提高DNA疫苗免疫效果的策略

近年来,ＤＮＡ疫苗的研究进展迅速,已在多种病毒、细菌、寄生虫病、肿瘤、过敏性疾病及免疫病理性疾病的防治研究中取得了令人鼓舞的成果,进一步提高ＤＮＡ疫苗的免疫效果是今后努力的方向。当前在这方面主要的策略有：构建真核表达载体时,选择合适的启动子;质粒基本骨架中插入免疫刺激序列（ＩＳＳ）或选择具有免疫增强作用的载体;细胞因子基因与外源基因共表达或共接种以提高外源基因编码抗原诱导的免疫反应。此外,质粒ＤＮＡ的接种剂量和途径也可影响免疫反应效果。     

口服基因疫苗质粒稳定性测定

在研究口服基因疫苗的过程中 ,为确保口服疫苗剂量 ,对转化细菌中质粒稳定性的动态变化 ,细菌浓度OD60 0 值与有效细菌 (携带质粒的细菌 )的关系等进行了测定 ,结果显示PAR3132在培养 10h前 ,pcDNA3 VP1在培养 6h前质粒在细菌中的稳定性可维持在 95 %以上 ,但当培养时间超过 16h ,2种质粒的稳定性在Amp为 5 0g/L时均不足 2 0 %。高浓度Amp可提高质粒稳定性。在质粒稳定性维持于 95 %的时段内 ,细菌浓度的OD60 0 值与有效细菌的量呈线性关系。因此 ,在确定口服基因疫苗剂量时 ,应根据细菌各自的情况决定振摇的时间和采用的OD值。     

基因疫苗--防治疾病的新武器

基因疫苗(ｇｅｎｅｖａｃｃｉｎｅ)又名ＤＮＡ疫苗(ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅ)。基因疫苗常被称作“裸”ＤＮＡ疫苗。它不含肽、蛋白质或病毒载体,只是由来源于病原体的一个抗原编码基因及作为其载体的质粒ＤＮＡ组成。这段抗原编码基因可在活体细胞中控制合成抗原蛋白,从而引起免疫反应。它所合成的抗原蛋白类似于亚单位疫苗,区别只在于基因疫苗的抗原蛋白是在免疫对象体内产生的。1990年,Ｗｏｌｆｆ等发现,对肌肉直接进行ＤＮＡ注射能够得到表达的蛋白产物,并指出,这可能为发展疫苗提供新的途径。1993年,Ｕｌｍｅｒ等将携带流感病毒核心蛋白编…     

噬热栖热菌质粒分离蛋白同系物ParBTth的表达与重组酶活性

在低拷贝质粒中,质粒分离基因位点parABS对质粒DNA的子细胞精确分离有重要意义。噬热栖热菌(Thermus thermophilus)为多倍体,其染色体上表达有一个parABS同系物,命名为parABSTth,包含parATth和parBTth两个基因,以及一个候选parSTth的DNA序列(5’-TGTTTCCCGTGAAACA-3’)。parABSTth基因位点的功能与机制尚未清楚。本研究首先在大肠杆菌Escherichia coli中克隆并表达了T. thermophilus parABSTth位点中的parBTth基因。利用Ni-IDA亲和层析方法纯化得到了重组蛋白ParBTth;经SDS-PAGE测定,该重组蛋白纯度达到了近99%,通过凝胶迁移实验(EMSA)验证了重组ParBTth蛋白的功能。结果显示,重组ParBTth能与候选parSTthDNA序列特异性相结合。因此,异源表达的重组ParBTth蛋白是具有生物学活性的。该结果也验证了候选parSTthDNA序列确实为T. thermophilus的parABSTth基因位点中特异性的parS序列。本研究为揭示多倍体细菌染色体的子细胞分离过程原理提供了一定的基础理论依据。     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

大肠杆菌Na+/H+反向运输体A基因的克隆及序列分析

为研究细菌的耐盐机理,根据细菌中存在的Na^ ／H^ 反向运输体(nhaA)的基因序列,采用PCR扩增的方法,从大肠杆菌(Escherichia coli)DHSα中克隆获得了1．1kb的DNA片段,经过核酸序列分析,发现基因片段包含了nhaA基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法,结果显示nhaA基因在多种细菌中均存在,表明nhaA基因是细菌中普遍存在的一种能够反向运输Na^ 的基因,与细菌的耐盐性有着密切的关系,在转基因提高生物耐盐性方面具有主要的应用价值。     

转移DNA

农杆菌能够将其环状质粒上的一段转移ＤＮＡ(ｔｒａｎｓｆｅｒＤＮＡ ,Ｔ ＤＮＡ)转移并整合到受体细胞的基因组中 ,并使之携带的基因在受体细胞中表达。利用这种天然载体转化系统 ,除了可以在细菌间进行接合转移外 ,还可以向真菌、放线菌等低等真核生物和许多高等植物基因组转移[1] 。利用人工构建的转移复合物可以将ＤＮＡ转运到哺乳动物的细胞核中[2 ] 。虽然不同农杆菌质粒ＤＮＡ同源性有较大差异 ,但仍有一些共有的保守区段 ,如Ｔ ＤＮＡ区、Ｖｉｒ区、质粒复制起始区、质粒接合转移毒性区等。其中Ｔ ＤＮＡ区和Ｖｉｒ区是与Ｔ ＤＮＡ…     

人Era不同结构域在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

ｅｒａ基因是 1986年在测定大肠杆菌基因组序列时发现的一个开放读框 .由于其编码的氨基酸序列与人及酵母的ＲＡＳ蛋白有部分相似之处 ,命名为Ｅ .ｃｏｌｉＲＡＳ ｌｉｋｅ(ｅｒａ)基因[1] .ｅｒａ基因广泛存在于原核生物中 ,与细胞周期和细胞分裂有关 ,是细菌生存繁殖所必需的重要基因[2 ] .在真核生物如蠕虫、小鼠和人的组织中都发现有与细菌ｅｒａ高度同源基因存在[3 ,4 ] .人ｅｒａ基因 (ｈｅｒａ)的全长ｃＤＮＡ于 1998年被克隆 ,与原核ｅｒａ基因具有很高的同源性[5] .人Ｅｒａ蛋白与大肠杆菌Ｅｒａ蛋白的氨基酸序列有 30 %相同 ,两者…     

猪瘟DNA疫苗在猪体及环境的生物安全性研究

DNA疫苗生物安全性是其走向临床所须解决的关键问题之一。以猪瘟DNA疫苗为研究对象 ,探讨了其两个方面的生物安全性问题。一方面 ,将两种不同的猪瘟DNA疫苗质粒免疫猪后 ,利用PCR技术分析了其与猪细胞基因组整合的可能性 ,结果在灵敏度为 30拷贝的检测条件下 ,未发现猪瘟DNA疫苗整合到细胞基因组 ;另一方面 ,以PCR技术检测了免疫现场环境样品 ,以分析猪瘟DNA疫苗上的E2基因、CMV启动子基因和抗性基因是否在环境细菌中发生转移和扩散。结果未发现DNA疫苗转化环境细菌的直接证据。因此认为DNA疫苗对猪体和环境是安全的。     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株ＱＤ免疫原Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行了克隆、序列分析和ＤＮＡ免疫的初步研究。ＲＴＰＣＲ扩增ＱＤ毒株的Ｓ１基因,将其５′和３′端分别进行分子修饰后插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ位点,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国ＩＢＶ毒株Ｓ１全基因核酸探针与ＱＤ毒株Ｓ１基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用ＨａｅⅢ,ＰｖｕⅡ和ＸｂａⅠ等限制酶对此流行毒株Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行了酶切分析;在测定ＱＤ毒株Ｓ１基因５′端高变区核苷酸序列并以此与ＩＢＶＭ４１,Ｈ１２０,６／８２及Ｂｅａｕｄ等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了ＱＤ株Ｓ１基因ＤＮＡ免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,ＩＢＶＳ１基因ＤＮＡ免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒（ＣＡＶ）环形基因组ＤＮＡ（全长２．３ｋｂ）的ＥｃｏＲＩ位点和ＢａｍＨＩ位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用ＰＣＲ技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的ＣＡＶ感染的ＭＤＣＣＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中,分别扩增出包含ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ分割开的病毒基因组两部分（１．５ｋｂ和０．８ｋｂ）约１．５ｋｂ和约１．２５ｋｂ的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进ｐＵＣ１８载体,获得包含ＣＡＶ全基因组序列ＤＮＡ片段的克隆质粒ｐＣＡＶ２．４。酶切分析表明,该质粒具有预期的ＢａｍＨＩ位点、ＰｓｔＩ位点、ＨｉｎｄⅢ位点,而预期的ＥｃｏＲＩ位点消失。重组质粒插入ＤＮＡ片段的两端序列分析表明,质粒ｐＣＡＶ２．４是包含ＣＡＶ全基因组序列的重组质粒,插入ＤＮＡ片段序列中的ＥｃｏＲＩ位点序列发生了一个碱基突变。     

日本血吸虫中国大陆株TPI基团的克隆及其表达产物特性

磷酸丙糖异构酶（ＴＰＩ）是血吸虫病疫苗重要的候选抗原基因之一。参考日本血吸虫已发表的ＴＰＩ ｃＤＮＡ序列,以日本血吸虫中国大陆株成虫ｍＲＮＡ为模板,用ＲＴ－ＰＣＲ法快速克隆出一大小约８００ｂｐ的ＤＮＡ片段。ＤＮＡ序列分析证实,所扩增到的ＤＮＡ片段即为日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶（ＳｊＴＰＩｃ）基因。将该基因重组到表达型质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ中,表达的ＧＳＴ融合蛋白分子量约５４ｋＤ。用谷胱甘肽琼脂     

水稻蜡质基因5'上游区中31 bp序列增强基因表达的作用

为研究水稻蜡质基因 (Wx) 5’上游区中一个与胚乳核蛋白结合的 31bp序列在基因表达中的作用 ,将一系列包含或不包含此序列的长度不同的Wx启动区与 β 葡萄糖苷酸酶基因 (GUS)编码区连接 ,构建成嵌合质粒。将这些质粒通过农杆菌介导转化水稻幼胚愈伤组织 ,并分化产生转基因植株。分别测定抗性愈伤组织中与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。结果表明含有 31bp序列的比不含此序列的Wx启动区使GUS报告基因的表达水平高出 2～ 3倍     

小鼠巢蛋白基因结构及其转录调控元件的初步鉴定

通过筛选小鼠基因组ＢＡＣ文库,得到小鼠巢蛋白基因组２３．３ｋｂ ＤＮＡ序列,其中约１５．３ｋｂ已完成测序。与小鼠ｃＤＮＡ序列比较结果表明,小鼠巢蛋白基因包含３个内含子。与大鼠及人巢蛋白基因相比,小鼠巢蛋白基因中３个内含子的位置及大小均很保守。利用神经发育的体外实验模型,检测小鼠巢蛋白基因第２个内含子对荧光素酶报告基因的调控活性。系列缺失质粒转染细胞显示,小鼠巢蛋白基因第２个内含子对报告基因的转录具     

乳酸菌载体pMG36e的应用现状

乳酸乳球菌通用表达质粒pMG36e是一个经典的人工构建的组成型表达载体,是以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成的。它包含一个强启动子,能够在多种细菌中表达外源蛋白。已用于研究细菌素作用机制,乳酸菌基因工程菌株的改造以及口服疫苗的开发等,应用领域十分广泛,已成为乳酸菌基因工程研究的重要工具质粒之一。本文主要从载体构成、基因表达与食品级载体改造等三方面的应用对其进行综述,旨在为该质粒今后研究提供资料。     

紫云英根瘤菌胞外多糖合成基因exo1的序列分析

对互补紫云英根瘤菌Ｅｘｏ－Ｎｄｖ－Ｆｉｘ－变种的２．６ｋｂＤＮＡ片段进行序列测定。分析结果表明,该片段内存在一个完整的阅读框架（ＯＲＦ）ｅｘｏ１。ｅｘｏ１编码３４０个氨基酸,为细胞质蛋白。Ｅｘｏ１蛋白序列与苜蓿根瘤菌的糖基转移酶ＥｘｏＵ有较强的同源性。利用启动子检测质粒,分析ｅｘｏ１基因的表达,发现在ｅｘｏ１基因上有两个启动子活性区段,Ｐｅｘｏ１ａ位于基因前端,Ｐｅｘｏ１ｂ位于基因中间。Ｐｅｘｏ１ａ很可能包含了ｅｘｏ１基因的启动子。     

植物线粒体DNA质料研究进展

本文列出了已发现的高等植物中的线粒体ＤＮＡ质粒,按分子形状分为线粒体环状ＤＮＡ质粒和线粒体线状ＤＮＡ质粒,环状线粒体ＤＮＡ质粒的特征是分子较小,序列中有正向／反向重复序列,ＯＲＦ一般较小。线状线粒体ＤＮＡ质粒的特征是分子较大,末端有重复序列,５’端与蛋白质共价结合,有较长的ＯＲＦ。还分别介绍了它们的复制机制、转录和起源。质粒间及质粒及核基因组、线粒体基因组、叶绿体基因组的同源性也作了介绍。最后,综     

细菌遗传学——细菌细胞的遗传结构与调控

细菌细胞的遗传结构与调控细菌细胞的全部特性 ,包括具有重要医学意义的特性如毒力、致病性以及抗生素抗性等 ,最终都是由包含在细菌细胞基因组中的遗传信息决定的。这种信息通常由构成细胞脱氧核糖核酸 (ＤＮＡ)的核苷酸碱基的特异性序列编码。ＤＮＡ中有四种常见的核苷酸碱基 :腺嘌呤、鸟嘌呤、胞密啶和胸腺密啶 ;正是排列这些碱基的线性序列决定着细胞的特性。实际上 ,在迄今所研究的所有细菌中 ,细胞所需要的大多数遗传信息均排列成单一的环状双链染色体的形式。在大肠杆菌 (Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ)中 ,染色体长约 13 0 0 μ…     

中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖基因的生理和病理意义,利用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总ＲＮＡ中扩增出肥胖基因编码区序列（ＣＤＮＡ）,定向亚克隆至ＰＵＣ１９质粒,克隆的ＯＢＣＤＮＡ不含信号肽序列并加入了亲折起始密友子ＡＴＧ〈序列分析表明,与日本报道的人ＯＢＣＤＮＡ相比,多出一个谷氨酸密码子ＣＡＧ,将ＯＢＣＤＮＡ定向克隆至原功体ＰＢＶ２２０,构建了重组ＯＢ基因表达质粒ＰＢＶ     

HPV16重组减毒沙门氏菌表达质粒的构建及其诱导免疫

将人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16 L1E7基因插入携带霍乱毒素基因的pET-CTA2B载体,获得HPV16L1E7与CTA2B融合表达质粒pET-L1E7CTA2B.在此基础上,通过PCR基因克隆技术,将pET载体的T7启动子与pTETnir15载体的大肠杆菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB进行分割重组,将nirB启动子的厌氧调控元件和启动子基本元件FNR-TATA盒与T7启动子的核糖体结合位点(SD)序列融合,形成nirB-T7杂合启动子.最后获得HPV16重组减毒沙门氏细菌疫苗表达载体pNir-16L1E7CTA2B,并进一步构建对照质粒pNir-16L1E7.Western blot结果证实以上质粒nirB-T7杂合启动子能够在沙门氏细菌中表达L1E7融合蛋白.口服免疫接种小鼠可成功诱导小鼠生殖道产生HPV16特异性粘膜免疫,且霍乱毒素CTA2B可以增强粘膜免疫诱导能力,为开发廉价有效的HPV16预防性疫苗打下了基础.