草鱼干扰素调节因子IRF4亚家族的表达研究

[目的]了解草鱼干扰素调节因子(IRF)的功能,为研究鱼类天然免疫系统提供理论基础。[方法]利用RTPCR技术检测草鱼(Ctenopharyngodon idella)IRF4a、IRF4b、IRF4-like、IRF8和IRF9的早期胚胎表达、组织表达以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)体内诱导表达。[结果]胚胎表达结果显示IRF4a、IRF8和IRF9分别显著表达于0 hpf、0 hpf和30 hpf(P0.05),IRF4b、IRF4-like表达变化不明显;组织表达结果显示IRF4a、IRF4b、IRF9在鳃中表达最高,IRF4-like、IRF8在脾脏中表达最高。IRF4a、IRF4b和IRF9在感染4 h后表达量显著上调(P0.05),IRF4-like在感染1 h和24 h时表达量显著上调(P0.05),IRF8在感染48 h后表达量显著上调(P0.05)。[结论]胚胎期IRF4a、IRF8存在母源表达现象,能够保护胚胎免受外界干扰,直至草鱼免疫系统完善。IRF4亚家族成员在免疫器官鳃和脾脏中高表达。IRF4a、IRF4b、IRF9和IRF4-like在GCRV病毒感染的前期和中前期发挥作用,而IRF8主要在感染的中后期发挥抗病毒的作用。     

免疫刺激诱导草鱼肿瘤坏死因子TNF-的体外表达特征研究

为了阐明免疫刺激诱导草鱼肿瘤坏死因子TNF-的体外表达特征, 克隆了草鱼TNF-的cDNA, 构建了原核表达载体pET-32-TNF-, 并在大肠杆菌DH5中表达了His6-TNF-。利用亲和层析镍柱纯化表达重组蛋白后将其作为免疫原免疫小鼠制备了抗草鱼TNF-多克隆抗体。免疫印迹实验显示, 制备的抗体能特异性识别细胞内源性TNF-。在此基础上, 分别研究了GCRV(草鱼呼肠孤病毒)感染、免疫刺激物Poly(I:C)及LPS处理下不同时间点草鱼肾细胞CIK中TNF-的表达情况, 结果表明, TNF-在草鱼肾细胞内翻译水平的表达量基本保持稳定。研究显示经典的TNF信号通路激活因子不能引起CIK细胞内TNF-蛋白水平的显著变化。     

斑马鱼IRF11基因的鉴定、亚细胞定位及表达特征

早期的研究表明IRF11是鱼类特有的IRF家族成员。查询最近解析的斑马鱼第九版基因组时,发现斑马鱼IRF1和IRF11命名出现了混乱。通过对脊椎动物IRF1和IRF11基因位点进行同线型分析表明,IRF11与IRF1是两个不同的基因,不宜命名为IRF1b和IRF1a。系统进化树分析发现,在脊椎动物中IRF11基因比IRF1起源更早;两栖类以后的脊椎动物基因组只有IRF1,没有IRF11,其中原因可能是因为基因丢失。斑马鱼IRF11与脊椎动物IRF1一样,其表达蛋白定位在细胞核中。缺失分析揭示斑马鱼IRF11的DBD有一个能引导蛋白定位进入细胞核的序列。表达分析发现poly（I:C）能诱导斑马鱼IRF11的表达,但其表达水平低于IRF1。     

草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白相互作用的研究

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是当前引起我国草鱼出血病的主要病原,其外衣壳蛋白通常在病毒的组织嗜性和细胞嗜性上发挥重要作用。本研究利用共定位、Dot-Blot技术和His-Pull Down技术,验证了草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的相互作用。将pDsRed1N1-VP7,pDsRed1N1-VP56分别与pEGFP-Fibulin-4共转染草鱼性腺细胞GCO。结果显示,病毒蛋白VP7,VP56和草鱼蛋白Fibulin-4均分布于细胞质中,两种蛋白都与Fibulin-4有部分重叠。应用Dot-Blot Overlay技术,将纯化获得的GST与GST-Fibulin-4蛋白倍比稀释杂交到PVDF膜上,经过His-VP7,His-VP56蛋白的孵育,结果表明随着杂交的蛋白量从低到高,蛋白信号由弱到强,His-VP7与His-VP56都能够吸附于GST-Fibulin-4蛋白上并发生相互作用,而不能吸附GST蛋白。利用Pull Down技术,裂解细胞表达的GFP蛋白与GFP-Fibulin-4蛋白,结合His-VP7,His-VP56的HisPur Cobalt Resin,在Elution中均能检测到GFP-Fibulin-4蛋白质,而检测不到对照蛋白质GFP,进一步证实了VP7,VP56与Fibulin-4蛋白之间的相互作用。     

草鱼干扰素调节因子5的表达研究

干扰素调节因子是在研究干扰素转录调控时发现的1。到目前为止,在哺乳动物和鸟类中共发现10种干扰素调节因子IRF-1-10。一般认为干扰素调节因子(IRF)通过调节干扰素的表达而行使其抗病毒、应激、免疫调节等功能2,3。近年来, 研究人员发现IRF在细胞凋亡、细胞周期、细胞分化、肿瘤发生中也起着重要的调节作用4-6。       

草鱼呼肠孤病毒HZ08株S4基因序列分析

草鱼呼肠孤病毒HZ08株是本实验室从患出血病草鱼体内分离到的一个新毒株,已完成部分基因序列的分析,其氨基酸序列的同源性和873株相比,仅为20%~30%之间.因序列差异较大,无法通过设计特异性引物来扩增和分析其基因序列,采用单引物扩增技术,对HZ08株S4基因进行序列分析表明:S4全长为2263 bp,最大的ORF编码717个氨基酸,推导出其表达的蛋白约为79 kDa.正如其他基因节段,基因末端也含有保守碱基序列5′(GUAAUUU…UUCAUC),3′.S4基因推导的氨基酸序列与同宿主的其他呼肠孤病毒的非结构蛋白NS1同源性最大,其次是和哺乳动物正呼肠孤病毒的非结构蛋白mu-NS以及禽呼肠孤病毒非结构蛋白NS1同源性较大,表明S4可能表达细胞骨架相关蛋白.基于S4推导出的氨基酸序列构建的系统进化树HZ08株单独作为一个分支,与同宿主的其他呼肠孤病毒亲缘关系比较近,而与其他呼肠孤病毒则相对较远.这提示HZ08株可能是多个毒株的遗传信息经长期的遗传进化而得,综合其它已知序列信息,推测HZ08株可能为呼肠孤病毒的一个新成员.     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因功能区在原核细胞中的表达

草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus)为我国分离、鉴定的第一株水生动物病毒.1983年,我国首次报道引起爆发性草鱼出血病的病原为草鱼出血病病毒[1,2],其后相继进行了系统的病毒形态学、生物学、生物化学及分子生物学特性等研究[3-8].自1979年Meyers T R等报道从水生动物中分离出第一株呼肠孤样病毒,迄今国际上已分离鉴定40余种水生呼肠孤病毒(aquareovirus).在这些分离株中,大多数毒株不能引起寄主的病理反应或仅表现出较弱的致病性.然而研究认为,GCRV为水生呼肠孤病毒中致病力最强的毒株[9].可见,以GCRV为模型,研究水生呼肠孤病毒的复制与致病机理具有一定的理论及实际意义.我们在对GCRV反应核心及体外转录研究中,已证实GCRV RNA聚合酶在病毒粒子中的存在及其位置[5];GCRV序列测定及定位结果显示,GCRV-VP2多肽为该病毒RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase RdRp)[6,7].为了探讨草鱼呼肠孤病毒的侵染与宿主的相关性及复制机制,我们首次进行了该病毒RNA聚合酶基因(GCRV-RdRp)功能区序列在原核细胞中的表达研究,并得到高效表达融合蛋白.这一结果将为该酶的活性及特性分析提供实验依据.下面报道本研究结果.     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化

草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属。序列分析表明,GCRVS2片段长为3877核苷酸,编码一个分子量为138kDa的蛋白VP2,具有RNA聚合酶性质。为进一步了解该病毒RNA聚合酶特性,本研究在对GCRV RNA聚合酶基因(GCRV—RdRp)保守区(约1．5kb)重组质粒pR／RRp高效表达的基础上,分别构建了编码GCRV RNA聚合酶保守区N端与C端部分基因的pR／RRpN及pR／RRpC重组表达载体,并在原核细胞中获得成功表达。筛选的重组表达菌株经IPTG诱导培养,得到分子量分别为98kDa、103kDa的目的表达融合蛋白。Western blot分析表明,该表达产物与兔抗GCRV—VP2血清呈阳性反应。通过ProBond柱亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的重组表达产物,并获得约90％纯的目的蛋白。上述结果为GCRV RNA聚合酶特性分析提供了依据。     

GCRV 及其细胞灭活苗对草鱼 4 种酶活性的影响

以G1组1×10^6 TCID50／mL、G2组1×10^3 TCID50／mL两种不同浓度草鱼呼肠孤病毒通过腹腔注射感染草鱼,G3组用草鱼呼肠孤病毒细胞灭活苗注射免疫草鱼,并设计对照组：用相同体积的PBS腹腔注射草鱼,分别在注射后1、2、7、14d取血清及肝脏,测定其酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、髓过氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性,通过各项酶活力变化规律来研究病毒感染及疫苗免疫对草鱼非特异性免疫功能的影响。结果表明：ACP活性,与对照组比较血清中各处理组变化不显著,肝脏中大体呈现先降低后升高的趋势;AKP活性,血清中G1组呈现先升高后降低的趋势,G2、G3组呈现持续升高的趋势,肝脏中G1、G2组均呈现先降低再升高再降低的趋势,G3组呈现先升高再降低的趋势;MPO活性,血清中G1组呈上升趋势,G2组呈先升高再下降的趋势,G3组呈现升高再降低再升高的趋势,肝脏中G1组呈现先降低再升高再降低的趋势,G2组与G3组均呈现先升高再降低的趋势;SOD活性,血清中G1组呈现先升高再降低的趋势,G2组呈现升高的趋势,G3组呈现先高再降低再升高的趋势,肝脏中G1组呈现先升高后降低的趋势,G2组呈现降低的趋势,G3组呈现先降低后升高的趋势。结果显示：MPO及SOD两种酶活性在G1、G2及G3血清中变化趋势不一,说明这两种酶活性跟刺激物浓度及种类存在一定关系。     

温度对草鱼出血病影响的初步探讨

将鱼呼肠孤病毒(FRV)感染的草鱼饲养在人工控温的水族箱内,水温在24—30℃恒温时其死亡率无显著差异(P>0.05),而在20℃和33℃恒温时死亡率则明显降低,与24℃—30℃恒温相比死亡率有非常显著差异(P<0.01)。人工感染恒温饲养期间,死亡高峰期随水温降低而推迟,缓慢改变水温能降低死亡率,在低于20℃攻毒并维持一星期左右,即使逐步升温至30℃也不会导致感染鱼的大批死亡。     

四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞感染特性比较研究

本文首次对低温保存的三株草鱼呼肠孤病毒GCRV873 、GCRV875、GCRV876与新分离的GCRV991毒株进行了细胞培养与病毒感染特性等比较研究。结果表明 ,GCRV873 、GCRV875、GCRV876在 - 30℃保存 10年后仍然具有一定的感染性 ,其滴度均在 10 2 TCID50 /mL以上 ,略低于从病鱼组织分离的GCRV991毒株的滴价。经传代培养后 ,四株GCRV的毒力逐渐升高 ,并趋于稳定 ;当感染复数 (MOI)为 0 .0 5PFU/cell时 ,测定四株GCRV的滴度均高于 10 8TCID50 /mL ,但略有差异。GCRV873 的滴度最高 ,可达到 6 .4× 10 11TCID50 /mL。连续传代的GCRV毒株在不同温度 (2 8℃、31℃、34℃、37℃、41℃ )条件下 ,均可感染CIK细胞 ;在 2 8℃时 ,感染效价最高 ,随着温度的升高 ,其感染效价逐渐降低     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化

草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属.序列分析表明,GCRV S2 片段长为3 877核苷酸,编码一个分子量为138kDa 的蛋白VP2,具有RNA聚合酶性质.为进一步了解该病毒 RNA聚合酶特性,本研究在对GCRV RNA聚合酶基因(GCRV-RdRp)保守区(约1.5kb)重组质粒pR/RRp高效表达的基础上,分别构建了编码GCRV RNA聚合酶保守区N端与C端部分基因的 pR/RRpN及pR/RRpC重组表达载体,并在原核细胞中获得成功表达.筛选的重组表达菌株经IPTG诱导培养,得到分子量分别为98kDa、103kDa的目的表达融合蛋白.Western blot分析表明,该表达产物与兔抗GCRV-VP2血清呈阳性反应.通过ProBond柱亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的重组表达产物,并获得约90%纯的目的蛋白.上述结果为GCRV RNA聚合酶特性分析提供了依据.     

四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞感染特性比较研究

本文首次对低温保存的三株草鱼呼肠孤病毒GCRV873、GCRV875、GCRV876与新分离的GCRV991毒株进行了细胞培养与病毒感染特性等比较研究.结果表明,GCRV873、GCRV875、GCRV876在-30℃保存10年后仍然具有一定的感染性,其滴度均在102TCID50/mL以上,略低于从病鱼组织分离的GCRV991毒株的滴价.经传代培养后,四株GCRV的毒力逐渐升高,并趋于稳定;当感染复数(MOI)为0.05PFU/cell时,测定四株GCRV的滴度均高于108 TCID50/mL,但略有差异.GCRV873的滴度最高,可达到6.4×1011 TCID50/mL.连续传代的GCRV毒株在不同温度(28℃、31℃、34℃、37℃、41℃)条件下,均可感染CIK细胞;在28℃时,感染效价最高,随着温度的升高,其感染效价逐渐降低.     

草鱼肾细胞电转条件的优化及草鱼呼肠孤病毒NS26蛋白的瞬时表达

本研究先以pEGFP-N1载体质粒中的绿色荧光蛋白基因为报道基因进行电转实验,优化电压、脉冲时间、质粒添加量和电击次数等电转条件,确立最佳条件。实验表明,细胞密度为1.5×107/mL时,取200μl在0.2cm电击杯中进行电击转染,电压为200V,脉冲时间为45ms,添加质粒30μg,电击1次时,转染效果最佳。提取草鱼呼肠孤病毒基因组总RNA,以其逆转录的cDNA作为扩增模板,设计特异引物扩增出GCRV非结构蛋白NS26的基因片段,重组到pEGFP-N1载体上得到重组质粒pEGFP-NS26,将其导入CIK细胞中用电转法高效表达了EGFPNS26融合蛋白。本研究为进一步研究NS26的功能奠定了基础。     

几种鱼类细胞对草鱼呼肠孤病毒敏感性的研究

比较研究了鲫鱼异倍体细胞系(CAB-80)、团头鲂尾鳍细胞系(BCC)、大鳞副泥鳅雌核发育单倍体胚胎细胞系(PHC)、草鱼胚胎细胞系(GCE)、草鱼尾鳍细胞系(CCRF-2)、草鱼肾细胞系(CCK—S4)及其四个克隆对草鱼呼肠孤病毒(CCRV)的敏感性。证实了这些细胞(PHG除外)在不同程度上对GCRV敏感,其中以GCK-84的敏感性最强。这表明,在体外培养条件下,GCRV并无严格的种族特异性。用经GCK-84传代的病毒感染草鱼种,能复制出典型的出血病症状。用GCK-84检测了病毒在GCK-84、GCRF-2、CAB-80、BCC和PHG中的滴度(TCID50/mt),其值分别为8．24,7．36,2．90,2．15和1．33。4个克隆与肾细胞系对病毒的敏感程度亦不尽相同,其滴度在6．3到9．32之间变化。上述结果对细胞工程抗病育种预示有较大的潜在意义。在电镜下可见GCRV对被感染的细胞造成了严重的破坏。病毒为平均直径58nm的球形颗粒,具有一个高度电子密度的核心,平均直径约为38nm。病毒在细胞中的分布方式有三种-即散布于细胞质中的、呈晶格状包于一膜状结构中的和整齐或不整齐地聚集在一起但无膜包裹的。     

家蚕Piwi亚家族基因的克隆、表达及进化分析

为克隆家蚕Bombyx mori Piwi亚家族蛋白基因cDNA全长序列,分析其分子特征和表达模式,探究Piwi亚家族蛋白在家蚕中的生理功能,本研究利用已知物种的Piwi亚家族蛋白搜索家蚕基因组,预测获得家蚕Piwi亚家族蛋白基因siwi1和siwi2,采用RACE技术克隆siwi1和siwi2的全长cDNA序列,利用ORFfinder、Gene-Explorer、InterPro等分析其分子特征;其次,利用已知的所有物种Piwi蛋白及其类似物Piwil构建系统发育树;最后,通过荧光定量PCR技术检测了siwi1和siwi2在丝腺、马氏管、中肠、头部、卵巢和精巢以及不同发育时期(卵、1～5龄幼虫、蛹、成虫)的表达水平,结果显示,克隆获得了siwi1 cDNA全长3 277 bp,包含部分5′UTR、完整的开放阅读框ORF和3′UTR,获得了siwi2的部分序列,其中siwi1对应BmPiwi,siwi2对应BmAgo3。系统发育结果显示,家蚕Piwi亚家族蛋白与乳草长蝽Oncopeltus fasciatus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、橘小实蝇Bactro...     

白桦Trihelix家族全基因组鉴定及抗病表达模式分析北大核心CSCD

Trihelix家族是植物中特有的一类转录因子家族,在植物生长发育、抗逆反应中具有重要的调控作用。该研究基于白桦基因组数据库,对白桦Trihelix家族基因的表达特性以及抗病功能等进行分析,为Trihelix家族成员在白桦抗病过程中的功能研究奠定基础。结果显示:(1)共筛选到白桦8个Trihelix家族成员(BpTrihelix1~BpTrihelix8),分布在6条染色体上;氨基酸分子量在35 633.96~81 871.27 Da之间,等电点在5.32~8.67之间,均为疏水性氨基酸。(2)组织特异性表达分析表明,8个家族成员在白桦根、茎、叶中均有不同程度的表达,且BpTrihelix3在根、茎、叶中的表达量均最高。(3)病原菌侵染试验结果发现,链格孢霉菌(Alternaria alternata)感染白桦植株叶片48 h和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)感染白桦幼苗根部24 h时,BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7均显著上调,其余家族基因表达量无明显变化,说明该家族基因成员中的BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7响应了病原菌的感染,推测三者在白桦抗病过程中可能发挥重要作用。     

鲫鱼囊胚细胞干扰素的诱导及部分特性

用紫外线灭活的草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导鲫鱼囊胚细胞(CAB)能产生一种高滴度的抗病毒物质.这种物质在56℃及pH 2～11稳定;对胰蛋白酶敏感;抗病毒活性受被保护细胞的密度、培养温度及保护时间的影响;不能被GCRV的特异性抗体中和;无直接杀病毒作用;抗病毒机制依赖于细胞内RNA和蛋白质的合成;在多种鱼类培养细胞中具有抑制病毒作用.这些特性与哺乳类α/β干扰素一致,是一种鲫鱼干扰素.     

草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7真核重组质粒的构建及免疫效果评价

为研究开发草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)基因疫苗, 以编码其主要衣壳蛋白VP7的序列为靶基因, 克隆构建了真核表达重组质粒 pEGFP-N1-VP7。用脂质体法将其转染真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达, 荧光显微镜观察及特异性RT-PCR检测结果表明, 成功转染并得到了高效表达。大量扩增重组菌, 提取并制备重组质粒pEGFP-N1-VP7, 肌肉注射免疫(205) g的健康草鱼, 重组质粒按0.5和5 g分为2组, 同时设5 g空载体组及对照组。免疫草鱼22d后, 检测草鱼肠、外周血、肾脏、脾脏的呼吸暴发活性及淋巴细胞的增殖反应; 免疫草鱼21d、28d、35d、42d、56d、70d、84d和98d后, 分别尾静脉采血并分离血清, 用双抗体夹心ELISA方法进行抗体水平的测定。结果表明, 构建的含VP7蛋白的核酸疫苗既可诱导草鱼的细胞免疫, 又可诱导特异性体液免疫, 具有明显的免疫应答作用。按照每尾0.5 g重组质粒的剂量免疫草鱼后35d进行攻毒, 免疫保护率达到67%, 此研究为GCRV基因疫苗的研制提供了实验资料。       

黄芪多糖免疫草鱼母本对子代IgM、C3和LSZ表达特性研究

为探究黄芪多糖免疫草鱼母本所产子代早期发育阶段体液免疫因子IgM、C3和LSZ的表达特性及代间传递效率。采用ELISA、RT-qPCR等方法分析了饲喂黄芪多糖草鱼母本血液及其子代早期发育阶段3种免疫因子的蛋白质活性及mRNA水平。结果显示,黄芪多糖免疫草鱼母本血液中IgM、C3和LSZ蛋白活性均显著高于对照组。在子代早期阶段中,3种免疫因子蛋白活性呈先下降后上升趋势,实验组IgM蛋白活性在各阶段均显著高于对照组,在卵子、5d和28d仔鱼中分别提高了2.2倍、1.7倍和1.8倍。实验组C3活性在卵子、24h胚胎分别提高了1.9倍和1.6倍。实验组LSZ活性在卵子、5d和28d仔鱼中分别提高了2.4倍、2.0倍和1.9倍;在卵子和受精卵时期3种免疫因子mRNA水平显著高于对照组。在24h胚胎至5d仔鱼没有检测到IgM和LSZ mRNA,而在14d后3种免疫因子的mRNA均呈上调表达,但Ig M和C3 mRNA水平与对照组无显著差异。GCRV攻毒后,实验组2月龄草鱼脾脏和头肾中IgM mRNA水平显著高于对照组。结果表明,黄芪多糖能够提高草鱼母本免疫能力并向子代垂直传递,在应对GCRV感染时发挥一定免疫保护作用。