.48%。     

印度酸桔与飞龙枳属间体细胞杂种的胞质遗传分析

对印度酸桔（Citrus reticulata） 飞龙枳（Poncirus trifoliata）属间体细胞杂种的3棵8年生植株及其融合亲本的胞质基因组进行了CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences）和RFLP分析。用5对叶绿体和5对线粒体通用引物对（universal primer pairs）对杂种及亲本的总DNA进行PCR扩增,都没有检测到多态性,但扩增产物分别用11种限制性内切酶酶切后,发现3个有多态性的叶绿体CAPS标记和1个线粒体CAPS标记。结果表明杂种的叶绿体都来源于飞龙枳,而线粒体都来源于印度酸桔。为了证实CAPS分析结果的可靠性,用5种限制性内切酶对总DNA进行单酶切,分别与1个叶绿体探针和5个线粒体探针杂交,结果与CAPS分析一致。初步证实该组合体细胞杂种的胞质遗传组成为“印度酸桔的线粒体 飞龙枳的叶绿体”。结果表明细胞融合确实能导致细胞核、线粒体和叶绿体的重新组合,为柑桔体细胞杂种中线粒体偏向来源于悬浮亲本而叶绿体偏向来源于叶肉亲本的胞质分配现象提供了新的证据,并为通过体细胞融合技术定向转移柑桔胞质基因的品种改良思路提供了重要理论依据。     

枯草杆菌中通过细胞融合的质粒转移

在PEG存在下,枯草杆菌BD366(pUB110)菌株和G1菌株的原生质体以10~(-6)—10~(-4)的融合率发生融合。在染色体的抗药性标记、营养要求和一般细菌学特征鉴定方面,多数融合子相似于亲本G1,所不同的是质粒上的抗药性标记相同于另一亲本菌株BD366,并且在高渗培养基上具有独特的菌落形态。融合子的以上一些特征极为稳定。高温能使质粒pUB110消除,质粒消除后融合子的菌落形态转变成为亲本G1的形态特征。我们认为双亲细胞融合后没有发生遗传重组,而是在分裂过程中发生分离,于是质粒pUB110可能出现在G1细胞中,因此本文为通过细胞融合的质粒转移和由于某一特定质粒的存在而改变菌落形态提供了初步证据。     

特异腐质霉纤维素酶的研究

由腐植土中分离到一株嗜热真菌,经鉴定为特异腐质霉(Humicola insolens Cooney etEmerson)。研究了这株菌纤维素酶的产生条件和一般性质。菌在含麦麸5％、NaNO0.3％的液体培养基(灭菌前pH7.5,灭菌后pH7.2)中,于45℃培养4天,以羧甲基纤维素钠为底物,每ml滤液酶活力为20个单位。酶作用的最适条件为:pH6.0,温度为65—70℃。该纤维素酶是一种耐热酶,热稳定性较强,70℃保温5分钟后,酶活力剩余88％。底物对该酶的热钝化有较强的保护作用,无底物存在条件下,70℃保温6小时后,酶活力仅剩余1％,而在同样的处理温度和时间,在有底物存在条件下,酶活力可剩余30％。该酶在45℃保温15小时的条件下,pH稳定范围为6.0—9.0。     

BMMYA' plate -Fast blue RR top agar —— an efficient plate screening method for lipase with high enzyme activity

建立了一种高效筛选高酶活或高产脂肪酶菌株的平板方法.该方法以华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶基因proRCL在毕赤酵母中构建的基因突变文库为筛选对象,利用BMMYA’平板-Fast blue RR顶层琼脂法对其中高酶活或高产的脂肪酶突变株进行筛选,将待筛菌株接种至含有2％甲醇的BMMYA’平板上,30℃生长并诱导4～5d后,平板经脂肪酶致死温度65℃处理1h,冰浴、室温平衡后,向平板中倾入Fast blue RR顶层琼脂.2 min内周围显示出明显的黑褐色的菌株为高酶活或高产突变株.该方法简便,快速,高效而且准确,筛选阳性率可达到90％.