SUSD2基因干扰表达载体的构建及在A549细胞中鉴定

[目的]构建SUSD2基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,并在人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞中鉴定。[方法]设计合成SUSD2基因shRNA片段,连接到经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切的psi-m H1 shRNA载体中,构建干扰表达载体psi-m H1-SUSD2 shRNA,酶切后测序鉴定;将干扰载体psi-m H1-SUSD2 shRNA转染A549细胞,荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot法检测干扰载体的干扰效率。[结果]酶切和测序结果显示成功构建了SUSD2基因shRNA的表达载体,q-PCR和Western Blot结果显示最佳干扰载体可使SUSD2 mRNA相对表达量下调75%以上,并可明显抑制A549细胞中SUSD2蛋白的表达。[结论]成功构建了SUSD2基因干扰表达载体,并在A549细胞中有效干扰SUSD2基因的表达。     

AKT2 基因短发夹结构RNA 慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建丝/苏氨酸蛋白激酶2（AKT2）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法：利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果：成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论：成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

NIPSNAP3A短发夹RNA腺病毒载体的构建及病毒包装

目的:构建靶向NIPSNAP3A的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,干扰HEK293A细胞中NIPSNAP3A的表达。方法:设计靶向NIPSNAP3A的shRNA,插入穿梭质粒pENTRY,通过Gateway法获得腺病毒颗粒pAd-NIPSNAP3A-shRNA,转染HEK293A细胞,在细胞内包装获得腺病毒。结果:重组腺病毒载体经酶切鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能显著抑制NIPSNP3A蛋白的表达。结论:干扰HEK293A细胞NIPSNAP3A表达的shRNA重组腺病毒载体构建成功。     

shRNA慢病毒载体稳定抑制LRP16 表达的HepG2 细胞的构建及鉴定

目的:构建LRP16基因抑制表达的Hep G2稳定细胞系,鉴定其LRP16基因抑制表达的效果。方法:构建LPP-HSH008357-LVRH1GP-200短发卡RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,用该抑制表达慢病毒感染Hep G2细胞系,通过荧光筛选及药筛,获得LRP16基因稳定抑制表达细胞系;最终运用Q-PCR和Western blot鉴定该稳定细胞系中LRP16的表达。结果:构建了LRP16基因抑制表达及抑制表达对照的Hep G2稳定细胞系,并通过Q-PCR和Western blot进行了鉴定。Q-PCR结果显示相对于对照稳转株(LPP-CSHCTR001-LVRH1GP-100),抑制表达稳转株(LPP-HSH008357-7-LVRH1GP-200)LRP16基因的抑制效率是4组抑制表达细胞中效果最理想的一组,其抑制效率高达98%;Western blot结果也显示该抑制表达稳转株(LPP-HSH008357-7-LVRH1GP-200)的LRP16蛋白表达量明显低于野生型Hep G2细胞及对照稳转株(LPP-CSHCTR001-LVRH1GP-100),其结果与Q-PCR一致。结论:构建并鉴定了人LRP16基因抑制表达Hep G2稳定细胞系及其相应的对照稳转株。     

UL27、UL29基因shRNA表达载体的构建及对HSV-2的干扰效应研究

探讨Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)UL27、UL29基因联合靶向siRNA对HSV-2复制的影响。构建UL27、UL29基因的siRNA的重组表达载体并转染293细胞,通过实时荧光定量PCR技术和蛋白质印迹方法检测UL27、UL29基因的表达,终点滴定法检测细胞上清液中的各组病毒滴度,MTT法检测细胞的存活率。结果显示:(1)成功构建短发夹RNA(shRNA)重组表达载体。(2)转染后48 h,与空白组(空载体)相比,UL27 shRNA75组对UL27基因mRNA的抑制率为75.17%(P0.05),UL29 shRNA1461组对UL29基因mRNA抑制率为66.08%,具有显著性差异(P0.05)。UL27 shRNA75联合UL29 shRNA1461联合干扰组对UL27基因抑制率约为91.28%,UL29基因表达抑制率约为80.40%,与空白组比较具有显著性差异(P0.05)。(3)终点滴定法结果显示单干扰组和联合干扰组可不同程度降低上清液中的病毒感染滴度,与空白组比较差异性显著(P0.01)。(4)Western blot检测目的基因蛋白,单干扰组与联合干扰组可不同程度降低目的基因蛋白的表达,其中UL27shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组能显著抑制相应的蛋白表达水平,蛋白表达量明显减少,与单干扰组相比具有显著差异(P0.05)。(5)经MTT法检测,UL27 shRNA75、UL29 shRNA1461、UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组的细胞存活率明显提高,差异有显著意义(P0.05)。构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达载体,能在体外细胞水平上不同程度的干扰HSV-2 UL27、UL29基因表达,UL27、UL29联合干扰效率更高,抑制HSV-2在HEK293细胞中复制。     

丁酸钠至少部分通过NF-Y依赖的TXNIP表达诱导人肺癌细胞A549死亡北大核心CSCD

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂丁酸钠调节细胞分化、增殖和抑制肿瘤发生。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)通过负性调控硫氧还蛋白的活性,调控细胞内的氧化还原平衡,抑制细胞生长。本研究证明,丁酸钠可通过激活依赖于转录因子NF-Y的TXNIP表达,诱导人非小细胞肺癌细胞A549死亡。MTT法显示,5 mmol/L丁酸钠处理A549细胞72 h可显著诱导其死亡;流式细胞分析发现,其中大部分细胞以凋亡形式死亡。表达芯片分析表明,在丁酸钠处理的A549细胞中,TXNIP的mRNA水平显著提高30~50倍;实时定量PCR、免疫细胞化学和蛋白质印迹结果进一步证明,丁酸钠可显著上调TXNIP表达。荧光素酶报告基因分析证明,与对照细胞比较,丁酸钠刺激的细胞内报告酶活性可提高约10倍,提示丁酸钠可激活TXNIP启动子的转录活性。TXNIP启动子删除突变分析显示,删除NF-Y结合的DNA序列显著降低丁酸钠对TXNIP启动子的激活能力,表明NF-Y转录因子参与丁酸钠介导的TXNIP基因转录激活。为分析TXNIP在A549细胞中的定位和部分功能,在A549细胞中过表达GFP-TXNIP融合蛋白及其截短突变体融合蛋白;结果显示,野生型和保留N端1-281aa的截短突变体定位在细胞核,而删除N端1-200aa时,其定位在细胞核和细胞质,提示N端1-200aa可调节该蛋白质的定位。然而,丁酸钠刺激未发现表达的GFP-TXNIP在细胞内定位改变。以上结果表明,丁酸钠可通过激活转录因子NF-YC依赖的TXNIP激活,诱导A549细胞死亡,但不能改变TXNIP蛋白在细胞内的定位。上述结果还提示,TXNIP的N端1-200aa可能在调节TXNIP的细胞定位中发挥作用。是否丁酸钠刺激TXNIP表达导致的细胞死亡系通过改变细胞氧化压力,以及TXNIP在细胞中定位的详尽调节机制尚待进一步研究证明。     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率。方法合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSileneer载体．构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体。将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT—PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平。结果酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT—PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43．6％、47．7％和81．6％,它们的干扰效果被Western印迹所证实。结论干扰率为81．6％的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,。岜可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究。     

从功能部件看小干扰RNA表达载体的发展

RNA干扰作为转录后基因沉默的有效途径,在基因调控、功能分析及疾病防治等领域发挥重要作用。小干扰RNA表达载体的诞生实现了RNA干扰技术持续、稳定和可控性应用,是实现基因沉默的理想选择。目前干扰性小RNA表达载体虽已发展到第二代,也开发出多种商品化的产品,但依然未能很好地解决其高效、安全、可控性方面的矛盾,发展陷入了瓶颈期。因此,从载体自身角度出发,通过系统分析其功能部件的特点,纵观小RNA载体的历史渊源、发展现状、存在问题和发展方向等问题,为干扰性小RNA表达载体的优化与选择提供相关理论指导。     

人eya2基因小干扰RNA表达载体的构建及表达

目的：设计并构建人eya2（eyes absent2）基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人eya2为靶基因,以pSliencer2．1-U6 neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5Ⅸ菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Westemblot和转录活性实验检测其抑制效果。结果：重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Westemblot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论：构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。     

Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

RNA干扰技术抑制Polo-like激酶1表达对A549细胞的影响

Polo-like激酶1(Plk1)是参与细胞周期调控的重要分子,已在多种肿瘤中检测到Plk1的高表达,并发现与肿瘤细胞的增殖和预后密切关联.为明确Plk1在肺癌细胞系A549细胞增殖和周期运行中的作用,采用RNA干扰技术,构建能产生siRNA的质粒载体psiRNA-hH1-Plk1并导入A549细胞中.采用RT-PCR检测Plk1mRNA表达的变化,Western印迹检测Plk1、细胞周期蛋白B1、p53蛋白的表达变化,流式细胞术分析细胞周期变化和凋亡;免疫荧光染色检测α微管蛋白的表达.以此观察RNA干扰能否有效抑制Plk1的表达水平,以及抑制后对A549细胞生长的影响.结果表明,psiRNA-hH1-Plk1质粒能特异性地抑制Plk1基因的表达并使其活性下降,细胞周期蛋白B1及p53蛋白的表达水平升高,微管聚集障碍或形成单极的纺锤体,A549细胞增殖减慢,出现G2/M期阻滞并存在细胞凋亡.针对Plk1基因的RNA干扰有望用于肿瘤的基因治疗.     

siRNA表达载体稳定沉默肺癌A549细胞MEKK3基因的细胞株建立

目的构建人MEKK3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体并建立稳定沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株。方法设计并合成针对人MEKK3基因4个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以BamHI及Hindm酶切位点分别克隆入pSilencer4．1-CMVhygro载体,测序鉴定后以脂质体分别转染入A549细胞,Western印迹检测它们对MEKK3表达的抑制,并选择抑制效率最高的表达载体转染入A549细胞,潮霉素筛选后获得含该载体的抗性细胞克隆株,荧光实时定量PCR检测该细胞克隆株中MEKK3表达抑制。结果测序鉴定表明4个MEKK3siRNA表达载体正确无误;Western印迹结果显示对MEKK3的表达有抑制作用,其中pSilencer4．1-MEKK3siRNA2的抑制率达84％;荧光实时定量PCR结果表明,pSilencer4．1-MEKK3siRNA2可稳定沉默MEKK3mRNA的表达,有效率达83％。结论成功地构建了针对人MEKK3基因的siRNA表达载体,并成功地建立了能高效且稳定地沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株。     

玉米FAD2基因RNA干涉表达载体的构建及转化

根据已克隆的ZmFAD2基因(GenBank登陆号:DQ496227)设计引物,通过RT-PCR扩增得到120 bp的特异性基因片段作为hpRNA干涉片段。利用pUCCRNA i与pUb i.cas为中间载体,成功构建了含Ub iqu itin启动子和hpRNA i片段的干涉表达载体p1 300 UFIFN。以自主选育的高油玉米自交系幼胚为材料,诱导、继代出胚性愈伤组织,利用携带p1 300 UFIFN质粒的根癌农杆菌LBA4404对其进行遗传转化。对抗性植株进行PCR检测,共获得6株转基因阳性株。     

油茶FAD2基因的植物表达载体和RNA干扰载体构建及其功能分析

茶油是从油茶种子中提取的食用植物油,富含油酸、亚油酸以及亚麻酸等多种人体必需的不饱和脂肪酸。在植物的不饱和脂肪酸生物合成途径中,脂肪酸脱饱和酶(Fatty Acid Desaturase,FAD)有多个家族成员,可以将单不饱和脂肪酸转化成多不饱和脂肪酸,其中FAD2可以将油酸(18∶1Δ9)和棕榈油酸(16∶1Δ9)转化成亚麻酸(18∶2Δ9,11)和十六碳二烯酸(16∶2Δ9,11)。为了揭示油茶FAD2基因的功能,本研究在原有的基础上构建了这个基因的植物表达载体p BI121-Co FAD2以及RNA干扰载体p BI121-Co FAD2 RNAi,并分别对相应的拟南芥突变体和野生型植株进行了转基因研究。结果表明,同野生型相比,fad突变体中,18∶1和16∶1含量较高,18∶2和16∶2含量较低;突变体植株经过植物表达载体的转化后,脂肪酸组分得到了恢复;而野生型植株经过RNA干扰载体的转化后,18∶1和16∶1含量升高,18∶2和16∶2含量降低。由此说明,油茶FAD2基因在植物体内具有调控18∶1和16∶1转变成18∶2和16∶2的功能,对于茶油脂肪酸组分的构成起着关键的调控作用。     

Sp1基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建干扰载体pSilencer3.1-Sp1,并初步研究其对Sp1基因的干扰作用。方法：根据Sp1cDNA编码序列,设计并合成针对Sp1基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer3.1-H1neo干扰载体中,构建Sp1基因小干扰RNA（siRNA）真核表达载体pSilencer3.1-Sp1;分别将阴性对照载体pSilencer3.1与重组载体pSilencer3.1-Sp1经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Sp1基因的转录与表达水平。结果：构建了Sp1基因siRNA真核表达载体pSilencer3.1-Sp1,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果。结论：特异性siRNA能明显抑制Sp1基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Sp1的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

稳定表达外源性p16基因肺癌A549细胞株的建立及鉴定

为构建稳定表达外源性抑癌基因p16的肺癌A549细胞株,用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体（pcDNA3)。将抑癌基因p16转移入此基因缺失的人肺癌细胞株A549细胞中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞克隆,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学鉴定p16基因的表达,同时对克隆细胞分泌蛋白进行活性检测。结果显示转染p16基因的A549细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达,说明建立的p16真核表达载体能在肺肿瘤细胞中分泌表达蛋白,表达P16抑癌蛋白的A549细胞株的建立有助于研究抑癌基因p16在肺癌发生中的作用。     

RNA干扰抑制SiHaB2细胞中Bcl-2基因的表达

Bcl-2基因作为细胞凋亡的一个潜在抑制剂调节细胞的死亡,抑制恶性肿瘤细胞中Bcl-2基因的表达可促进肿瘤细胞的凋亡。采用RNA干扰技术,合成了含有21个核苷酸的小双链干扰RNA（siRNA．Bcl-2）,并构建了含有19个核苷酸基因的质粒载体（pSilencer2．1-U6-Bcl-2）,把合成的siRNA．Bcl-2和pSilencer2．1-U．Bcl-2分别转导入Bcl-2高表达的细胞株SiHaB2中,通过Western印迹检测,免疫荧光法检测及DNA梯（ladder）检测,可观察到在导入siRNA．Bcl-2和pSilencer2．1-U．Bcl-2的SiHaB2细胞被培养72h后,可以明显抑制Bcl-2蛋白的表达。     

针对核因子-kB P65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的:构建针对人核因子kB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA(shRNA)逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA(siRNA)靶向抑制NF-kB P65基因表达的作用.方法:根据shRNA设计原则,在人NF-kB P65全长序列中选取合19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER.retro.neo中,构建针对NF-kB P65基因的shRNA表达载体.经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞.分别采用RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果.结果:限制性酶切和基因测序证实针对人NF-kB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF-kB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制.结论:成功构建了NF-kB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF-kB P65的表达.     

利用RNA干扰抑制细丝蛋白A基因的表达

目的：构建细丝蛋白A（FLNa）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,并观察其对FLNa基因表达的抑制作用。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成1条针对FLNa的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV-hygro中;将重组质粒pSilencer-FLNa、pSilencer-negative（阴性对照）转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检测FLNa的表达;通过潮霉素筛选建立干扰FLNa表达的前列腺癌细胞。结果：PCR鉴定证明构建了FLNa基因RNAi载体;Western印迹表明构建的FLNa基因干扰载体能够有效地抑制FLNa基因的表达;建立了稳定干扰FLNa表达的前列腺癌C4-2细胞。结论：构建了FLNa基因RNAi载体,该载体能够有效地抑制FLNa基因的表达。