鸡白痢沙门菌S06004株致病岛-2缺失株的构建及其生物学特性

摘要:【目的】了解致病岛-2(Salmonella Pathogenicity Island 2,SPI-2)对鸡白痢沙门菌致病性的影响,初步探讨研制安全有效的鸡白痢沙门菌减毒株的可行性。【方法】采用λ-red 同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的SPI-2(约40 kb)缺失株S06004ΔSPI2。并与野生型相比较,对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和致病性等基本生物学特性进行鉴定。【结果】成功构建SPI-2缺失株S06004ΔSPI2,SPI-2的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,其对2日龄雏鸡的LD50是野生株的252 倍。【结论】SPI-2的缺失引起鸡白痢沙门菌毒力的明显下降,这为进一步研究鸡白痢沙门菌SPI-2的功能及制备减毒疫苗奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌VI型分泌系统效应因子Rhs生物学特性分析

【背景】细菌的Ⅵ型分泌系统作为杀死真核捕食者或原核竞争对手的“武器”,其杀伤作用是通过释放有毒物质即效应因子来实现。尽管已发现一些效应因子,但大多数效应因子的功能仍然未知。【目的】研究rhs基因编码的效应因子Rhs对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响。【方法】利用Red同源重组的方法构建鼠伤寒沙门菌rhs基因缺失株及相应的基因回补株。通过试验分析比较亲本株与缺失株、回补株在生化特性、生物被膜形成、耐药性、细菌间竞争、抗血清补体杀菌能力、组织载菌量及感染小鼠后炎症因子IL-18、IL-1β释放量上的差异。【结果】效应因子Rhs不影响鼠伤寒沙门菌的生化代谢、生物被膜形成、耐药性及抗血清补体杀菌能力。细菌种间竞争试验中,基因缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2和CVCC541Δrhs1-2的竞争指数(competition index,CI)值分别为0.85、0.77和0.87,毒力均被轻度致弱。体内组织载菌量试验中,CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2和CVCC541Δrhs1-2基因缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的细菌数均较亲本株明显下降(P<0.05);机体...     

非编码小RNA(sraB)调控肠炎型沙门菌的抗蛋清抑菌作用

【目的】肠炎型沙门菌是一种食源性人畜共患病病原菌,可在禽蛋中存活并传播。sRNA为新近发现的基因表达调控分子,本实验以sRNA(sraB)为对象,探索sRNA与肠炎型沙门菌在禽蛋中存活的相关性,及研究其在细菌抵抗蛋清抑菌作用中的调控功能。【方法】参考已报道的沙门菌全基因组及sraB序列,设计并扩增sraB突变用基因片段,运用Red重组系统(red recombination system)对肠炎沙门菌野生株(SE2472)sraB基因进行定点敲除,构建出sraB敲除株(SE2472ΔsraB)。分析比较sraB敲除对沙门菌在蛋清中存活的影响;另构建表达sraB的回复表达质粒pHDB3-sraB,将其转入sraB敲除株构建回复株SE2472ΔsraB-comp,以回复表达sraB,分析sraB表达对沙门菌敲除株的回复作用;并分别以野生株、敲除株及回复株研究sraB在抵抗蛋清中几种抑菌因子(如溶菌酶和卵转铁蛋白)作用中可能的调控作用。【结果】敲除株在蛋清中存活率为野生型的61%-70%,回复株相比野生型的存活率比敲除株提高10%-33%;在转铁蛋白抑菌实验中,孵育8h和24h,敲除株的存活率分别为野生型存活率的38%和23%,孵育8h回复株相比野生型的存活率比敲除株提高15%,但孵育24h回复株的存活率未见提高;在溶菌酶抑菌实验中,孵育8h和24h后,敲除株存活率分别为野生型的41%和27%,回复株相比野生型的存活率分别比敲除株提高35%和23%。【结论】通过比较sraB敲除与否,研究肠炎型沙门菌在禽蛋中的存活及对抑菌因子的抵抗作用,结果表明sraB在肠炎沙门菌抵抗蛋清抑菌作用中起着重要调控功能。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统的构建及其雏鸡免疫保护试验

摘要:【目的】为构建鼠伤寒沙门菌环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统,并对其生物学特性进行检测。【方法】以鼠伤寒沙门菌SL1344Δcya株为亲本株,利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的同源重组技术,经两步法缺失并筛选asd基因缺失株(SL1344Δcya Δasd)。将含asd基因且无抗性的pYA3493质粒电转化至缺失株SL1344ΔcyaΔasd,构建重组菌株SL1344ΔcyaΔasd (pYA3493)。【结果】试验结果表明,重组菌株SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)生化特性和生长速度与参考株SL1344相比差异较大,与亲本株SL1344Δcya基本一致,SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2 S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力。对1日龄雏鸡攻毒试验表明,SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)毒力较参考株SL1344降低了约104倍。免疫保护试验显示,1日龄雏鸡免疫SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)后第17天,利用鼠伤寒沙门菌参考株攻毒,保护率为62.5%。【结论】鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统构建成功,且具有较好的免疫保护性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定基础。     

肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD的基因敲除、表达及酶学特征

【目的】以肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD为对象,构建基因缺失株及表达纯化该蛋白,为研究其在肠炎沙门菌致病性与应激等方面的作用奠定基础。【方法】参考Gen Bank登录的肠炎沙门菌基因组序列设计用于slyD基因敲除及原核表达的特异引物,运用自杀质粒介导的同源重组技术对肠炎沙门菌C50041 slyD基因进行敲除,构建C50041ΔslyD缺失株;原核表达SlyD蛋白,通过α-糜蛋白酶耦联法对其PPIase活性进行测定;利用生物信息学相关软件,分析SlyD蛋白的氨基酸序列及功能域。【结果】PCR鉴定与测序结果证明成功构建了肠炎沙门菌C50041ΔslyD缺失株,其生长特性与野生株基本一致;SDS-PAGE及PPIase活性分析表明,获得了具有生物活性的可溶性SlyD蛋白;生物信息学分析显示SlyD蛋白由FKBP样肽脯氨酰顺反异构酶结构域、分子伴侣功能域和金属结合区域3个功能区域组成。【结论】成功获得了肠炎沙门菌C50041ΔslyD缺失株和具有PPIase活性的重组SlyD蛋白。     

牛布鲁氏菌A19突变株的构建及在BALB/c鼠中的免疫保护评估北大核心CSCD

【目的】构建牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株并免疫BALB/c鼠,初步评估了其免疫保护效果。【方法】应用PCR方法扩增A19疫苗株VirB12基因的上下游同源臂序列,构建重组质粒pBK-CMV-SacBVirB12,将该质粒电击转化至布鲁氏菌A19感受态细胞中,筛选得到布鲁氏菌疫苗株A19的VirB12基因缺失株。以A19疫苗株为参照,应用A19-ΔVirB12疫苗接种BALB/c小鼠,免疫45d后布鲁氏菌2308强毒株攻毒,攻毒15d后取BALB/c鼠的脾脏进行克脾指数测定和病理组织学检测。Western-blotting鉴定VirB12蛋白的免疫反应性。【结果】构建了牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株,小鼠免疫攻毒后15d,A19-ΔVirB12免疫组和A19免疫组的克脾指数与对照组之间有显著性差异(P<0.05)。A19免疫组与A19-ΔVirB12免疫组之间克脾指数差异不显著(P>0.05)。Western blotting实验表明VirB12蛋白具有免疫反应性。【结论】牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株与亲本株A19免疫保护性无明显差异,通过血清学方法可区分疫苗免疫与野生型牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)感染动物,具备作为标记疫苗的潜力。     

粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPL21表达不足引发细胞粘附

【目的】随机选择裂殖酵母核糖体蛋白RPL21作为研究对象,分析其表达不足对细胞的影响。【方法】通过同源臂交换的方法,敲除裂殖酵母基因组中RPL21蛋白的编码基因rpl21-1和rpl21-2,观察突变菌株rpl21-1Δ和rpl21-2Δ细胞内的核糖体合成情况以及细胞表型变化。【结果】突变菌株rpl21-1Δ和rpl21-2Δ细胞内总的rpl21(rpl21-1+rpl21-2)表达水平与野生型菌株相比分别减少了66.5%和58.7%,合成的核糖体总量较野生型菌株分别下降了62.8%和50.4%。突变菌株在YEPD液体培养基中培养时发生细胞粘附现象,而基因回补的重组菌株rpl21-1Δ/RPL21-1和rpl21-2Δ/RPL21-2突变株细胞中粘附现象消失。【结论】核糖体蛋白损伤造成核糖体合成受阻,进而引发细胞生长过程中的粘附在粟酒裂殖酵母中是普遍存在的现象。     

假定调控蛋白STM14_3514可降低鼠伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力

【目的】研究鼠伤寒沙门菌致病岛1(SPI-1)内部的假定调控蛋白STM14_3514的功能及其作用机制。【方法】以鼠伤寒沙门菌模式菌株ATCC 14028为亲本株,构建了STM14_3514基因的缺失突变体及互补菌株,通过小鼠实验、细胞侵袭实验、Western blot及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)等实验技术,深入研究了STM14_3514基因对鼠伤寒沙门菌致病过程的影响。【结果】STM14_3514突变提高了细菌对小鼠的致病能力,突变体在小鼠肠道、肝和脾中的定殖能力均增强;细胞实验揭示,突变体致病力提升主要由于STM14_3514突变能显著增强细菌对上皮细胞的侵袭力(2倍,P0.05)。q RT-PCR及Western blot分析表明,STM14_3514显著抑制SPI-1内部主要调控因子hil A及侵袭相关基因的表达。此外,STM14_3514对hil A的抑制由Hil C介导。【结论】STM14_3514是鼠伤寒沙门菌SPI-1内部的负调控因子,能通过Hil C抑制hil A及SPI-1其他入侵基因的表达,该基因的生物学意义可能与细菌进入细胞后对SPI-1的负调控相关。     

基于pDS132的基因敲除中创伤弧菌氯霉素的耐药性变化及影响

【背景】基于自杀载体的基因敲除在单基因敲除上的应用较为常见,但在多基因敲除过程中细菌耐药性的变化及对后续敲除的影响尚未明确。【目的】探究基于自杀载体pDS132的创伤弧菌vvhA与rtxA1双基因敲除株构建过程中,创伤弧菌对氯霉素耐药性的变化及对后续基因敲除的影响。【方法】基于自杀载体pDS132的同源重组法构建创伤弧菌YJ016的单基因敲除株YJ016-ΔvvhA、YJ016-ΔrtxA1和双基因敲除株YJ016-ΔvvhAΔrtxA1,记录单交换筛选时的氯霉素浓度与筛选平板上成功重组的菌株所占比例。琼脂稀释法测定野生型与敲除株的氯霉素最低抑菌浓度(Minimum InhibitoryConcentration,MIC)和抗性突变频率,纸片扩散法测定菌株对其他药物的敏感性,分析其对单交换筛选的影响。【结果】单基因敲除株的氯霉素MIC及氯霉素抗性突变频率高于野生型;双基因敲除株的庆大霉素抑菌圈直径小于野生型。单基因敲除时,单交换重组菌株的占比为100%(20/20);在YJ016-ΔvvhA上敲除rtxA1基因,氯霉素筛选浓度为2、4μg/mL时,单交换重组菌株的占比分别为40%(8/20)、5%(1/20);在YJ016-ΔrtxA1上敲除vvhA基因,氯霉素筛选浓度为2、4μg/mL时,单交换重组菌株的占比均为0%(0/20)。【结论】基于自杀载体pDS132的基因敲除中创伤弧菌氯霉素的耐药性升高,可能影响后续单交换重组的筛选,该结果为基于自杀载体的同源重组技术应用于多基因敲除提供了参考。     

铜绿假单胞菌表面(氧化)低密度脂蛋白配体的研究

【背景】研究发现铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)与(氧化)低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL/oxidized low density lipoprotein,ox LDL)具有特异性相互作用,有报道证实P. aeruginosa表达的Rah U蛋白可以与LDL/ox LDL特异性结合。【目的】验证Rah U蛋白是否是P.aeruginosa表面主要的LDL/ox LDL配体。【方法】大肠杆菌表达Rah U蛋白(r Rah U),ELISA验证r Rah U与LDL/ox LDL的相互作用。利用同源重组的方法构建RahU基因缺失突变株(ΔRahU菌株)作为阴性对照菌株,制备小鼠抗r Rah U抗体,经WesternBlot及ELISA分别检测抗r Rah U抗体与P.aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白的结合。通过ELISA方法对P. aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/ox LDL的结合差异进行比较,并对不同蛋白酶水解ΔRahU菌体表面蛋白后ΔRahU菌株与LDL/ox LDL结合能力的差异进行比较。【结果】经ELISA验证rRahU与LDL/oxLDL存在特异性结合。Western Blot及ELISA方法证实小鼠抗rRahU抗体可以与P. aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白特异性结合,而不与ΔRahU菌株相互作用。P.aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/oxLDL结合能力无显著差异,且蛋白酶水解后ΔRahU菌株与LDL/oxLDL的结合能力相近。【结论】RahU蛋白是P. aeruginosa表面的LDL/oxLDL配体之一,但不是唯一的配体。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。