瘢痕疙瘩中TIEG1的高表达

转化生长因子-β1(TGF-β1/Smads)信号转导通路的持续激活是瘢痕疙瘩形成的重要机制.研究发现这条通路重要的负反馈调节信号分子Smad7表达明显下调,Smad2/3的磷酸化水平和蛋白质量并无明显改变.但是,Smad7下调的机制尚不清楚.采用生物信息学方法对Smad7的启动子进行分析;用RT-PCR和蛋白质印迹分别检测了正常皮肤、正常瘢痕及瘢痕疙瘩组织中的Sp1样转录因子TIEG1mRNA及蛋白质的表达水平;体外培养正常皮肤、正常瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞,检测TIEG1 mRNA及蛋白的表达水平.研究结果显示,Smad7启动子上有Sp1的位点,TIEG1 mRNA及蛋白质水平在瘢痕疙瘩组织及瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达明显高于正常瘢痕和正常皮肤(P<0.05).说明瘢痕疙瘩中TIEG1可能是Smad7下调的重要原因,有必要进一步研究TIEG1对Smad7的调控作用机制.     

原代培养过程中壳聚糖衍生物对CTCF/YB-1/C-myc和p53蛋白表达的影响

成功建立了人增生性瘢痕细胞和正常皮肤成纤维细胞的原代培养, 并利用热休克蛋白(HSP47)和成纤维细胞特异蛋白(FSP)标记物进行了鉴定。研究发现, 经过壳聚糖衍生物处理, 人增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞在培养中均出现了不同类型的蛋白表达。多功能转录因子蛋白(CTCF)在壳聚糖衍生物处理的增生性瘢痕成纤维细胞中出现表达上调; 在聚糖衍生物处理的正常皮肤成纤维细胞中数量无变化。YB-1结合蛋白在经壳聚糖处理的正常皮肤成纤维细胞与人增生性瘢痕细胞中的表达几乎无异, 但在未经壳聚糖处理的细胞中表达不同。C-MYC和P53蛋白在壳聚糖衍生物处理的增生性瘢痕纤维细胞中表达上调, 但在正常皮肤成纤维细胞中, 无论是否经过壳聚糖衍生物处理, 这两种蛋白都没有表达。上述4种蛋白在人增生性瘢痕细胞和正常皮肤成纤维细胞中表现出不同的表达方式, 这种新型壳聚糖衍生物可能在控制人增生性瘢痕细胞和正常皮肤成纤维细胞生长和增殖过程中起着重要作用。这些蛋白因子的表达机制目前还不是完全清楚, 有待于进一步研究。     

RNA干扰敲低β-catenin的表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨β-catenin对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)增殖和凋亡的影响。方法:分别采用Real-time PCR(RT-PCR)和Western blot检测正常组织和瘢痕疙瘩中β-catenin的mRNA及蛋白表达。将针对人β-catenin基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,通过RT-PCR和Western blot筛选出干扰人瘢痕成纤维细胞β-catenin基因表达的最佳siRNA。通过siRNA沉默β-catenin表达后,采用MTT法检测KFB的增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:瘢痕疙瘩成纤维细胞中β-catenin的表达较正常组织明显升高(P0.05)。通过转染β-catenin siRNA降低其表达后,成纤维细胞的增殖能力明显下降(P0.05),凋亡水平显著增高(P0.05)。结论:沉默β-catenin能够显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并促进其凋亡。     

BMSC共培养对人瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的影响

该实验探究人骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSC)能否通过旁分泌作用影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast, KF)中DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)的表达,从而影响TGF-β/Smad信号通路。培养BMSC、KF及正常人皮肤成纤维细胞(normal human skin fibroblast, NHDF),使用0.4μm微孔孔径的悬挂式细胞培养皿构建BMSC与成纤维细胞之间非接触的细胞间接共培养模型。通过免疫荧光、激光共聚焦技术、Western blot和qPCR检测各组细胞内DNMT1的表达情况。Western blot和qPCR检测TGF-β/Smad信号通路相关分子TGF-β1、Smad7的表达。在成功构建共培养模型后,利用细胞免疫荧光和激光共聚焦技术, Western blot及qPCR检测各组细胞内DNMT1的表达情况,结果显示, DNMT1在KF中高表达而在NHDF中呈低表达,共培养组KF较非共培养组DNMT1的蛋白和m RNA水平表达明显降低(P0.01)。利用Western blot, qPCR检测TGF-β/Smad信号通路相关分子的表达,结果显示较非共培养组,共培养组KF中TGF-β1在蛋白水平表达显著降低(P0.01),抑制性蛋白Smad7在m RNA水平表达增高(P0.05)。研究证实,人BMSC可能通过旁分泌作用抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞中DNMT1的表达,从而抑制TGF-β/Smad信号通路,使瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖趋于正常。     

他克莫司抑制外周血单个核细胞培养上清对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用

目的:研究他克莫司(FK506)抑制外周血单个核细胞(PBMC)培养上清对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用,探讨FK506在瘢痕疙瘩治疗中可能的的作用和机制.方法:用消化法原代培养人瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞,梯度密度离心法分离培养人PBMC.将瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞随机分组,给予PBMC培养上清处理,实验组同时给与不同浓度FK506处理.四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性,荧光实时定量PCR法检测Ⅰ型胶原表达.结果:单纯给予PBMC培养上清处理后,成纤维细胞的增殖活性与对照组相比明显增高(P＜0.01),同时给予PBMC上清和FK506时发现FK506在20 ng/ml和100 ng/ml时能够抑制PBMC上清的促增殖作用(P＜0.01),荧光实时定量PCR结果显示:单纯给予PBMC培养上清处理后,Ⅰ型胶原的表达与对照组相比明显增高(P＜0.05),给予PBMC上清和FK506后,在FK506浓度为20 ng/ml和100 ng/ml时Ⅰ型胶原表达降低(P＜0.01).结论:FK506能够抑制PBMC培养上清对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用,因此,FK506可能通过抑制PBMC的作用来达到预防和治疗瘢痕疙瘩的作用.     

载MD-CPT透明质酸纳米微乳经皮给药作用于瘢痕修复的研究

喜树碱衍生物对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖有明显的抑制作用,为提高药物利用度,提供透皮给药的治疗途径,本文采用微乳法制备了一种新的O/W型透明质酸纳米载体(HA-GMS),包载药物10,11-亚甲二氧基喜树碱(MD-CPT),制备过程中无酒精,且没有使用化学增强剂,经透射电镜和激光粒度仪分别测得HA-GMS纳米乳粒径为(177.33±27.11)nm,zeta电位为-15.6±1.7,多分散系数为0.55±0.01,纳米微乳对MD-CPT药物的包封率为(77.85±1.29)%,且稳定性良好.用MTT法检测HA-GMS对人正常细胞HSF、HUVECs的作用,细胞相对存活率为75%~95%,生物相容性良好,用HA-GMS对瘢痕疙瘩成纤维细胞培养48 h,其生长抑制率为28.2%.HA-GMS纳米乳运载的MD-CPT皮肤渗透量明显高于对照组MD-CPT乙醇溶液对皮肤的渗透量,作用4 h的累积渗透量分别为(660.72±20.54)μg/cm2和(102.73±13.81)μg/cm2,HA-GMS纳米乳明显增加了MD-CPT的透皮效率,本研究结果为透皮给药治疗瘢痕疾病提供了基础.     

TN-C与MDA-7在增生性瘢痕中表达与调控

增生性瘢痕是以皮肤损伤后成纤维细胞过度增殖为特征的一种病理改变,其发病机制尚不明确,目前没有有效的治疗方法。当皮肤组织损伤时,腱糖蛋白C(Tenascin-C,TN-C)具有多种不同的作用介导炎症和纤维化进程,并使组织有效修复。TN-C是细胞外基质中一个具有独特的六聚体结构的寡聚糖蛋白家族,TN-C一过性表达在器官形成期,在大多数成人组织不表达或表达极少。然而,在病理条件下TN-C表达增加,诸如炎症,伤口愈合和纤维化。TN-C参与胚胎形成、肿瘤发生及损伤修复过程有关,参与细胞黏附、增殖、迁徙、分化、细胞间相互作用以及细胞凋亡。黑色素瘤分化相关基因7/白介素24(MDA-7/IL-24)能选择性抑制瘢痕疙瘩中成纤维细胞的增殖,并诱导瘢痕疙瘩中成纤维细胞的凋亡,而对正常细胞无任何作用。MDA-7/IL-24很可能与瘢痕的形成有关。     

丝裂霉素C对瘢痕疙瘩成纤维细胞Cyclin D1、CDK4及P27基因表达的影响

目的探讨丝裂霉素C（Mitomycin C,MMC）对瘢痕疙瘩成纤维中Cyclin D1、CDK4及P27基因表达的影响,以阐明MMC对瘢痕疙瘩的作用机制,为瘢痕疙瘩的治疗提供理论依据。方法用不同浓度的MMC作用于体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,MTT法测量细胞增殖情况,利用半定量RT-PCR、免疫组化分析用药前后Cydin D1、CDK4及P27的mRNA和蛋白水平表达的变化。结果MMC可明显抑制体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性抑制成纤维细胞增殖;MMC作用后,使Cyclin D1和CDK4的mRNA及蛋白表达减少,P27基因的表达增加。结论MMC可能是通过调节cyclin D1／CDK4／P27细胞周期调控通路,抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖而发挥治疗瘢痕疙瘩的作用。     

RNA干扰Ｃyclin D1基因表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和G1期调控的影响

为研究siRNA干扰瘢痕疙瘩成纤维细胞cyclin D1基因表达,对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、细胞周期和G1期调控的影响,构建了靶向cyclin D1的siRNA表达质粒.利用LipofecmmineTM2000转染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,应用荧光定量PCR、RT-PCR检测cyclin D1 mRNA的干扰效果,应用MTT法、流式细胞仪检测细胞增殖和细胞周期的变化,应用免疫组织化学染色检测成纤维细胞中cyclin D1、CDK4、P16、pRb蛋白表达的影响.主要结果如F:a.靶向cyclin D1的特异性siRNA序列可以高效地抑制成纤维细胞cyclin D1基因表达,对照组与实验组在mRNA水平其表达抑制率分别为63.68%和92.83%(P<0.01);b.可以显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,改变细胞周期分布,G0/G1期细胞比例显著高于各对照组(P<0.05),细胞分裂被阻滞;c.免疫组化染色发现,转染72 h后,过表达的cyclin D1、CDK4和pRb蛋白,在瘢痕疙瘩成纤维细胞中均出现了不同程度的表达下调,而低表达的P16则呈上调表现.由上述结果可见,构建的靶向cyclin D1的RNAi表达质粒,可有效地抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞cyclin D1基因表达,通过改变Gl期相关周期蛋白的水平,影响G1/S期的进程,显著地抑制成纤维细胞的增殖.     

TN—C与MDA-7在增生性瘢痕中表达与调控

增生性瘢痕是以皮肤损伤后成纤维细胞过度增殖为特征的一种病理改变,其发病机制尚不明确,目前没有有效的治疗方法。当皮肤组织损伤时,腱糖蛋白C（Tenascin-C,TN-C）具有多种不同的作用介导炎症和纤维化进程,并使组织有效修复。TN—C是细胞外基质中一个具有独特的六聚体结构的寡聚糖蛋白家族,TN—C一过性表达在器官形成期,在大多数成人组织不表达或表达极少。然而,在病理条件下TN—C表达增加,诸如炎症,伤口愈合和纤维化。TN—C参与胚胎形成、肿瘤发生及损伤修复过程有关,参与细胞黏附、增殖、迁徙、分化、细胞间相互作用以及细胞凋亡。黑色素瘤分化相关基因7／白介素24（MDA-7／IL-24）能选择性抑制瘢痕疙瘩中成纤维细胞的增殖,并诱导瘢痕疙瘩中成纤维细胞的凋亡,而对正常细胞无任何作用。MDA-7／IL-24很可能与瘢痕的形成有关。