质粒研究与载体构建

920410可在蓝燕株系PCC7120中分析启动子的载体〔英〕/Tang,J.D.…了J.Baeteriol一1901,i了3 (s)一2729~2731〔译自DBA,1991,10(12),91一06654〕 构建了启动子探测载体pJL3,它含有一个多克隆位点、cat基因(不带启动子)以及转录终止子。经接合将其从大肠杆菌转移至Aoaba‘。a“P.PCC7iZo中。新质粒的成分来源于:质粒pRL25C (含大肠杆菌和兰藻复制子)、新霉素杭性标记、bom接合转移区、质粒pDUI(从丝态兰细菌分离到)以及pBR322的序列。描述了该载体质粒的详细构建过程。Aoaba。:a psbB基因编码光合系统n中的一种分子量47000的叶绿…     

CYP7A1基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体构建

目的:克隆细胞色素P450 7A1(CYP7A1)基因启动子,构建以CYP7A1基因启动子为启动序列的双萤光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究CYP7A1基因转录调控提供有效筛选工具。方法:采用PCR方法克隆CYP7A1基因启动子序列,连接到pUC57载体中,双酶切后连接至萤光素酶报告质粒pGL3-Basic上,构建重组萤光素酶报告质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc。结果:重组质粒经双酶切和测序,证实构建正确;pGL3-CYP7A1-promoter-luc质粒2、3转染HepG2细胞均具有显著性启动子活性,pGL3-CYP7A1-promoter-luc2转染24和48 h后经检测分别为对照组(pGL3-basic空载体)的13.1±2.8倍(P0.001)和23.3±2.9倍(P0.001);pGL3-CYP7A1-promoter-luc3转染24、48 h后,荧光响应值分别是对照组的8.4±1.6倍(P0.001)和22.1±1.9倍(P0.01),呈现强启动子活性。结论:构建了CYP7A1基因启动子萤光素酶报告基因重组质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc,为后续深入研究药物对其调控作用机制奠定了基础。     

低温菌启动子分析及异源蛋白高效表达

在已构建的能在低温菌和E. coli中正常复制的启动子探针质粒的基础上, 筛选到了强启动子, 通过RT-PCR评估了启动子活性, 并通过引物延伸实验确定了转录起始位点和启动子核心序列。利用其中最强的启动子构建了低温蛋白表达质粒, 使一个热不稳定a-淀粉酶在低温下(7℃)得到了高效表达, 表达量达胞外总蛋白的35%。显示出该表达系统具有高效表达热不稳定蛋白质的潜在应用价值。     

低温菌启动子分析及异源蛋白高效表达

在已构建的能在低温菌和E. coli中正常复制的启动子探针质粒的基础上, 筛选到了强启动子, 通过RT-PCR评估了启动子活性, 并通过引物延伸实验确定了转录起始位点和启动子核心序列。利用其中最强的启动子构建了低温蛋白表达质粒, 使一个热不稳定a-淀粉酶在低温下(7℃)得到了高效表达, 表达量达胞外总蛋白的35%。显示出该表达系统具有高效表达热不稳定蛋白质的潜在应用价值。     

HPV16重组减毒沙门氏菌表达质粒的构建及其诱导免疫

将人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16 L1E7基因插入携带霍乱毒素基因的pET-CTA2B载体,获得HPV16L1E7与CTA2B融合表达质粒pET-L1E7CTA2B.在此基础上,通过PCR基因克隆技术,将pET载体的T7启动子与pTETnir15载体的大肠杆菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB进行分割重组,将nirB启动子的厌氧调控元件和启动子基本元件FNR-TATA盒与T7启动子的核糖体结合位点(SD)序列融合,形成nirB-T7杂合启动子.最后获得HPV16重组减毒沙门氏细菌疫苗表达载体pNir-16L1E7CTA2B,并进一步构建对照质粒pNir-16L1E7.Western blot结果证实以上质粒nirB-T7杂合启动子能够在沙门氏细菌中表达L1E7融合蛋白.口服免疫接种小鼠可成功诱导小鼠生殖道产生HPV16特异性粘膜免疫,且霍乱毒素CTA2B可以增强粘膜免疫诱导能力,为开发廉价有效的HPV16预防性疫苗打下了基础.     

CMV与T7启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较

构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和T7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV。将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-)。用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能。将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR T7/5细胞(稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救;但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用。为了进一步了解CMV与T7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或T7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMV-miniSeV-Gluc(-)和pT7-miniSeV-Gluc(-)。将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR T7/5细胞,结果pT7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显。本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了T7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用。本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础。     

HPV16重组减毒沙门氏菌表达质粒的构建及其诱导免疫

将人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16 L1E7基因插入携带霍乱毒素基因的pET CTA2B载体,获得HPV16L1E7与CTA2B融合表达质粒pET L1E7CTA2B。在此基础上,通过PCR基因克隆技术,将pET载体的T7启动子与pTETnir15载体的大肠杆菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB进行分割重组,将nirB启动子的厌氧调控元件和启动子基本元件FNR TATA盒与T7 启动子的核糖体结合位点(SD)序列融合,形成nirB T7 杂合启动子。最后获得HPV16重组减毒沙门氏细菌疫苗表达载体pNir 16L1E7CTA2B,并进一步构建对照质粒pNir 16L1E7。Western blot结果证实以上质粒nirB T7杂合启动子能够在沙门氏细菌中表达L1E7 融合蛋白。口服免疫接种小鼠可成功诱导小鼠生殖道产生HPV16 特异性粘膜免疫,且霍乱毒素CTA2B可以增强粘膜免疫诱导能力,为开发廉价有效的HPV16预防性疫苗打下了基础。     

基因标记、转化、表达与检测

922444 通过诱导T7 RNA聚合酶强烈抑制氯霉素乙酰转移酶的表达[英]/Kim,H.B.…∥Biotechnol.Lett.-1991,13(10).-751～754[译自DBA,1991,10(25),91-14511] 通过诱导大肠杆菌中的噬菌体T7表达系统强烈抑制氯霉素乙酰转移酶的表达。消化了质粒pYEJ001(含带有大肠杆菌核糖体结合位点序列的无启动子cat基因)和质粒pGEM3(带有T7和SP6启动子),将连接混和物导入大肠杆菌。含由T7和SP6启动子调控的cat基因的质粒分别称为pT7CAT和pSP6CAT。即使在无RNA聚合酶条件     

杆状病毒囊膜糖蛋白gp64基因启动子活性分析

GP64是杆状病毒在其发育循环第一时相所产生的芽生型病毒粒子（budded voirus,BV)的特异性囊膜糖蛋白。它在病毒入侵细胞过程中具有重要作用。为了探明杆状病毒gp64基因的表达调控。从所克隆的BmNPV和AcMNPVgp64基因ATG上游437-439bp启动子的序列分析发现。该启动子同时具有早期和晚期转录模体,将所构建的该启动子控制下荧光素酶报告基因（Luc)的非融合表达质粒分别转染Bm-N和Sf-21细胞进行瞬间表达分析,BmNPVgp64启动子能被允许宿主Bm-N细胞RNA聚合酶Ⅱ所识别,AcMNPVgp64启动子既能被允许宿主Sf-21又能被非允许宿主Bm-N细胞RNA聚合酶Ⅱ所识别,同时,这两个启动子的转录活性在各自的允许宿主细胞中被相应的病毒因子所反式激活2.4-4倍。将家吞核多角体病毒同源重复序列3（BmNPV homologous region-3,hr3)克隆到该启动子控制下的Luc报告基因下游,用所构建的质粒分别转染细胞,瞬间表达分析结果表达,BmNPVhr3能分别增强该启动子在Bm-N和Sf-21细胞中的转录活性13-22倍和7000-14000倍以上,同时,相应的病毒因子能反式激活插入了hr3的gp64启动子在各自允许宿主细胞中转录活性73-78倍,这暗示着BmNPVhr3除了具有病毒DNA复制原点和增强子的功能外,它在病毒的反式激活过程中起着重要的作用。     

利用DNA改组技术改造aacC1基因启动子活性的研究

从表达质粒pYPX251(GenBank 登陆号：AY178046)中获得aacC1基因启动子,采用DNA改组（DNA shuffling）技术在体外获得突变体。以lacZ作为报告基因,筛选获得活性明显改变的启动子。经过验证,对其中活性变化明显的7个启动子用邻硝基苯基β半乳糖苷(ONPG)作为底物进行表达活性测定。结果表明,获得的强启动子比原来的提高了3～8倍,而弱启动子则活性下降明显,其中3个几乎无活性。进一步对这7个启动子进行了序列分析。     

马立克氏病病毒pp38基因和1.8kb转录子之间双向启动子的特性研究

从马立克氏病病毒(MDV)基因组DNA复制原点区某一点,将介于MDVpp38基因和1 8kb转录子之间的双向启动子分割成两个单方向的启动子。以pp38为报告基因,pUC18质粒为载体,构建了含不同方向完整启动子序列的pProfpp38和pProrpp38质粒,以及含分割后单方向启动子序列的pdProfpp38和pdProrpp38质粒。4种质粒分别转染鸡胚成纤维细胞(Chickenembryofibroblast,CEF)后,均能检测到pp38基因的表达。进一步以氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicolacetyltransferase,CAT)为报告基因,构建了含不同方向完整双向启动子的pProfCAT和pProrCAT质粒,以及含分割后单方向启动子序列的pdProfCAT和pdProrCAT质粒。通过转染试验,定量分析了完整启动子和分割后启动子在两个方向上的启动活性。实验结果表明,分割后的启动子在两个方向上的启动活性均比相应方向上完整启动子的活性低,其中1 8kb转录子方向上的活性下降了4 1倍     

氯霉素乙酰基转移酶基因在家蚕核型多角体病毒P10基因启动子控制下的表达

昆虫核型多角体病毒(NPV)P10基因属于晚期基因,为强启动子所控制,又是病毒复制所非必需的基因。我们对前报的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)P10基因,应用PCR技术进行ATG区定点突变,在ATG被突变的同时形成一个BglⅡ酶切位点,得到一个不含ATG的BmNPV P10基因启动子。将长为230bp的经突变后的BmNPV P10基因5’端(包括启动子所有特征)片段克隆进pMMTV·CAT质粒中,构建成一个CAT基因在BmNPV P10基因启动子控制下的pBmPl0·CAT瞬间表达质粒。该质粒通过转染进入经野生型BmNPV感染的BmN细胞中,CAT得以表达。证明BmNPV P10启动子是比较强的启动子,可以在BmN细胞表达外源基因,具备了作为表达载体启动子的特性。     

苜蓿根瘤菌nodA蛋白在细胞中的定位

应用噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子表达系统,质粒pT7—6作为载体,构建了带有首蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)nod A基因的重组质粒pBF3.nod A在T7启动子的控制下,经诱导在大肠杆菌JAKE中得到表达,产物为21.5kD多肽.对nod A基因在大肠杆菌中的翻译产物(NodA)进行细胞定位分析表明,NodA同时存在于细胞质和细胞膜中.     

苜蓿根瘤菌nod A蛋白在细胞中的定位

应用噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子表达系统,质粒pT7—6作为载体,构建了带有首蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)nod A基因的重组质粒pBF3.nod A在T7启动子的控制下,经诱导在大肠杆菌JAKE中得到表达,产物为21.5kD多肽.对nod A基因在大肠杆菌中的翻译产物(NodA)进行细胞定位分析表明,NodA同时存在于细胞质和细胞膜中.     

呼吸道黏蛋白5AC基因转录表达的顺式调控元件分析

目的：探讨呼吸道黏蛋白（mucin,MUC）5AC基因5'上游序列顺式调控元件在中性粒细胞弹力酶(neutrophil elastase , NE)诱导MUC5AC基因转录表达的调控机制。方法：应用DNA重组技术,构建含萤光素酶报告基因和MUC5AC启动子不同长度片段的嵌合质粒。采用定点突变技术,在嵌合质粒的基础上构建MUC5AC启动子区特殊蛋白（specificity protein）-1和核因子(nuclear factor, NF)-κB结合位点单独突变体,并测定NE刺激的转染细胞荧光素酶相对活性。结果：成功构建了4种含有不同长度MUC5AC基因启动子序列的荧光索酶报告基因质粒。含有启动子序列-1330bp、-689bp、-324bp的嵌合质粒荧光素酶相对光强度较对照组均显著增加,而含有启动子序列-64bp的嵌合质粒荧光素酶相对光强度与对照组相比差异无统计学意义。NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU）荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导Sp-l结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU）荧光素酶表达增加。结论：MUC5AC 5'上游序列中-324～-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件Sp-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用,该位点可能作为靶向性基因治疗的关键调控元件。     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Small interfering RNA,siRNA)载体的前体。依据文献提供的扩增H1RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增HIRNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1。另外将H1RNA启动子插入pGEM．1lfz相应位点,构建瞬时表达载体pGHl。依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体。将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP．N3共转染Bel．7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应。研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究。     

链霉菌启动子的研究Ⅰ.灰色链霉菌启动子在大肠杆菌中的克隆和表达

灰色链霉菌(streptomyces griseus)No.45是链霉素产生菌,用于工业规模的链霉素生产,其启动子结构及基因表达的调控尚未揭示。本文报道了S.riseus启动子在大肠杆菌(Escherichia coil)中的克隆和表达,证实了S.griseus中也存在E.coli类型的启动子。我们已将S.griseus DNA的PstⅠ、BglⅡ酶切片段克隆到启动子探测质粒pGA46上,在大肠杆菌中表达四环素抗性基因启动子的功能。S.griseus DNA的Hin dⅢ酶切片段也已经克隆到另一个启动子探测质粒pPV33-H上,在E.coli中表达四环素抗性基因启动子的功能。为了进一步验证和分析,将重组质粒和载体以限制性内切酶酶切,从电泳图谱中可以重新找到共同的载体区带。以DNA分子杂交的方法进行DNA同源性分析,结果表明载体pGA46或pPV33-H和S.griseus DNA没有可察觉的杂交区带,而重组质粒和S.griseus DNA及载体均有明显的杂交区带。这说明重组质粒中的外源插入序列确是来自S.griseus,这些DNA片段携带了四环素抗性基因的启动子。为了进一步分析启动子功能区域的结构,已将重组质粒No.8中4.24kb的S.griseus插入序列缩短到1.89kb。插入序列的继续缩小正在进行中。     

T7启动子在哺乳类动物细胞中启动外源基因表达的研究

人低密度脂蛋白（LDL）受体基因cDNA和氯霉素已酞转移酶基因（CAT）及PolyA信号序列被克隆进pGEM4载体的T7噬茵体启动子下游,构建成质粒pT7LDLR和pT7CAT．两个重组质粒转化CHO细胞．PCR和CAT酶实验显示：两个基因被T7噬菌体启动子所启动．结果证实真核生物RNA聚合酶能够识别T7启动子,转录外源基因．常用的含有T7启动子的质粒可同时作为原核生物和真核生物的表达载体．     

动物遗传工程

921940大鼠生长激紊基因微注射到斑马鱼卵里以生产转基因斑马鱼〔英〕/Pandian,T.J.…泌Curr.Sei一1991,60一9~10〔译自DBA,1991,10(22),91一13024〕 将质粒pMGH(15ng DNA/时)(含有与大鼠生长激素基因融合的小鼠金属硫因启动子)微注射到斑马鱼尚未分裂的受精卵(1266个)里。注射一天后胚胎平均存活率为46%,但变动范围为16~72%。利用标记质粒作探针通过Slot一blot和Sou-thern印迹杂交分析了从推定转基因鱼提取出的基因组DNA。杂交图谱显示发生了基因组、染色体外、以及嵌合整合。继续存在于Fl和FZ代里的染色体外DNA浓度逐步降低。F…     

小鼠pre-miRNA-122启动子荧光素酶报告质粒的构建及表达调控

[目的]构建小鼠pre-miRNA-122基因启动子荧光素酶报告质粒,研究血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)对miRNA-122表达的影响。[方法]利用生物信息学分析pre-miRNA-122启动子片段并扩增,插入pGL3-basic载体中获得报告质粒pmir-122-luc。将pmir-122-luc转染小鼠Huh-7和HepG2细胞,24h后检测荧光素酶活性;同样将其转染小鼠肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs),PDGF处理12h后检测活性。[结果]pre-miRNA-122上游5.5~4.5 kb为启动子区域。构建的质粒经酶切、测序鉴定正确。pmir-122-luc荧光素酶活性较pGL3-basic显著增加,且在Huh-7细胞高表达(24±5.02倍)而在HepG2细胞低表达(1.8±0.34倍)。pmir-122-luc能在HSCs中表达,且PDGF处理后活性降低(P0.05)。[结论]小鼠pre-miRNA-122启动子荧光素酶活性报告质粒构建成功;PDGF抑制miRNA-122在HSCs中表达,为探索miRNA-122的表达调控机制提供了新的窗口。