基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,然而,基于dPCR的甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)绝对定量方法还未系统建立。本研究首先对微滴式dPCR的退火温度进行了梯度优化,确定了dPCR反应的最佳退火温度为64.4℃;利用FluA核酸标准品,确定了微滴式dPCR对FluA的检测范围为37.7~8.22"104拷贝/#L,检测的检出限为3.77拷贝/反应。微滴式dPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为R2=0.9988,提示该方法检测结果具有较高的可信度。用建立好的微滴式dPCR方法可对待测临床样本中的FluA进行了拷贝数定量。因此本研究建立了基于微滴式dPCR的FluA绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的测定提供了一种技术。     

数字PCR技术在核酸标准物质研制中的应用

在标准物质研制领域,生物标准物质的研制逐渐成为了研究热点,同时基于核酸的检测技术的开发与应用又推动了核酸标准物质的进程。核酸标准物质需要高级别、精准的定值方法,数字PCR作为单分子定量技术得到了广泛的应用。数字PCR是一种测定核酸分子的绝对定量方法,如微滴式数字PCR是采用油包水形成的微滴作为反应室,将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中进行扩增反应,再通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数,从而达到精确定量核酸拷贝数的目的。综述了近年来关于数字PCR及其在核酸标准物质研究领域的最新应用进展,重点综述了其在转基因检测、医疗诊断等领域的应用进展,以期为核酸标准物质的研制提供参考。     

数字PCR技术及其应用进展

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,该技术通过分液,将含有核酸模板的PCR反应体系分配到上万个反应器中进行PCR扩增,根据荧光信号的有或无,进行结果计数,通过泊松分布的统计处理,直接得出核酸的拷贝数。相比于实时荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR),dPCR不需要建立标准曲线,应用前景更广。本文对dPCR的发展历史、原理及其应用进行了综述。     

数字PCR技术及其应用进展北大核心CSCD

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,该技术通过分液,将含有核酸模板的PCR反应体系分配到上万个反应器中进行PCR扩增,根据荧光信号的有或无,进行结果计数,通过泊松分布的统计处理,直接得出核酸的拷贝数。相比于实时荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR),dPCR不需要建立标准曲线,应用前景更广。本文对dPCR的发展历史、原理及其应用进行了综述。     

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的:建立枣疯病植原体拷贝数检测实时荧光定量PCR方法,为枣疯病植原体定量检测提供技术支持。方法:构建质粒标准品,设计实时荧光PCR探针引物,优化体系,建立标准曲线,并进行重复性验证。结果:制备了枣疯病植原体标准质粒,建立了稳定的质粒标准品检测体系(R2=0.998,检测限10拷贝,定量限100拷贝)。结论:实时荧光定量PCR检测方法重复性好,可用于枣疯病植原体的拷贝数检测,为枣疯病植原体检验检测和病害防治提供了技术支持。     

寨卡病毒核酸实时荧光PCR超敏检测方法的建立

[目的]建立寨卡病毒核酸实时荧光定量PCR超敏检测方法.[方法]选取寨卡病毒基因NS5片段保守序列设计寨卡病毒特异性引物和探针,体外转录建立寨卡病毒标准品(1 ×101 ～1 ×108拷贝/μL);以寨卡病毒标准品为模板,对反应体系探针浓度、退火温度和反应时间进行优化;以标准品为模板,建立标准曲线,并确定检测灵敏度;使...     

血清E型沙眼衣原体的Real-time PCR定量分析

目的沙眼衣原体感染是最常见的性传播疾病,本文拟建立一种准确快速、标准化的感染动物组织衣原体载量检测体系。方法体外扩增感染用沙眼衣原体血清E型,克隆衣原体特异基因OMP1基因片段作为标准品,用Real time PCR法测定衣原体基因组拷贝数进行衣原体定量。结果 Real time PCR在OMP1基因片段200至2×108拷贝检测结果成线性,在模板中加入小鼠基因组未出现非特异扩增,同时未影响扩增效率。结论针对衣原体特异基因OMP1的实时定量PCR方法可以较为灵敏的特异的定量检测感染动物样本中的衣原体。     

数字PCR定量检测血浆中环状RNA方法的建立

生物标志物一直是医学领域的研究热点.目前主要以实时荧光定量PCR技术作为分子诊断的检测手段,用于大样本的核酸检测,但该技术具有限制性,会导致假阴性.作为第三代PCR的数字PCR技术,优化并提高了检测灵敏度,无需标准曲线实现绝对定量检测,大大提高了检测的精准度,尤其是对于低表达RNA的检测,显得更为出色.本研究以hsa_circ₀061276为例,利用微滴式数字PCR EvaGreen染料法对血浆中hsa_circ₀061276的拷贝数进行绝对定量地检测,成功检测出胃炎和胃癌患者血浆中hsa_circ₀061276的具体拷贝数.因此,数字PCR作为新型检测技术在临床实际应用中有较大推广价值.     

人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增技术检测人甲型H1N1流感病毒基因

建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,即环介导逆转录等温核酸扩增技术(RT-LAMP)应用于人甲型H1N1流感病毒基因检测。该技术使用对应于人甲型H1N1流感病毒HA序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下(65℃)进行核酸扩增反应1.5h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB的颜色变化做为结果判定标准并经琼脂糖凝胶电泳验证。文中利用这种技术对不同来源及亚型的流感病毒进行了特异性分析,对体外转录的人甲型H1N1流感病毒HA基因RNA的系列稀释物进行了灵敏度分析,成功检测美国CDC提供的人甲型H1N1流感病毒标准品,利用RT-LAMP和RT-PCR同时检测了30份人甲型H1N1和26份季节性流感咽拭子标本。结果显示RT-LAMP方法特异性高,灵敏度可达到60个拷贝RNA分子水平,对临床标本的检出率与常规RT-PCR法相当,利用650nm的比色分析通过标准曲线可以实现对样品的定量。因此,基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增方法可用于人甲型H1N1流感病毒感染的快速筛选,具有在基层疾病预防控制中心流感监测网络实验室和哨点医院推广和应用的潜力。     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

同时检测人多瘤病毒和巨细胞病毒PCR技术的建立及在肾移植受者中的初步应用

建立同时检测人多瘤病毒(BKV)和巨细胞病毒(CMV)载量的实时定量荧光PCR技术(FQ-PCR),并探讨其在肾移植术后感染监测中的应用。选择BKV和CMV核酸保守性序列作为靶基因,PCR扩增靶片段与质粒pcD-NA3.1(+)连接。通过测序技术对进行克隆筛选。提取质粒并采用10倍梯度稀释(5×103～107拷贝/mL)作为BKV和CMV核酸序列的标准品,并评价其灵敏度;采用对比正常人DNA、BKV阳性质控和CMV阳性质控评价其特异性;通过对标准品DNA分别进行批内和批间各20次重复实验,以其循环阈值(Ct)的变异系数(CV)评价其精密度。对480例肾移植受者外周血样本,进行FQ-PCR检测BKV和CMV DNA拷贝数,检测FK506血药浓度,并对两者进行相关性分析。重组质粒经测序检测显示含有靶BKV和CMV核酸序列。所建立的FQ-PCR方法,其最低检测下限均为5.0×103拷贝/mL的DNA标准品。正常人DNA的BKV和CMV拷贝数检测为阴性,而阳性对照能够发现荧光值显著变化,证实为针对靶DNA的特异性扩增;重复性检测显示批内差异分别为3.44%(BKV)和2.23%(CMV),批间差异分别为4.98%(BKV)和3.76%(CMV)。肾移植患者CMV感染的阳性率为27.08%(130/480),明显高于BKV的阳性率(13.33%,64/480,P<0.05),并且感染程度与免疫抑制剂FK506用量呈正相关。建立的同时检测BKV和CMV两种病毒载量的FQ-PCR方法具有快速、重复性好、灵敏的优点,可为临床监测肾移植术后病毒感染提供技术平台。     

畜禽养殖粪污中典型致病菌的三重微滴式数字PCR定量检测方法的建立北大核心CSCD

为精准、快速检测畜禽养殖粪污中典型致病微生物,减少人畜共患病的传播风险,以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌(O157:H7)和肠炎沙门氏菌3种常见致病菌为研究对象,通过筛选其特异性引物与探针、优化反应系统,建立起快速、稳定的多重微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)反应体系。通过检测不同菌株验证该体系的特异性,并确定畜禽养殖废弃物致病菌的检出限,开发出多重微滴数字PCR快速检测方法。研究结果表明,各对引物探针对目标菌株均能扩增,ddPCR体系内未出现交叉反应,检测肠炎沙门氏菌的绝对定量检测低限为0.68 copies/μL;检测金黄色葡萄球菌的绝对定量检测低限为0.79 copies/μL;检测大肠埃希氏菌的绝对定量检测低限为1.02 copies/μL。研究建立的方法可实现对畜禽养殖粪污中3种典型致病菌的高效率、高精度的检测。     

荧光定量PCR精确检测人胚胎干细胞线粒体DNA拷贝数方法的建立

建立一种精确定量人胚胎干细胞线粒体DNA拷贝数的方法。构建包含线粒体DNANDl和核单拷贝基β-globin基因序列的重组质粒作为标准品;收集无饲养层培养体系下人胚胎干细胞DNA样本,结合2个单独的Taqman探针实时荧光定量PCR对待测样本中线粒体NDl和核β-globin基因分别进行定量,从而对人胚胎干细胞线粒体DNA的含量进行了精确定量。结果提示,人胚胎干细胞线粒体DNA的平均拷贝数／细胞为1321±228。研究表明,该技术可对人胚胎干细胞线粒体DNA拷贝数进行准确的测定,为研究培养条件对人胚胎干细胞线粒体DNA拷贝数的影响及优化体外培养条件奠定了基础。     

艾本德公司捐赠PCR仪

近日．艾本德公司向上海市公共卫生临床中心捐赠一台荧光定量PCR仪。作为上海指定的防控甲型H1N1流感的定点医疗机构,上海市公共卫生临床中心应急检测和生物安全实验室凭借自身优势将承担甲型H1N1流感病毒的快速诊断,病毒分离鉴定等重要任务。根据WHO发布的甲型H1N1流感实验室检测指南以及国家疾病预防控制中心甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案,实时荧光PCR方法被用于快速有效检测新型H1N1流感病毒核酸．定量PCR仪成为不可或缺的实验设备。     

基于RNAi技术的转基因玉米逆转录数字PCR检测方法

针对基于RNAi技术的转基因玉米品系,研究并建立了一套逆转录芯片式数字PCR(dPCR)定量检测该品系玉米双链RNA的方法。研究内容主要包括RNA提取方法、引物探针设计、逆转录方法、dPCR反应条件及体系等方面的探索和优化。该方法的绝对定量限为2.5 copies/μL,RSD为12.4%;检测低浓度实际样品达21.7 copies/μL时,相对偏差为2.7%,RSD为14.6%,满足国际上转基因定量结果RSD≤25%的要求。将该方法用于基于RNAi技术转基因作物的定量检测,将为我国相关转基因作物的安全评价提供了精确可靠的技术手段。     

七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术的初步建立

由呼吸道病毒引起的疾病严重威胁着人类的生命健康，为了建立一种快速高通量的呼吸道病毒核酸检测方法，本研究将多重PCR技术同液相芯片技术结合起来，针对呼吸道合胞病毒A型和B型、乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系、甲型流感病毒H1型和H3型以及新冠病毒等常见的七种呼吸道病毒，初步建立了七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术，评价了方法的特异性、敏感性和重复性，并使用来自安徽省疾控的25份临床急性期样本核酸对方法进行验证。结果显示，建立起的基于液相芯片多重核酸检测方法可特异性识别七种目标呼吸道病毒的靶基因序列，与包括副流感病毒在内的9种非目标呼吸道病毒无交叉反应。对七种病毒核酸进行十倍稀释液相检测，其中H3、BV、RSVB可以检出10²拷贝/μL,BY、RSVA和SARS-CoV-2可以检出10³拷贝/μL，对H1的检测限为10⁴拷贝/μL。25份样本核酸检测结果与实际相符。结果表明，本研究建立的七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术具有特异性强、敏感性高、稳定性好等特点，可用于临床样本的快速检测，为呼吸道类传染病的液相...     

双重数字PCR在转基因大豆检测中的应用

利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)平台建立针对MON87705、MON87769、DP356043三种转基因大豆中外源基因的双重PCR检测方法。利用双重数字PCR方法检测特异性、定量范围等参数,优化所用引物探针组合及实验体系程序,检测外源基因与内标准基因的拷贝数。结果表明,所用引物探针组合在数字PCR方法中仅对目标大豆品系有荧光信号,具有特异性,可用于转基因大豆品系的筛选与鉴别。检测了大豆的转基因成分含量,结果与材料标准品参数基本一致,并根据结果设定定量检测限为0.5%,定性检测限为0.05%,可满足低纯度样品检测的需求。双重数字PCR体系能够准确且稳定的满足实际检测需要,在实际应用上具有良好的发展前景。